全基因组从头测序(de novo测序)
细菌de novo测序
细菌de novo ，是基于高通量测序数据，对细菌基因组进行从头组装的方法。
基于组装结果，我们可以预测细菌基因组中所包含的基因，并通过功能数据库比对获得基因的功能信息。
根据不同组装精细程度的需求，我们提供细菌框架图、细菌精细图和细菌完成图三种策略，为您提供全面的细菌de novo解决方案。
技术参数参考文献[1] Liu F, Hu Y, Wang Q, et al . Comparative genomic analysis of Mycobacterium tuberculosis clinical isolates [J]. BMC genomics, 2014, 15(1): 469.[2] Salipante S J, Roach D J, Kitzman J O, et al . Large-scale genomic sequencing of extraintestinal pathogenic Escherichia coli strains [J]. Genome research,2014: gr. 180190.114.案例解析［案例一］ 结核分枝杆菌临床分离株的比较基因组学分析[1]结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是引起结核病的病原菌，特别是多重耐药和泛耐药结核分枝杆菌菌株的出现对结核病的防治产生了挑战。
本文通过对7 株抗性范围不同的临床菌株进行了全基因组测序，并与其他7 株来源不同的菌株进行了比较。
通过对抗性数据库注释发现了39 处耐药相关的变异，包括14 处先前报道过的位点以及25处新的位点，并发现了主要抗原变异来源PE-PPE-PGRS 基因的16 处InDel。
通过对SNP、InDel 及CRISPR结构的查找和注释发现，多重耐药菌株和泛耐药菌株间在基因组水平上并没有显著的差异，表明临床结核分枝杆菌的耐药性进化过程是十分复杂而多变的。
二代测序 denovo 流程
一、概述二代测序（Next Generation Sequencing, NGS）技术的广泛应用，使得基因组学研究取得了长足的进步。
其中，二代测序denovo流程是利用NGS技术对未知生物样本进行全基因组测序，并在此基础上进行基因组组装和注释的过程。
本文将对二代测序denovo流程进行深入探讨，从数据处理到基因组组装和注释等方面进行详细介绍。
二、数据处理在进行denovo全基因组测序之前，首先需要进行数据处理。
数据处理包括测序数据的质量控制、序列过滤和去除低质量序列等步骤。
在质量控制方面，可以利用软件对测序数据进行质量评估，筛选出高质量的测序数据用于后续分析。
针对测序数据中可能存在的接头序列和低质量碱基，需要进行序列过滤和去除低质量序列的处理，确保后续的组装和注释过程能够得到准确的结果。
三、基因组组装基因组组装是denovo流程中的关键步骤，主要是将测序得到的短序列reads进行拼接，重建成完整的基因组序列。
目前，常用的基因组组装算法包括SOAPdenovo、Velvet、ABySS等。
这些算法能够根据reads之间的重叠信息和kmers的频率进行拼接，得到较为完整的基因组序列。
对于大规模基因组的组装，还可以采用高通量测序技术辅助组装，如mate p本人r测序或二代测序测序辅助第三代测序（Hybrid Assembly）等方法。
四、基因组注释基因组注释是denovo流程中的另一个重要步骤，主要是对组装得到的基因组序列进行基因预测、基因功能注释和通路分析等。
在基因预测方面，可以利用软件对基因组序列进行Open Reading Frame （ORF）预测和基因预测，以确定基因的位置和编码序列。
在基因功能注释方面，可以利用生物信息学数据库和工具对基因进行功能和结构注释，帮助研究人员理解基因的生物学功能和作用。
为了进一步了解基因的生物学功能和相互作用，还可以进行通路分析，探究基因在生物体内的作用机制。
五、应用与发展二代测序denovo流程在生命科学研究中有着广泛的应用与发展前景。
Denovo技术介绍
Hi-C 技术
组装流程
利用染色体内互作概率高于染色体间互作这一特征，将contigs分组，分配到不同的染色体中。然
后利用染色体内部距离越近互作概率越高这一特征，将contigs排序并进一步确定方向。
影响Hi-C组装的因素 基因组片段越大（N50越大），组装效果越好。基于相同的N50时，数据量越高，组 装效果越好。
目录
一 • 纯二代测序组装技术 二 • Pacbio测序组装技术 三 • BioNano光学图谱技术 四 • Nanopore技术 五 • Hi-C 技术 六 • 10X Genomics Linked Reads
纯二代测序组装技术纯二代 类型简单基因组de novo 测序
（重复序列比例＜50%，杂合度＜0.5%）
BioNano光学图谱技术
技术原理
BioNano光学物理图谱技术，简而言之是利用单链酶切技术在DNA上做荧 光标记，再通过纳米孔道对长达几百kb的长链DNA单分子线性化，经过高分 辨率光学系统进行拍照，在较短时间获得更完整的基因图谱，在辅助基因组 组装和结构变异（structural variants，SV）检测等方面有广泛的应用。
Pacific Bio 测序原理 1、 4种荧光分别标记4种dNTP。 2、SMRT Cell含有15,000个纳米级的零模波导孔（zero-mode waveguides,
ZMWs），每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测 序，并实时检测插入碱基的荧光信号。
3、测序时，荧光dNTP与酶+DNA模板行成复合物，激光照射，发出荧光。
主要产品
人类基因组测序
动植物基因组测序 细菌基因组测序 真菌基因组测序 宏基因组测序
De novo测序
百泰派克生物科技
De novo测序
De novo测序，又称从头测序，是一项不依赖于任何已知或参考序列的测序技术，它利用生物信息学分析技术将序列片段进行拼接、组装以实现整个序列的鉴定，可用于未知基因组、转录组和蛋白质的全序列分析。
从头测序最重要、最关键的就是对已测得的小片段进行拼接、组装，如果在这个过程中发生拼接错误，那么将会导致整个测序结果不准确。
因此，在测序前将待测样品进行多重酶切以及对序列进行反向验证是保证片段全覆盖以及测序结果准确性的关键因素。
百泰派克生物科技采用高通量质谱平台提供快速准确的蛋白De novo测序服务，包括蛋白质、多肽、单克隆抗体从头测序以及蛋白突变检测等，还可提供定制化的序列分析服务，满足不同的实验需求，欢迎免费咨询。
全基因组从头测序(de novo测序)
全基因组从头测序(de novo测序)/view/351686f19e3143323968936a.html从头测序即de novo 测序，不需要任何参考序列资料即可对某个物种进行测序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。
利用全基因组从头测序技术，可以获得动物、植物、细菌、真菌的全基因组序列，从而推进该物种的研究。
一个物种基因组序列图谱的完成，意味着这个物种学科和产业的新开端！这也将带动这个物种下游一系列研究的开展。
全基因组序列图谱完成后，可以构建该物种的基因组数据库，为该物种的后基因组学研究搭建一个高效的平台；为后续的基因挖掘、功能验证提供DNA序列信息。
华大科技利用新一代高通量测序技术，可以高效、低成本地完成所有物种的基因组序列图谱。
包括研究内容、案例、技术流程、技术参数等，摘自深圳华大科技网站/service-solutions/ngs/genomics/de-novo-sequencing/技术优势:高通量测序：效率高，成本低；高深度测序：准确率高；全球领先的基因组组装软件：采用华大基因研究院自主研发的SOAPdenovo软件；经验丰富：华大科技已经成功完成上百个物种的全基因组从头测序。
研究内容: 基因组组装■K-mer分析以及基因组大小估计；■基因组杂合模拟（出现杂合时使用）；■初步组装；■GC-Depth分布分析；■测序深度分析。
基因组注释■Repeat注释；■基因预测；■基因功能注释；■ncRNA注释。
动植物进化分析■基因家族鉴定（动物TreeFam；植物OrthoMCL）；■物种系统发育树构建；■物种分歧时间估算（需要标定时间信息）；■基因组共线性分析；■全基因组复制分析（动物WGAC；植物WGD）。
微生物高级分析■基因组圈图；■共线性分析；■基因家族分析；■CRISPR预测；■基因岛预测（毒力岛）；■前噬菌体预测；■分泌蛋白预测。
熊猫基因组图谱Nature. 2010.463:311-317.案例描述大熊猫有21对染色体，基因组大小2.4 Gb，重复序列含量36%，基因2万多个。
全基因组测序从头测序（denovosequencing）重测序（re
全基因组测序从头测序（denovosequencing）重测序（re展开全文全基因组测序全基因组测序分为从头测序(de novo sequencing)和重测序(re-sequencing)。
从头测序(de novo)不需要任何参考基因组信息即可对某个物种的基因组进行测序，利用生物信息学分析方法进行拼接、组装，获得该物种的基因组序列图谱，从而推进该物种的后续研究。
基因组重测序是对有参考基因组物种的不同个体进行的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。
基因组重测序主要用于辅助研究者发现单核苷酸多态性位点(SNPs)、拷贝数变异(CNV)、插入/缺失(Indel)等变异类型，以较低的价格将单个参考基因组信息扩增为生物群体的遗传特征。
全基因组重测序在人类疾病和动植物育种研究中广泛应用。
技术路线生物信息分析案例解析1.比较基因组分析采用progressiveMauve软件比对9株大肠杆菌O104:H4分离株的染色体序列，展示可移动遗传元件和基因组可变区域信息，利用核心SNP位点信息构建最大似然进化树揭示菌株间的亲缘关系。
2.重复序列分析采用从头预测和基于数据库比对的两种方法对纳塔尔大白蚁和湿木白蚁的基因组序列进行转座子(TEs)分析，利用RepeatModeler软件对两种方法的结果进行整合分析并构建转座子序列数据库，使用RepeatClassifier软件对转座子进行分类，计算两种白蚁基因组中转座子的序列变异速率，揭示基因组扩张的可能机制。
3.代谢通路重建根据限制性脱氯细菌(PER-K23)基因组注释信息，预测类咕啉的生物合成包含4种代谢途径。
4.基因进化分析利用117个单拷贝编码蛋白的基因序列构建Mollicutes、Haloplasma和Firmicutes菌株的最大似然物种进化树，揭示不同菌株基因组中mreB和fib基因的获得与丢失。
测序策略及数据量测序策略：PE125或PE150建议数据量：根据基因组大小进行30×或50×的测序。
高通量名词解释
高通量测序常用名词汇总一代测序技术： 即传统的Sanger 测序法，Sanger 法是根据核苷酸在待定序列模板上 的引物点开始，随机在某一个特定的碱基处终 并且在每个碱基后面进行荧光标 止， 记，产生以A 、T 、C 、G 结束的四组不同长度的一系列核苷酸，每一次序列测定由一套四个单独的反应构 成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷 （dNTP ），并混入限量的一种不同的双脱氧酸核苷三磷酸（ddNTP ）。
由于ddNTP 缺乏延伸所需要的 3-0H 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在 G 、A 、T 或C 处终止，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。
它们具有相比，二代测序技术可以一次对几十万到几百万条核酸分子同时进行序列测定， 从而使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序Deepsequencing ）。
NGS 主要的平台有 Roche （ 454 & 454 +） ， Illumina （ HiSeq2000/2500、GA IIx 、MiSeq ）， ABI SOLiD 等。
是DNA 或RNA 分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列 基因通过复制把遗传信息传递给下一代，使后代出现与亲代相似的性状。
DNA : Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸，一个脱氧核苷酸分子由三部分组成：含氮碱基、脱氧核糖、磷酸。
脱氧核糖核酸通 3',5'-磷酸二酯键按一定的顺序彼此相连构成长过链，即DNA 链，DNA 链上特定的核苷酸序列包含有生物的遗传信息， 是绝大部分生物遗传信息的载体。
RNA : Ribonucleic ，，核糖核酸，一个核糖核苷酸分子由碱基，核糖和磷酸构成。
Acid核糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子称之 为RNA 链。
RNA 是存在于生物细胞以及部分病 毒、类病毒中的遗传信息载体。
不同种类的 RNA 链长不同，行使各式各样的生物功能，如参与蛋白质生物合成的RNA 有信使RNA 、转移RNA 和核糖体 RNA 等。
Ion torrent De novo测序文库构建方法 De-novo library
De novo测序文库构建方法一、De novo测序的原理De novo测序不需要任何参考序列，即可对某个物种进行测序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。
利用全基因组从头测序技术，可以获得动物、植物、微生物的全基因组序列，从而推进该物种的研究。
De novo测序没有参考序列，需要建立不同片段大小及类型的测序文库，测序后的信息需要组装和拼接。
拟构建200bp和400bp Ion测序文库，以及Ion mate-pair测序文库。
二、文库构建技术路线1. Ion 200 or 400-base-read libraryWorkflow基因组DNA提取↓OD260/280检测，凝胶电泳检测，基因组大小评估，基因组定量↓超声波打断↓末端修复↓片段纯化接头连接↓纯化文库片段筛选（E-Gel胶回收）↓文库片段扩增↓纯化Agilent检测，Qubit定量↓OneTouch、ES↓上机测序2. Ion mate-pair library基因组DNA提取↓基因组定量检测↓DNA破碎（HydroShear DNA Shearing Device）（压力挤压破碎大片段DNA）↓末端修复↓文库片段选择（凝胶电泳，SOLiD凝胶回收试剂盒纯化）↓文库片段定量↓MP接头连接（SOLiD MP接头连接试剂盒）↓纯化Qubit定量↓确定DNA回收量，确定回收到的片段含量（含量不同，使用的试剂量不同）↓DNA片段环化↓分离纯化环状DNA↓定量↓环化DNA缺口修复及SOLiD文库试剂盒纯化↓T7核酸外切酶、S1核酸酶酶切↓纯化末端修复↓文库片段于链霉素亲和素微珠相连↓连接Ion接头↓缺口修复、与扩增凝胶条带检测（确定循环数）↓片段扩增↓SOLiD试剂盒纯化片段切胶回收↓Agilent检测↓Q-PCR定量↓文库构建完成三、文库构建用到的试剂盒Ion Library Adaptors and Primers and 5500 SOLiD Mate-Paired Library Kit Mate-Paired Library Enzyme ModuleMate-Paired Library Amplification ModuleMate-Paired Library Oligo moduleLibrary Micro Column Purification KitAgencourt AMPure XP 60 mL KitQubit 2.0 Fluorometer及相应的试剂Agilent 2100 及相应的试剂四、400bp测序文库构建步骤1.细菌基因组DNA的提取要求客户提供足量菌体。
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[3] Junjie Qin, Yujun Cui, et al. Open-Source Genomic Analysis of Shiga-Toxin–Producing E. coli O104:H4. N Engl J Med. 2011 Aug 25; 365(8): 718-24.
从头测序（de novo 测序）
从头测序即 de novo 测序，不需要任何参考序列资料即可对某个物种进行测序，用生物信息学分 析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。利用全基因组从头测序技术，可以获得 动物、植物、细菌、真菌的全基因组序列，从而推进该物种的研究。一个物种基因组序列图谱的完成， 意味着这个物种学科和产业的新开端！这也将带动这个物种下游一系列研究的开展。全基因组序列图 谱完成后，可以构建该物种的基因组数据库，为该物种的后基因组学研究搭建一个高效的平台；为后 续的基因挖掘、功能验证提供 DNA 序列信息。华大科技利用新一代高通量测序技术，可以高效、低 成本地完成所有物种的基因组序列图谱。
Medicine，NEJM）上在线发表。德国致病性大肠杆菌研究项目首次展示了快速的基因组测序
技术和及时的数据共享给全球各科研领域所带来的巨大贡献，证实了信息数据的快速共享在
公共卫生事件中可发挥至关重要的作用，同时也为应对全球重大突发性紧急公共卫生事件提
供了一个全新的解决思路。
德国肠出血性大肠杆菌项目进展时间轴
测序分析结果表明，大熊猫不喜欢吃肉主要是因为 T1R1 基因失活，无法感觉到肉的鲜
味。大熊猫基因组仍然具备很高的杂合率，从而推断具有较高的遗传多态性，不会濒于灭绝。
研究人员全面掌握了大熊猫的基因资源，对其在分子水平上的保护具有重要意义。
黄瓜基因组图谱 黄三文, 李瑞强, 王俊等. Nature Genetics. 2009.
熊猫基因组图谱 Nature. 2010.463:311-317.
案例描述
大熊猫有 21 对染色体，基因组大小 2.4 Gb，重复序列含量 36%，基因 2 万多个。熊猫
基因组图谱是世界上第一个完全采用新一代测序技术完成的基因组图谱，样品取自北京奥运
会吉祥物大熊猫“晶晶”。
部分研究成果
案例描述
国际黄瓜基因组计划是由中国农业科学院蔬菜花卉研究所于 2007 年初发起并组织，并
由深圳华大基因研究院承担基因组测序和组装等技术工作。
部分研究成果
黄瓜基因组是世界上第一个蔬菜作物的基因组图谱。该项目首次将传统的 Sanger 测序
和新一代测序技术相结合，对黄瓜进行全基因组测序。研究人员自主开发了一套全新的序列
德国肠出血性大肠杆菌 E. coli O104:H4 TY2482 基因组
大草莺球壳菌基因组. Genome Res. 2011 Dec; 21(12):2157-66.
案例描述
大草莺球壳菌(M.graminicola)是一种引起小麦 Triticum aestivum（T.a.)叶枯的真菌病原，
也感染披碱草 Elymus repens(E.r.)，果园草 Dactylis glomerata(D.g.)，多花黑麦草 Lolium
multiflorum(L.m.)以及多年生黑麦草 Lolium perenne(L.p.)。
部分研究成果
通过对 4 种病原菌：大草莺球壳菌-M.graminicola、2 种大草莺球壳菌的祖先菌株 S1 和
运转周期为 1 年
真菌
Survey 的标准流程运转 框架图标准流程运转周 Survey 升级到精细图标
周期约为 40 个工作日 期约为 50 个工作日
准流程（测序，信息分
析）运转周期约为 100
个工作日
细菌
Survey 组装标准流程运 精细图标准流程运转周 完成图标准流程运转周
转周期约为 40 个工作日 期约为 60 个工作日
期约为 75 个工作日
三 项目合格指标 1. 动植物基因组指标
基因组大小（Genome Size, GS） GS ≤ 300 Mb
300 Mb ＜ GS ≤ 1500 Mb（鸟类除外）
1500 Mb ＜ GS ≤ 3000 Mb （哺乳动物除外）
组装指标 Contig N50 ＞ 20 kb Scaffold N50 ＞ 300 kb Contig N50 ＞ 10 kb Scaffold N50 ＞ 150 kb Contig N50 ＞ 20 kb Scaffold N50 ＞ 300 kb Contig N50 ＞ 10 kb Scaffold N50 ＞ 150 kb Contig N50 ＞ 10 kb Scaffold N50 ＞ 150 kb
Survey
整体测序覆盖深度不低于 100 倍覆盖度。
细菌
精细图
基因组常染色质区覆盖度达到 95%以上，基因区覆盖度达到 98%以上（需 要提供高度同源序列）；整体测序覆盖深度不低于 100 倍覆盖度； 精细图 v1.0 正常 GC 菌（35%≤GC%≤65%），基因组≤5 M, scaffold < 100；5 M ≤基因组 ≤ 10 M, scaffold 非正常 GC 菌（65%），基因组≤5 M, scaffold < 200，5 M ≤基因组≤ 10 M， scaffold 精细图 v2.0 正常 GC 菌（35%≤GC%≤65%），基因组≤5 M, contig < 100；5 M ≤基因组≤ 10 M，contig 非正常 GC 菌（65%），基因组≤5 M, contig < 200；5 M ≤基因组≤ 10 M， contig
完成图
经过基因组检测、1 个 scaffold、1 个 contig 这三个阶段，后期经过 2 轮 PCR 对完成图组装结果进行局部验证。
小基因组
Survey
整体测序覆盖深度不低于 100 ≥133ng/μl； 样品质量：基因组完整； 样品纯度：OD260/280= 1.8~2.0。
二、 项目执行周期 动植物
Survey 的标准流程运转 普通基因组标准流程的 复杂基因组标准流程的
周期约为 2 个月
运转周期为 6 个月
（2）病原菌在宿主环境中的正向选择影响编码分泌蛋白的基因，并且与宿主分子相互作用， 类似于一场病原与宿主协同进化的竞赛。
参考文献
[1] Sanwen Huang, Ruiqiang Li, Jun Wang, et al. The genome of The cucumber (Cucumis sativus Linnaeus). Nature Genetics. 2009.
[4] Li R, Wang J, et al. The making of a new pathogen: Insights from comparative population genomics of the domesticated wheat pathogen Mycosphaerella graminicola and its wild sister species. Genome Res. 2011 Dec; 21(12):2157-66.
复杂基因组 2. 微生物基因组指标
Survey
Contig N50 ＞ 20 kb Scaffold N50 ＞ 300 kb 整体测序覆盖深度不低于 30 倍覆盖度。
真菌
框架图
交付数据不低于 50× clean data。
精细图
基因组常染色质区覆盖度达到 95%以上，基因区覆盖度达到 98%以上（需 要提供高度同源序列），拼接片段 Scaffold N50 长度达到 300 Kb；整体测 序覆盖深度不低于 50 倍覆盖度。
技术流程:
技术参数:
一、 样本要求 样品类型：DNA 样 30 μg；总样品量需根据实 验策略，如建库类型及建库数量而定；
S2 以及球壳菌的远源菌——大麦斑枯病菌-Septoria passerinii 的基因组进行测序、组装及群体
基因组分析，得出以下结论：
（1）M. graminicola 对小麦的毒性最高，而且还保留对其他宿主的致病能力。M. graminicola 比祖先菌株 S1、S2 的适应进化能力更强；
Contig N50 ＞ 5 kb Scaffold N50 ＞ 20 kb
GS ＜ 1600 Mb（鸟类 ）
Contig N50 ＞ 20 kb Scaffold N50 ＞ 300 kb
GS ＜ 3200 Mb （哺乳类，除翼手目除外）
Contig N50 ＞ 20 kb Scaffold N50 ＞ 300 kb
案例描述
2011 年 5 月-6 月德国爆发由 E.coli O104:H4 引起的急性肠出血性流行病疫情，疫情迅速
Байду номын сангаас
蔓延至欧洲及北美等地区，超过 4000 人被感染。此次疫情中，华大基因研究院和德国汉堡—
埃普多夫大学医学中心的研究人员以最快速度完成对致病菌基因组测序及分析，并即时向全
球免费公开所有数据，该数据库的公开使得整个科学界在第一时间共享了相关数据信息，为
拼接软件，成功绘制了黄瓜基因组图谱，这是国际黄瓜基因组计划第一阶段所取得的重大成
果，对黄瓜和其它瓜类作物的遗传改良、基础生物学研究、以及对植物维管束系统的功能和
进化研究将发挥重要的推动作用。