乙肝病毒耐药基因测序
乙肝耐药基因检测折页
耐药（拉米夫定) 耐药（阿德福韦) 耐药（以上两种药)
一次检测可以分辨两种一线药物的乙肝耐药病毒
实验流程
采血管
提取病毒DNA
芯片扫描及结果判读
PCR 扩增 杂交反应
产品特点
检测位点全：一次检测覆盖2种药，4个位点的 六种突变
通 量 高：一张芯片可完成4个样本的检测 检测时间短：完成整个实验流程仅需6小时 操 作 简 单：直接打印结果报告 灵 敏 度 高：≥1*104 拷贝/ml 特 异 性 强：采用多重套式基因特异性PCR技
术增强PCR过程的特异性 防 污 染：PCR扩增试剂中的dUTP、UNG 酶
据卫生部统计：我国慢性HBV感染者约为1.2亿，约占总人口数的10%；其中25%的慢性感染者发展成为慢性乙肝 患者。每年乙肝新发病率为107/10万人，并没有逐年递减的趋势。每年因乙肝引发疾病的患者死亡约30万例，位列传染 病致死的第一位。
慢性HBY感染者1.2亿， 占全国人口约10%
25%为慢性乙肝患者，最终 将死于与HBV有关的肝病
乙肝病毒耐药发展历程
两种一线药物的耐药累积率
拉米夫定和阿德福韦今年纳入了医保范畴， 但是这两种药在高疗效的背后却隐藏着高耐药累 积率的危险。这两种药在5年内的耐药累积率如 右图：
70% 60% 50% 40% 30% 20% 10%
0%
第一年
第二年
第三年
第四年
拉米夫定
阿德福韦
第五年
产品原理
晶芯® 乙型肝炎病毒耐药基因检测试剂盒（DNA微阵列芯片法）是一种基于微阵列芯片为载体，用于定性检测来源于 临床疑似乙型肝炎患者血清样本中的核酸的检测方法。
DNA测序线性反向探针杂交法检测HBV P基因耐药突变比较论文
DNA测序与线性反向探针杂交法检测HBV P基因耐药突变的比较【摘要】目的基于多重pcr和反向线性杂交原理，建立hbv基因分型及耐药突变检测的新方法。
方法对深圳地区的hbv进行基因分型，并对其常见耐药突变位点进行快速检测，了解其流行现状和流行规律。
结果在45份标本中dna序列测定法检测到碱基突变73个，其中与 lam相关突变24份（53.33%），与 adv 相关突变3份（6.66%），与ldt相关突变1份（2.22%），与etv相关突变1份（2.22%）；选取21份血清，其中与线性反向探针杂交检测结果一致的突变为85.71%（18/21），氨基酸位点一致为97.39%（224/230）。
结论检测hbv不同基因型与致病性及药物应答的关系，能够为研究hbv的流行病学规律提供新的方法，为hbv感染的治疗提供用药指导，从而也为hbv的感染控制提供新的诊断工具。
【关键词】慢性乙型肝炎；乙肝病毒；核苷/酸类药物；耐药性突变；dna测序；线性反向探针杂交法【中图分类号】r450【文献标识码】a【文章编号】1004-5511（2012）06-0346-02全世界大约有3.5亿乙型肝为病毒（hbv）携带者，每年约有80万人死于hbv 慢性感染所引发的重型肝炎、肝硬化和肝细胞癌等相关疾病。
乙型肝炎病毒（hbv）可在慢性持续性感染、机体免疫、压力或抗病毒治疗药物作用过程中发生变异［1］。
近年来，临床上开始广泛采用采用核苷/酸类药物治疗乙型肝炎，核苷/酸类药物方拉米夫定(lam)、阿德福韦酯(adv)、替比夫定(ldt)、恩替卡韦(etv)等简便、副作用少、能迅速抑制hbv复制。
但其耐药性问题也日益突出。
本研究采用基于巢式 pcr 的 hbv p 基因序列测定法检测慢性乙型肝炎患者血清 hbv 基因变异情况，并与线性反向探针杂交法检测结果比较，同时对新发现的若干 hbv dna 耐药突变位点进行分析。
现将实验结果报告如下。
HBV核苷类似物耐多药的检测分析
肝 炎患者发 生多药耐 药的病例 １ ，在所抽取 的患者中有男性 较好 的效果， 以在停药之后病毒 的载量会 出现反弹 的现象， ８例 所 因
患 者 １ 例 以 及 有 女 性 患 者 ７例 ． 有 患 者 的年 龄 均 在 ２ ～ ７岁 此一般情况下应对患者进行较长时间的药 物治疗 。但是， １ 所 ６６ 用药 时 之 间 ， 者 的 平 均 年 龄 在 ４ 左 右 ， 上所 统计 的 患 者 的 所 有 自 患 ４岁 以
． ４数 据 处 理 症治疗等几种方式 ． 在这众多方法中抗病毒是对慢性 乙型肝 炎进 １
行治疗 的重 中之重 。 目前国家食品药品监督管理局批 准的可以用
在本次研究过程中所得 到的所有相关数据 ， 均采用 Ｓ Ｓ ４ Ｐ Ｓ１ ． ０
来对慢性 乙型肝炎 患者进行抗病 毒治疗的药物 主要有干扰 素和 统计 学数 据处 理软件进行处理分 析 ， Ｐ ００ 当 ＜． ５时 ， 我们 认为数据 核苷酸类似 物这两大类 ．干扰 素类主要包括有 普通 ＩＮｘ ２ Ｆ （ ｂ与 之间有明显的统计 学差 异。 一 聚乙二醇化 ＩＮ 一 ａ ｂ 苷ｆ 类似物 主要包 括拉米夫定 、 Ｆ ２／ ； ２ 核 酸） 阿德 ２结 果
福韦酯 、 恩替卡韦以及替 比夫定等。ＨＢ Ｖ是 Ｄ Ａ病毒 的一种 ， Ｎ 其
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
对这 １ 患者 出 院后 ３个月 进行 随访 ，１例男 性 患 者 中 ８例 １
自然 史 需 要 历 经 逆 转 录 的 一 个 阶段 ． 而 逆 转 录 酶 对 ３－ ， 切 Ｈ ｅ ｇ均呈现为 阳性结果 ， 然 ，５ 外 ＢＡ ７例女性 患者 的 ＨＢ Ａ ｅ ｇ均呈现 阴性 。
５ ８ ５ １０ ２
【 摘要】 目的 对 Ｈ Ｖ核苷类似物耐多药的检测进行分析 。方 法 随机抽取在 ２０ ～ ０ 年这对时间 内在我 院就诊慢性 乙型 Ｂ ０５ ２１ １
658例乙型肝炎患者HBV多位点耐药基因检测结果分析
Ａ ４ Ｊｃｉ ［ ］ ａ ｃ ａ ｌ ｙ ２ １ ，０ ２３ １９１８ Ｒ ２ ｅｌ Ｊ ．Ｐ ｎｒ ｔ ｏ ， ０ ０ １ （ －）：１ —２ ． ｓ ｅｏｇ
（ 稿 日期 ：０ １１－３） 收 ２ １ ２１
６ ８例 乙型 肝 炎 患者 Ｈ Ｖ多 位 点 耐 药 ５ Ｂ 基 因检测 结 果 分 析
准。其中男 ４３例 ， １５例 ， ７ 女 ８ 年龄 １ ６ （ １３ ７～ ９ ４ ．４ ４ ２ ６ ） 。均接 受过 核苷 （ ） 药 物 治疗 （ 中 － ．１ 岁 １ 酸 类 其
－
２２例有 完 整 治 疗 记 录 ） 其 中单 用 拉 米 夫 定 １５ ０ ， ３ 例 ， 用阿德 福 韦酯 ５ 单 ２例 ， 米 夫 定 和 阿德 福 韦 酯 拉
［ ］ ａｔ ｉｔｓＳ ｒ， ０ ６ ｔ （ ０ ：３ ６１８ ． Ｊ ．ＪＧ ｓｏｎｅｔ ｕｇ ２ ０ ，ｏ １ ） １７ —３ ３ ｒ
ｔａｅ ｒｔｉ ｋｎｓ ［ ］ ｍ ｒ ａ ｕｇ ００，０ ２） ２３ ｉ ｔ ｐｏ ｎ ｉａｅ Ｊ ．Ａ ｅ ｃｎｊＳ ｒ，２ １ ２０（ ：８ － ｖ ｄ ｅ ｉ
海 有 限公 司 生产 的 乙肝 病 毒 Ｈ Ｖ耐 药 突 变 检 测试 Ｂ 剂盒 。测序 用基 于 引物 延 伸 的焦 磷 酸 直 接测 序 法 。 数 据分 析采用 Ｐ Ｑ９ ＭＡ型焦磷 酸测 序仪 配套 的分 Ｓ 一６ 析软件 ， 先进 行单 核 苷 酸 多 态性 （ Ｎ ） 析 判 断 首 ＳＰ 分
ＨＢ 耐 药 基 因 检 测 ６ 例 发 生 变 异 ， 异 率 为 Ｖ 变
６６ ％ ， 中 Ｍ ０ Ｖ Ｉ ．７ 其 ２４ ／ 变异 ３例 、１０ ＋Ｍ ０ Ｖ Ｌ８ Ｍ ２４ ／
ｌ 异 ２例 、 ０ Ｖ Ｉ １０ ＋ Ｔ ８ Ｇ Ｓ Ａ Ｃ 同 变 Ｍ２ ４ ／ ＋Ｌ ８ Ｍ １４ ／ ／ ／
一亿国人都是乙肝感染者,他幸运的在美国找到了特效药
精心整理一亿国人都是乙肝感染者，他幸运的在美国找到了特效药本文非小说，而是科普文章。
患者真实资料来自“MORE Health 爱医传递”，患者名字为匿名。
1有的毛病，大家都知道不好，却不愿意放弃，比如吸烟。
中国有如果肝功能正常，就意味着还没有肝炎症状，只是乙肝病毒携带者，需要定期检查，以防肝功能损伤、肝硬化、甚至肝癌。
但是，因为齐遇准备要进行肾脏移植手术，所以就先对乙肝病毒进行了治疗，使用的药物是拉米夫定（Lamivudine）。
拉米夫定属于核苷类逆转录酶抑制剂，可以用来抑制HIV病毒的合成，同时也被批准用来治疗乙肝病毒。
2009年4月，齐遇进行了肾脏移植手术，术后肾功能正常，乙肝病毒HBV检测指标转为阴性。
2012年6月，齐遇到医院复查，发现乙肝病毒升高，病毒DNA检查结果（tenofovirdisoproxil fumarate, TDF），每天300mg，但服药后不久发现微量白蛋白尿，尿液中β2-MG也升高，意味着肾功能出现了问题。
更糟糕的是，12月的检查发现，齐遇的谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）突然分别升高到118和71，说明肾功能、肝功能都出现了问题。
一个月后，肝功能指标稍有改善，但仍然偏高。
在服用替诺福韦治疗后，乙肝病毒量倒是下降了，2016年12月检查时降到21,999 IU/mL, 2017年1月继续降到检查时降到3640 IU/mL。
耐药的现象。
在这种情况下，更换为替诺福韦治疗是合适的，但是因为齐遇出现了微蛋白尿，确实需要担心药物对肾脏的不良反应。
TAF属于替诺福韦的前体药，在体内稳定性高，并能转换成为有活性的恩替卡韦。
TAF在2016年11月被美国食药监局批准，成为治疗乙肝的新药。
在此之前，TAF与恩替卡韦完成了两项头对头的临床试验，通过这两个共招募了近1300名慢性乙肝患者的研究证明，不管患者乙肝e抗原是否阳性，25mg 剂量的TAF与300mg 剂量的恩替卡韦治疗效果都相同，治疗48周后，90%以上的所降低。
乙型肝炎病毒耐药基因及分型检测
乙型肝炎现状如何？乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病，主要存在于肝细胞内，可引起肝细胞炎症、坏死和纤维化。
乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性分布,全球约有3.6亿感染者，每年约有100万人死于与HBV相关的肝脏疾病.我国属于感染的高发区，现有的慢性HBV感染者约9300万例。
乙型肝炎病毒（HBV)基因分型的临床意义HBV根据DNA差异可分为A、B、C、D、E、F、G、H八种类型，不同型别在流行特征，致病性，对药物治疗反应等方面存在差异，其中，我国以B型和C型为主,感染HBV基因型B的患者发生肝纤维化及肝细胞癌的平均年龄要比感染HBV基因型C的患者的年龄大。
通过分型检测，可判断病毒复制活跃程度及突变发生率情况.研究表明，与HBV—B型相比,C型复制较活跃，不易发生HBeAg血清转换；HBV—B型易产生前C区突变，C型核心启动子区变异发生率更高，与重型肝炎发病机制密切相关，可作为肝癌高危指标之一.同时,HBV-B、C型患者易产生拉米夫定耐药突变，通过分型检测，可指导临床治疗方案制定，有针对性进行临床治疗，更大程度上提高患者的生活质量.乙肝的治疗方式有哪些?HBV感染主要的治疗方法是抗病毒治疗，国内外普遍使用的药物有干扰素和核苷（酸）类。
由于干扰素需要反复注射，且副作用较多,近年来,核苷(酸）类似物（NA)已成为抗HBV感染的主要方法之一，NA因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的肝病患者,是长期治疗的合理选择.但随着治疗时间的延长,往往会出现病毒耐药株，从而需要监测乙型肝炎病毒耐药基因型，指导临床用药。
乙肝病毒产生耐药的机理是什么?HBV对某种药物的耐药性一般是指由HBV基因组上某些位点的变异导致这种药物对HBV的抑制作用减弱或无作用。
通常分为以下几种：(1）原发性耐药变异：指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生变异,导致变异病毒株对治疗药物的敏感度下降；（2）继发性耐药变异(又称补偿性耐药变异)：指由于原发性耐药变异病毒株复制能力下降,在原发性耐药变异的基础上，病毒株也可在其他位点发生变异,这些变异可部分恢复变异病毒的复制能力或可导致变异病毒对药物敏感度的进一步下降；（3）基因型耐药:指检测到已在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关的HBV变异；（4)表型耐药：通过体外复制系统证实检测到的HBV变异会降低其对抗病毒药物的敏感度。
乙型肝炎病毒耐药变异与基因型检测在临床上的应用
检测４ ６例 乙肝 患 者 血 清 样 本 ， 用特 异 的 引 物 对待 检 标 本 ＨＢ 区进 行 Ｐ Ｒ 扩 增 后 作 基 因序 列 检 测 ， 用 Ｃ ｒｍａ２ ２ 采 ＶＰ Ｃ 利 ｈｏ ｓ． ３软 件 对 测序 结果 进 行 分析 有 无 突 变 产 生 ， 序 结 果 用 软 件 ｃｕｔｌ１ ８ 测 ｌｓ ｘ ． １进 行 基 因 分 型 分 析 。 结 果 可 通 过 一 次 测 序 反 应 完 成 对 ａ ＨＢ ＤＮＡ Ｐ 区的 基 因检 测 及 基 因型 分 析 。检 出 ＹＭＤ 变 异株 ８例 ， 中 ＹＩ 例 ， ＶＤ Ｖ． Ｄ 其 ＤＤ ５ Ｙ Ｄ ３例 。在 检 测 的 ４ ６例 标 本 中 ２ ３例 为 Ｂ基 因型 ， 阳性 率 为 ５ ． ； ２ 例 为 ｃ基 因 型 ， 阳性 率 ４ ． ； 基 因型 ２ ， ００ 有 １ 其 ５６Ｄ 例 阳性 率 ４ ４ 。Ｂ基 因型 ＨＢ 感 染 者 中 ＨＣ ． Ｖ Ｃ ２例 ， ８ ７ ； 占 ． Ｃ基 因 型 ＨＢ 感 染 者 中 ＨＣ Ｖ Ｃ ８例 ， ３ ． 。 结 论 直接 测 序 法 分 析 ＨＢ 常 见 耐 药 突 变位 点及 基 因 型 准 确 可 占 ８１ Ｖ
ｔ ｅ ｅ ｗｅ ｅ ２ ｈ ｐ ｔ ｃ ｌ ｌ ｒｃ ｒ ｉ ｏ ｈ ｒ ｒ ｅ ａｏ ｅｌ ａ ａ ｃｎ ｍａ（ ． ）ｉ ｅ ｏ ｙ ｅ Ｂ ｐ ｔ ｎ ， ｅ ａ ｏ ｅｌ ｌｒｃ ｒ ｉ ｏ ｕ ８７ ｎ ｇ ｎ ｔ ｐ ａ ｉ ｓ ８ ｈ ｐ ｔ ｃ ｌ ａ ａ ｃｎ ｍａ（ ８ １ ）ｉ ｅ ｏ ｙ ｅＣ ａ ｉｎ ｓ ｅ ｕ ３ ． ｎｇ ｎ ｔｐ ｐ ｔ ｔ． ｅ
武汉地区157例乙型肝炎病毒基因分型和耐药性分析
武汉地区157例乙型肝炎病毒基因分型和耐药性分析宋仕玲;桂文甲;周洪清;黄艺芬;尹淑芬;李靖;吴淑坤【摘要】目的了解武汉市乙型肝炎病毒基因型分布特点和乙型肝炎病毒耐药情况.方法采用基因测序法检测武汉市区157例患者HBV基因型,目标检测基因型为A～H等8个基因型,检测HBV 11个耐药位点:rtL80、rtL169、rtV173、rtL180、rtA181、rtT184、rtA194、rtS202、rtM204、rtN236和rtM250,判断对HBV耐药的核苷类似物.结果武汉市区157例HBV感染者中,检出3种HBV基因型,其中B型占72.61％,C型占26.75％,D型占0.64％.共有68例(43.31％)耐药,其中B 型70.59％,C型29.41％,基因B型和C型的HBV相比,耐药发生差异无统计学意义(x2 =0.379,P＞0.05).对拉米夫定耐药41例,占全部耐药病例的60.29％,其中B型占73.17％,C型占26.83％;204I位点耐药17例,180M+204I位点耐药6例,180M+ 204V位点耐药12例,180M+ 204V/I位点耐药6例.对阿德福韦酯耐药20例,占全部耐药病例的29.41％,基因B型占75.0％,基因C型占25.0％,耐药位点为236T为9例,耐药位点为181T/V为7例,236T和181T/V联合耐药4例.对恩替卡韦耐药5例,占全部耐药病例的7.35％,基因B型3例,基因C型2例.拉米夫定和阿德福韦酯联合耐药2例,占全部耐药病例的2.94％,均为基因C型.替比夫定耐药与其他核苷类似物耐药分析结果重复,共32例,占47.06％,基因B型75.0％,基因C型25.0％.结论武汉市区157例乙型肝炎病毒感染者中男性较多,感染HBV 主要基因型为B型,其次为C型,患者主要表现为拉米夫定、替比夫定和阿德福韦酯耐药.临床应根据患者HBV基因型和耐药情况个体化制定治疗方案.【期刊名称】《胃肠病学和肝病学杂志》【年(卷),期】2015(024)008【总页数】4页(P969-972)【关键词】肝炎病毒;乙型;HBV DNA;基因型;耐药【作者】宋仕玲;桂文甲;周洪清;黄艺芬;尹淑芬;李靖;吴淑坤【作者单位】武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061【正文语种】中文【中图分类】R512.6+2乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)基因型测定对评估慢性乙型肝炎感染者的疾病进展和制定最佳抗病毒治疗方案很重要，相比而言，肝硬化和原发性肝癌患者感染的乙型肝炎病毒基因分型更多为基因C型和D 型［1-3］。
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◆DNA测序技术原理
◆乙肝耐药基因测序特点 ◆耐药基因测序的应用
DNA测序技术原理
乙肝病毒结构
美国ABI3130型基因测序仪
本实验采用核酸扩增技术结合 荧光标记探针杂交方法对乙型肝炎 病毒DNA进行定量检测，其产物经 过测序PCR反应，产物纯化后上 3130测序仪进行毛细管电泳，得到 测序峰图，从而完成耐药突变位点 的检测。
乙肝治疗的耐药管理
• 耐药也是一个“进化升级”的过程，从初级的“基因变异”，逐渐演 变成中级的“病毒学耐药”，最终修炼成了的“临床耐药”。 • “基因耐药”是指在抗病毒治疗过程中体内乙肝病毒基因组产生了变 异，形成新的耐药性病毒基因序列。在这个初级阶段，变异病毒株在 人体内的含量很少，还属于毫不起眼的“少数派”。由于它们数量稀 少、势力低微，只能通过病毒基因检测才能发现他们的存在。 • 从“基因耐药”阶段跨入“病毒学耐药”阶段的过程中，变异病毒株 会持续不断地进行自我复制，导致血清中HBV DNA水平反弹至 1×103～1×106拷贝/毫升之间，这时尚未造成肝功能异常和明显的 肝脏组织学损伤。
• HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者ห้องสมุดไป่ตู้1、2、3 年时的耐药发生率分别为0%、1.6%、 3.1% • HBeAg阴性者1、2、3年的耐药发生率分 别为0%、3.0%、5.9%~11%
HBV恩替卡韦耐药
• 拉米夫定耐药的病毒株对恩替卡韦敏感性 降低8至30倍； • 发生YMDD变异患者治疗1 年时对恩替卡韦 耐药发生率为5.8%，并出现相关的位点变 异。
基因测序法的准确度与可靠性是其他 方法不可替代的，它是基因耐药检测的 “金标准”。乙肝病毒耐药基因测序结果 能精确指导用药，确保抗病毒治疗取得最 佳疗效。
↑ 204位点（YIDD）
耐药突变位点命名
• 命名体系将HBV聚合酶蛋白划分成4个区域：终蛋白区、 间蛋白区、rt区和RNA酶区，每个区的氨基酸分别计算位 码。rt区起始于高度保守的EDWGPC DEHG位点，包含 344个氨基酸，拉米夫定治疗相关的变异主要发生在该区， 包括rtL180M和rtM204V/I等。新命名体系包括4个部分， 即所属区域、治疗前氨基酸、变异位码和变异氨基酸，如 rtL180M表示变异发生在rt区的180位点，亮氨酸（L）被 蛋氨酸（M）所取代。应当指出的是，发生变异不一定耐 药，只有当变异株成为优势株时才发生耐药。
rtL180M rtM204V/I/S
以上位点，现有测序试剂盒都可以检测。
目前常用的治疗乙肝口服抗病毒核苷类似物 药物有：拉米夫定、替比夫定、阿德福韦、恩替 卡韦四种。但是由于乙型肝炎病毒具有较高的突 变性，一旦乙肝病毒发生耐药突变，将会导致上 述药物治疗无效。研究结果显示，病人在治疗前 就携带有拉米夫定耐药基因的有约26.41%，携带 有阿德福韦耐药基因的有约6.52%。如果治疗之前 就已经携带有这些耐药基因，在不明确的情况下 使用了相关的药物，势必治疗效果较差。所以耐 药基因测序检测不但是疗效考核的重要指标，更 重要的是它是抗病毒药物选择的重要参考依据， 避免盲目用药。
HBV野生型质控的测序峰图
↑ 173位点
↑ 180位点
↑ 181位点
↑ 184位点
↑ 202位点
↑ 204位点
↑ 207位点
↑ 213位点
↑
↑ 215位点
214位点
↑ 236位点
↑ 237位点
↑ 238位点
↑ 250位点
rtM204V/I/S 的几种基因型
↑ 204位点（YMDD）
↑ 204位点（YVDD）
HBV拉米夫定耐药
使用一年、二年、三年、四年的耐药比 率为：15-32%、38%、56%、67% 虽然拉米夫定治疗慢性乙肝疗效显著， 但长期使用拉米夫定会出现耐药现象
一旦出现拉米夫定耐药突变（YMDD变 异），大多数患者会在2-4个月之内出现 HBV-DNA和ALT反弹
HBV阿德福韦耐药
• 阿德福韦为5’-单磷酸脱氧阿糖腺苷类似物， 可明显抑制HBV DNA复制
• 当变异株最终推翻了野生株的统治成功当家作主后，耐药发展到了 “临床耐药”阶段。这时候，乙肝病人血液中的HBV DNA水平会反 弹升至1×106拷贝/毫升以上，最终出现肝功能异常、肝脏组织学损 伤。 • 因此，我们在“病毒学耐药”阶段及“基因耐药”阶段就应该尽早进 行干预，及时阻止“病毒学耐药”朝“临床耐药”的恶性方向发展。
• 对于HBV DNA定量大于等于5×103 IU/ml 的标本，可以通过基因测 序的方法检测耐药位点是否发生突变，从而及时进行耐药管理，指导 用药。
• 对所有接受核苷类药物治疗的慢性乙型肝炎患者，治疗期间都应密切 监测病毒学应答与突破，停药以后也应监测应答持续和病情复发情况
• 对初治无应答的患者，应考虑替换治疗以获得临床应答，尽可能减 少后续耐药。对发生病毒学突破的患者，应考虑其依从性，同时尽可 能进行病毒耐药突变的检测，以确定基因型耐药的存在和病毒耐药突 变的模式。目前越来越多的患者接受一种以上药物治疗，对病毒耐药 突变的检测显得尤其重要。
SAP MIX的作用
外切酶Exon I 降解定量PCR产物中残 留的单链PCR引物。SAP酶除去定量PCR产物 中残存的脱氧核苷三磷酸的磷酸基团，从 而达到纯化定量PCR产物的目的。
经过SAP MIX 酶解纯化后的定量产物方 可以进行后面的测序PCR反应。
测序PCR循环条件
96℃ 1min → (96℃ 10sec , 50℃ 5sec , 60℃ 4min) ×25 cycles →4℃恒温。
rtA181V/T/S rtV214A rtQ215S rtN236T rtP237H rtN/H238T/D
rtT184A/I/S rtS202G/I rtM204V/I/S rtM250L/V
rtL180M rtM204V/I/S
复制DNA序列于NCBI基因分型网页上，就可 得到乙肝病毒基因分型结果。 /projects/gen otyping/formpage.cgi
毛细管电泳原理
一、电进样与电泳 毛细管和电极深入样品溶液中， 加电压，荷负电的DNA分子进入毛 细管，在电场作用下向阳极泳动。
二、荧光激发和检测 带4色荧光标记的DNA片段按分子量 从小到大依次经过激光检测区，激光激 发荧光，产生长波长的荧光信号，荧光 信号被CCD收集，软件将光学信号转换 成电泳图谱。
60℃ 4min的延伸时间是与普通PCR最 大差别，目的是为了扩增出一系列相差一 个碱基的ddNTP末端终止的DNA序列。
测序反应得到的产物经过酒精纯化， 甲酰胺变性之后，可以上机进行毛细管电 泳。
酒精纯化的目的是去除未结合的荧光 染料终止物和残留的引物、盐离子、酶等。 此步对测序成功非常关键，关系到测序峰 图质量的好坏。
乙肝耐药基因测序特点
基因芯片和基因测序方法检测乙肝耐药位点的比较
基因芯片
基因测序
原理
结果 分析
标本DNA与耐药检 双脱氧终止法检测 测探针的DNA杂交 基因序列
由显色结果判断 野生株与突变株 由碱基序列与氨基 酸序列判断
↑ 204位点
由上图204位点可见，存在GTG、ATG、ATT三种碱基排列状况， 分别对应V、M、I三种氨基酸，为YMDD/YVDD/YIDD杂合子，测序结 果直观可靠。
相较于基因芯片检测，基因测序法具有直观，准确的 优点，也避免了DNA杂交可能发生的污染，假阴性，假 阳性问题。对于杂合子，也就是野生型与突变型共存的状 况，更直观可靠。
↑
204位点
由上图204位点可见，有GTG弱势突变株存在，属于YVDD 与野生型共存的状况，基因测序可以较早发现突变株的存在。
乙肝病毒耐药位点检测的临床应用
• 本资料来源于 网址： /Article/ygfz/ygzl/200211/1159.html
上海申友乙肝病毒DNA测序试剂盒检测的 耐药位点
拉米夫定（LAM） 阿德福韦（ADV） 恩替卡韦（ETV) 替比夫定（LDT)
rtV173L rtL180M rtM204V/I/S rtV207I/L/G rtS213T
拉米夫定（LAM） 阿德福韦（ADV） 恩替卡韦（ETV)
替比夫定（LDT)
rtV173L rtL180M rtM204V/I/S rtV207I/L/G rtS213T
rtA181V/T/S rtV214A rtQ215S rtN236T rtP237H rtN/H238T/D
rtT184A/I/S rtS202G/I rtM204V/I/S rtM250L/V
乙肝病毒P区耐药基因测序步骤
• HBV DNA 的提取 • 定量PCR反应 （ HBV DNA ≥ 5×103 IU/ml 的标本可以进行测序） • PCR产物的酶解（SAP酶混合物） • 测序PCR反应 （双脱氧终止法） • 测序产物纯化 （乙醇纯化法） • 上机测序 （毛细管电泳） • 测序峰图分析
双脱氧终止法原理
病毒DNA定量分析得到HBV DNA ≥ 5×103 IU/ml 的标本可以进行后续的耐药基因 测序 ，定量PCR产物经过SAP MIX的纯化后， 进行测序PCR反应。
普通PCR与测序PCR反应的比较
普通PCR DNA 聚合酶 引物 底物 产物 荧光标记 Taq 酶 一对 dNTP 等长的DNA片段 无 测序PCR反应 （双脱氧终止法） 测序酶 单向 dNTP+ddNTP(带荧光 标记) 相差一个碱基的一 系列片段 3’端带荧光标记