血红蛋白的提取和分离》名师教案

专题5D N A与蛋白质技术
课题5.3 血红蛋白的提取和分离
辉县市第二高级中学李艳琴一、【课题目标】
知识与能力目标
1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白。

2、说出色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。

学科素养
1、基础知识（从血液中提取和分离血红蛋白；色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理）；
2、基本技能（通过体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤，培养学生理论联系实际的能力）；
3、基本思想（通过体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神）；
4、基本活动经验（通过色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理的学习，关注学生科学态度的教育，拓展学生视野）。

二、【课题重点】
凝胶色谱法的原理和方法
三、【课题难点】
样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填
四、【教学方法】
启发式教学
五、【教学工具】
多媒体课件
六、【教学过程】
（一）引入新课
蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化合物。

对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。

所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。

怎样提取蛋白质呢？
（二）进行新课
1．基础知识
蛋白质的理化性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。

1.1凝胶色谱法（分配色谱法）：
（1）原理：（图5－13a）分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

（3）分离过程：（图5－13b）
混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子
＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

1.2缓冲溶液
（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。

（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。

1.3凝胶电泳法：
（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。

［思考］阅读教材后，填写下表：
（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

（优教提示：打开素材实验演示：琼脂糖凝胶电泳）
（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。

2．实验设计
（优教提示：打开素材实验演示：血红蛋白的提取和分离）
2.1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？
样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。

思考：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？
不是。

因为蛋白质的来源和性质不同，分离方法差别很大。

2.2选择实验材料
（1）你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？
哺乳动物血液。

因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高。

（2）请阅读教材，认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。

并思考回答下列问题：血液由和两部分组成。

血细胞中细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是。

该化合物是由和构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的基团。

2.3从红细胞中分离出血红蛋白的过程为：洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。

洗涤红细胞的目的是什么？
除去血浆蛋白的杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。

红细胞的洗涤过程为
血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水→缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色
思考：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？
防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。

思考：你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？
加入蒸馏水，用玻璃棒快速搅拌一段时间。

补充：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。

加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。

此时，红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。

怎样除去这些杂质呢？由于它们的密度不同，科学家采取了离心分离的方法：
红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000r/min×10min）→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白。

2.4如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？。

透析。

半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。

在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH＝7的磷酸缓冲液中。

思考：为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？
维持血红蛋白的正常特性。

有利于杂质分子充分地向外扩散。

总结：通过以上四个基本过程，红细胞中的血红蛋白就被提取出来。

但其中还含有其他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等）。

怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢？我们来研究蛋白质提取和分离的第二个步骤――粗分离（凝胶色谱操作）。

2.5凝胶色谱分离蛋白质包括：制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和洗脱。

根据教材图5－19，说出制作色谱柱需要的材料。

橡皮塞2个、打孔器、小刀、移液管、尼龙纱、尼龙网、玻璃管、尼龙管等。

色谱柱的制作过程：准备材料→加工橡皮塞→安装色谱柱
下面进行第二步――凝胶色谱柱的装填。

请阅读教材：
色谱柱的装填过程。

样品加入和洗脱。

其基本过程是：
调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质
至此，血红蛋白即可得到粗分离。

在整个操作过程中，应当注意以下事项：
（1）红细胞的洗涤：
洗涤次数不能过少；低速、短时离心。

（2）凝胶的预处理：
沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡
（3）色谱柱的装填：
装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。

（4）色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。

（三）课堂总结、点评
（四）实例探究
（优教提示：打开优教习题课堂训练-《血红蛋白的提取和分离》，使用互动答题卡，更快更便捷的掌握学生的知识学习情况）。

七、【课余作业】
1、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？
2、与其他真核细胞相比较，红细胞有什么特点？这对你进行蛋白质的分离和提取有什么意义？
八、【教学体会】
本课题重在让学生了解生物科学在蛋白质领域的进展，说明提取、分离高纯度的蛋白质的重要性和必要性，并学习一些蛋白质分离和提取的基本技术。

教师可以发挥学生的主动性，让学生介绍当前有关蛋白质研究的新进展，激发学生的学习兴趣，然后指出本课题的学习意义，让学生初步体会分离纯化蛋白质的过程和方法。