逆转录
单细胞测序 逆转录
单细胞测序逆转录
单细胞测序（Single-cell sequencing）是一种用于研究单个细胞的基因组学、转录组学和表观基因组学的技术。
在单细胞测序中，逆转录（Reverse Transcription）是其中一个关键步骤，主要用于将细胞中的RNA转录成相应的cDNA，以便后续的测序和分析。
逆转录的步骤通常包括以下几个方面：
1.RNA提取：从单个细胞中提取总RNA。
这可以通过不同的方
法实现，如细胞裂解、酶解或使用特定的细胞捕获技术。
2.逆转录反应：使用逆转录酶（reverse transcriptase）对RNA进
行逆转录，将RNA转录成相应的cDNA。
逆转录酶能够合成cDNA链，其方向是与RNA模板相反的。
3.RNA降解：通过加入RNase（核酸酶）等酶来降解RNA模板，
使得只有cDNA链得以保留。
4.二次合成：对得到的cDNA进行二次合成，以增加cDNA的数
量。
在单细胞测序中，逆转录的效率和准确性对后续的数据分析至关重要。
由于单细胞样本的RNA量非常有限，逆转录过程的优化是确保从单个细胞获取高质量数据的关键步骤之一。
单细胞测序技术的不断发展使得研究者能够更全面地理解单个细胞的基因表达和功能，为理解生物学的复杂性提供了强大的工具。
逆转录病毒
避免高危性行为
避免与陌生 人发生性关 系
避免纹身、 穿耳等皮肤 穿刺行为
正确使用安 全套
避免与艾滋 病患者发生 性关系
避免共用针 头
避免与携带 逆转录病毒 的动物接触
加强个人卫生习惯
01
勤洗手：饭 前便后、接 触公共物品后及时洗手
02
避免共用个 人物品：如 牙刷、毛巾 等
03
避免接触血 液、体液等 高危物质
04
避免与感染 者密切接触
05
保持良好的 生活习惯， 增强免疫力
THANK YOU
02
按照病毒感染宿主范围分类： 动物病毒、植物病毒、微生 物病毒
04
按照病毒基因组复制方式分 类：RNA病毒、DNA病毒
病毒结构
核心：包含 病毒的遗传 物质，通常 是RNA或 DNA
衣壳：包裹 在核心周围 的蛋白质外 壳，保护核 心并帮助病 毒进入宿主 细胞
包膜：部分 逆转录病毒 具有包膜， 由脂质和糖 蛋白组成， 保护病毒并 帮助病毒与 宿主细胞结 合
共用针头：共用注 射器或针头传播
30% 10%
55%
5%
母婴传播
1
途径：通过胎盘、产道或哺 乳等方式传播
2
风险：母婴传播是逆转录病 毒传播的主要途径之一
3
预防：采取母婴阻断措施， 降低母婴传播风险
4
治疗：针对母婴传播的逆转 录病毒感染者，进行抗病毒
治疗和免疫调节治疗
性接触传播
性接触：通过性行 为传播
逆转录病毒具有高度变异性，导致
01
治疗难度大
02
目前尚无特效药物，药物研发困难
病毒容易产生耐药性，需要不断研
03
发新药物
逆转录
合成DNA。 。 合成 • 以mRNA为模板，经逆转录合成的与 为模板， 为模板 mRNA碱基序列互补的 碱基序列互补的DNA链，称为 碱基序列互补的 链 互补DNA ( complementary DNA, 互补 cDNA)
复习思考题： 复习思考题： 1. 概念 （1）基因 ） （3）DNA的半保留复制 ） 的半保留复制 （5）冈崎片段 ） （7）Klenow片段 ） 片段 （9）端粒酶 ） （2）复制 ） （4）中心法则 ） （6）复制子 ） （8）端粒 ）
第五节
逆转录
逆转录 (reverse transcription)
为模板， 以RNA为模板，合成与其互补的 为模板 DNA的过程。 的过程。 的过程
逆转录酶 (依赖 依赖RNA的DNA聚合酶 聚合酶) 依赖 的 聚合酶
1. RNA指导的 指导的DNA聚合酶活性 指导的 聚合酶活性 2. RNA水解酶活性 水解酶活性 3. DNA指导的 指导的DNA聚合酶活性 指导பைடு நூலகம் 聚合酶活性
逆转录过程： 逆转录过程：
RNA 模板
DNA-RNA 杂化双链
单链 DNA
双链 DNA
逆转录酶催化的DNA合成反应也 逆转录酶催化的DNA合成反应也 DNA 是5´→3´方向。需要的引物是病毒本 →3´方向。需要的引物是病毒本 引物 身的一种tRNA。 身的一种tRNA。 tRNA
• 分子生物学研究可应用逆转录酶， 分子生物学研究可应用逆转录酶，
（10）逆转录（11）突变 ）逆转录（ ）
如何用实验证明DNA的半保留复制？ DNA的半保留复制 2. 如何用实验证明DNA的半保留复制？ 参与DNA复制的酶类有哪些？各有何作用？ DNA复制的酶类有哪些 3. 参与DNA复制的酶类有哪些？各有何作用？ 原核生物和真核生物的DNA DNA聚合酶有何区 4. 原核生物和真核生物的DNA聚合酶有何区 别？ 简述DNA复制的体系。 DNA复制的体系 5. 简述DNA复制的体系。 DNA复制和逆转录有何异同 复制和逆转录有何异同？ 6. DNA复制和逆转录有何异同？ 根据分子改变，突变分为哪几种？ 7. 根据分子改变，突变分为哪几种？ DNA损伤的修复方式有哪几种 损伤的修复方式有哪几种？ 8. DNA损伤的修复方式有哪几种？简述切除 修复的过程。 修复的过程。
逆转录的概念
逆转录的概念
逆转录是一种生物学过程，指的是将RNA模板转化为DNA
的过程。
在逆转录过程中，逆转录酶（reverse transcriptase）
催化RNA的逆转录反应，将RNA转录成为相应的DNA串。
这个过程与正常的转录过程相反，正常的转录过程是将DNA
模板转录为RNA。
逆转录在病毒和某些真核生物中普遍存在。
在病毒中，逆转录是病毒复制过程中的关键步骤。
病毒通过侵害寄主细胞，将其RNA转录成为DNA，并将这段DNA插入
寄主基因组中，从而在细胞分裂过程中被复制并传递给细胞的后代。
在某些真核生物中，逆转录也扮演着重要的角色。
例如，在人类体内，逆转录酶参与垂直传递病毒（如HIV）和转座子
（如长末端重复元件，也称为LINE和SINE）的遗传物质。
逆转录是重要的研究工具，可以用于合成cDNA（互补DNA），这是一种重要的实验室技术，用于将RNA转录为相
应的DNA，以便进行基因表达和功能研究。
此外，逆转录酶
还在分子生物学的研究中用于扩增和克隆基因序列。
医学微生物学第三十章逆转录病毒
目 录
• 逆转录病毒概述 • 逆转录病毒的结构与功能 • 逆转录病毒的复制与转录 • 逆转录病毒与宿主细胞相互作用 • 逆转录病毒的检测与诊断 • 逆转录病毒相关疾病与治疗策略
01 逆转录病毒概述
定义与分类
定义
逆转录病毒是一类RNA病毒，其复 制过程需要逆转录酶的参与，将 RNA逆转录为DNA后整合到宿主细 胞基因组中。
基因组结构与功能
基因组结构
逆转录病毒的基因组为单股正链RNA，具有独特的基因组结构，包括长末端重复序列（LTR）和编码 区。
功能
逆转录病毒的基因组在感染过程中发挥着重要作用。LTR序列在病毒整合到宿主细胞基因组时起到识 别和定位的作用，而编码区则负责编码病毒的结构蛋白和调节蛋白，参与病毒的复制和转录过程。
分子生物学检测方法
核酸扩增技术
利用逆转录病毒的核酸序列特异性，通过核 酸扩增技术如聚合酶链式反应（PCR）或实 时荧光定量PCR（RT-PCR）对病毒核酸进 行扩增和检测。该方法具有高灵敏度和高特 异性的优点，可用于病毒的早期诊断和定量 分析。
基因测序技术
通过对逆转录病毒的基因序列进行测序和分 析，可以了解病毒的基因型、变异情况和进 化趋势，为病毒的诊断、治疗和预防提供重
编码蛋白及其功能
Gag蛋白
是病毒的主要结构蛋白，参与病毒核 心的形成。
Pol蛋白
具有多种酶活性，包括逆转录酶、整 合酶和蛋白酶活性，参与病毒的复制 过程。
Env蛋白
是病毒包膜上的糖蛋白，负责与宿主 细胞受体结合，介导病毒进入细胞。
Tat蛋白和Rev蛋白
是病毒的调节蛋白，分别激活病毒基 因组的转录和调节病毒mRNA的转运 。
转录过程
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是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶 链扩增（PCR）相结合的技术。
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RT-PCR过程
• 首先经反转录将RNA逆转录成cDNA • 然后以cDNA为模板，PCR扩增合成目的
片段。
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模板RNA：
总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。
无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无 RNA酶和基因组 DNA的污染。
差异性条带的克隆、测序、分析， DNA及氨基酸序列联机检NA序列
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基因功能的鉴定： ① knock out ② dominant negative mutation ③ 原核系统或真核系统中的表达翻译。 ④ one hybrid判断出该基因的“启动”基因。 ⑤ two hybrid判断出该基因的产物的作用途径。
育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。
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DD法依赖三种技术：
（1）mRNA逆转录技术； （2）以特定引物进行的PCR技术； （3）DNA测序胶电泳技术。
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逆转录的原理和过程
逆转录的原理和过程
逆转录是一种生物学过程，它将RNA的信息转录回DNA形式。
逆转录的主要步骤包括：
1. 逆转录酶的结合：逆转录酶是一种特殊的酶，它能够将RNA 作为模板，合成相应的DNA链。
逆转录酶首先与RNA结合，形成一个RNA-酶复合物。
2. RNA链的降解：RNA链在逆转录酶的作用下被降解，生成单链RNA和DNA链的杂交。
3. DNA链合成：逆转录酶利用RNA链作为模板，合成相应的DNA 链。
它通过在RNA链的3"端引导DNA链的合成，逐渐延伸DNA链。
4. RNA链的去除：逆转录酶具有核酸酶活性，它可以将合成的RNA链去除。
5. DNA链的延伸：逆转录酶继续合成DNA链，直到达到整个RNA 链的末端。
6. DNA链的修复：在逆转录过程中，DNA链可能会受到一些损伤，逆转录酶会对DNA链进行修复，确保其完整性。
通过逆转录，RNA的信息可以被转录回DNA的形式，这个过程在一些病毒和真核生物的某些细胞类型中发生。
逆转录是一种重要的机制，它使得RNA能够在转录后被稳定保存，并可以在需要时转录回DNA形式。
逆转录的模板
逆转录的模板逆转录是一种生物学过程，它将RNA转录成DNA。
这个过程在病毒、真核生物和原核生物中都有发现。
逆转录酶是完成这个过程的主要酶类。
本文将详细介绍逆转录的定义、机制、应用以及相关技术。
一、定义1. 逆转录的概念逆转录是指将RNA模板反向转录成DNA的过程。
这个过程由逆转录酶催化完成。
2. 逆转录酶的特点逆转录酶是一种特殊的RNA依赖性DNA聚合酶。
它具有以下特点：（1）能够识别RNA模板并合成相应的DNA链；（2）能够利用RNA为模板合成单链或双链DNA；（3）具有核酸水解酶活性，可切割RNA或DNA链；（4）具有多种修复和修剪功能，可保证DNA复制准确性。
二、机制1. 逆转录的步骤逆转录包括以下几个步骤：（1）将RNA模板与逆转录酶结合形成复合物；（2）逆转录酶利用RNA作为模板合成单链cDNA；（3）逆转录酶利用RNA作为模板合成另一条cDNA链，形成双链cDNA；（4）逆转录酶切割RNA模板，并在DNA链上填补缺失的核苷酸；（5）逆转录酶利用DNA为模板合成第二条DNA链，形成完整的双链DNA。
2. 逆转录的影响因素逆转录的效率和准确性受到多种因素的影响，如：（1）RNA模板的结构和序列；（2）逆转录酶的活性和特异性；（3）反应条件，如温度、pH值、离子浓度等。
三、应用1. 逆转录在研究中的应用逆转录广泛应用于研究中，如：（1）mRNA检测：利用RT-PCR技术检测mRNA水平；（2）基因克隆：将mRNA反向转录成cDNA作为基因克隆的起始材料；（3）基因表达分析：研究基因表达调控机制等。
2. 逆转录在临床中的应用逆转录也有着广泛的临床应用，如：（1）病毒检测：利用逆转录将病毒RNA转录成cDNA，从而检测病毒感染；（2）肿瘤诊断：利用RT-PCR技术检测癌细胞中的特定基因表达水平。
四、相关技术1. RT-PCR技术RT-PCR是一种将RNA反向转录成cDNA，再利用PCR技术扩增目标序列的方法。
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逆转录-聚合酶链反应中文实验方法
作者：佚名来源：本站原创 2004-12-20点击：6478 【字体：小大】
逆转录-聚合酶链反应
逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR使RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
一、反转录酶的选择
1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。
最适作用温度为37℃。
2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。
最适作用温度为4 2℃。
3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Super script 和SuperScriptⅡ。
此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
二、合成cDNA引物的选择
1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cD NA中96%来源于rRNA。
2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。
由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的
cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。
用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。
二、试剂准备
1．RMA提取试剂
2．第一链cDNA合成试剂盒
3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
4．Taq DNA聚合酶
三、操作步骤
1. 总RNA的提取：见相关内容。
2. cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。
现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
（1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。
在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，轻轻混匀、离心。
（2）70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。
然后加入下列试剂的混合物：
10×PCR buffer 2μl
25mM MgCl2 2μl
10mM dNTPmix 1μl
0.1M DTT 2μl
轻轻混匀，离心。
42℃孵育2-5min。
（3）加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。
（4）于70℃加热15min以终止反应。
（5）将管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解残留的RNA。
-20℃保存备用。
3．PCR：
（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：
第一链cDNA 2μl
上游引物（10pM）2μl
下游引物（10pM）2μl
dNTP(2mM) 4μl
10×PCR buffer 5μl
Taq 酶（2u/μl）1μl
（２）加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。
轻轻混匀，离心。
（３）设定PCR程序。
在适当的温度参数下扩增28-32个循环。
为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。
（４）电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
（５）密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。
四、注意事项
1．在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。
在总RNA的提取过程中，注意避免m RNA的断裂。
2．为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。
3．内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。
常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。
其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。
4．PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DN A起始的数量有关。
故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。
5．防止DNA的污染：
（１）采用DNA酶处理RNA样品。
（２）在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。