抑制差减杂交技术原理及常见操作结果分析
抑制性消减杂交(SSH)技术及其应用
抑 制 性 消 减 杂 交 技 术
（ｕｐ ｅｓｏ Ｓ ｐｒ ｓ ｉｎ
１３ 将 ｔ ｓ ｅ Ｄ Ａ分成 两组 （ 和 ２ ，分 别于其 ． ｅｔｒｃＮ １ ）
Ｓ ｂ ｒ ｃ ｉ ｅ Ｈ ｂ ｉ ｉ ａ ｉ ｎＳ Ｈ 是 Ｄ ａ ｃ ｅ ｋ ｕ ｔ ａ ｔ ｖ ｙ ｒ ｄ ｚ ｔ ｏ ，Ｓ ） ｉ ｔｈｎ ｏ
一
阳性率低 、 筛选效 率高 、 操作 简单等优 点 ， 别适用 于 特 克 隆分析造成 某种特 殊表型 的 目相 同但 在
短链 （ １ 约 ０余个核苷 酸 ） 组成 的双链 ＤＡ片 段 ， Ｎ 长
同， 内侧序 列与第二次 Ｐ Ｒ引物序列 相 同。 外 ， 而 Ｃ 此 在
［ 摘
要］ 制性消减杂交技术 （Ｓ ） 抑 Ｓ Ｈ 是一种高效检测差异表达基 因的方法 。 详细论述了抑制性消减杂交的基本原理及过程，
并简要介绍了其在工业生产菌种改 良中的应用 。 ［ 关键词］ 抑制性消减 中 ８ ［ 文献 标 识 码 ］ Ａ ［ 章编 号 ］ １ ０ — ０ ５ ２０ ） ７０ ３ － ３ 文 ０ ３ ５ ９ （０ ８ ０ － ０ １０
５ 端接上 去磷酸 化 的接 头 １ 接 头 ２ （ｄ ｐｏ ， 和 ａ ａｔｒ １
等于 １９ 依据 消减杂 交和 抑制 Ｐ Ｒ发 展起 来 的 ９６年 Ｃ
一
种 分 离差 异表 达 基 因的新 方 法 ［３该 技术 具 有假 ， ２
ａａ ｔｒ２。 ｄｐ ｏ ） 两接头分别是具有一段反向末端重复序 列 的寡核苷 酸序 列 ， 由一长链 （ ４ 约 ０余个 核苷酸 ） 和
含有 目的基 因的样 品称 为试验方 （ｅ ｔ ｒ 。 Ｔ ｓ ｅ ）
除接 头不 同外 是完 全同源 的， 然形成 ａｂＣｄ但第 仍 ，、、，
抑制性减法杂交技术
抑制性减法杂交技术1996年，L. Diatchebko在RDA的基础上建立了抑制性减法杂交（supression subtractive hybridization, SSH）技术，该技术是RDA技术的发展，能有效克服RDA或cDNA RDA技术难以解决的问题，如两者不能用于分离两组基因表达差异较小的基因，也不能用于研究存在上调表达的基因等。
(1) SSH的主要原理SSH的核心技术是抑制性PCR (suppression PCR )，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。
其中标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。
因此SSH显著增加了获得低丰度表达差异cDNA的概率，简化了对消减文库的分析。
抑制PCR是利用链内复性优先于链间复性的原理，使非目标序列片段两端的长反向重复序列(long inverted repeats)在复性时产生“锅柄样”(panhandle-like）结构或“发夹结构”而无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。
同时，根据杂交的二级动力学原理，丰度高的单链cDNA复性时产生同源杂交速度要快于丰度低的单链cDNA，从而使得丰度存在差异的cDNA相对含量趋于基本一致。
（2）SSH的基本过程如图所示，SSH的主要步骤包括：限制性核酸内切酶切割，产生大小适当的平头末端cDNA片段。
②将检测cDNA分成均等的两份，分别接上接头1或接头2,接头（adaptor)由一长链(40nt)和一短链(l0nt)组成的一端是平末端的双链cDNA分子。
长链3′端与cDNA5′端相连。
长链外侧序列（约20nt）与第一次PCR引物序列相同，内侧序列则与第二次PCR引物序列相同。
此外，接头上含有升启动子序列及内切酶识别位点（如Not I, Srf I, Sma I和Xba I等），为以后将该片段插入克隆载体和测序提供便利。
抑制消减杂交(SSH)技术的研究与应用
Ｈ ｉ ｎ ｊ ｎ ｎｍ ｌ ｃ ｎ ｅ ｅ ｏ ｇｉ ｇＡ ｉ ａ Ｓ ｉ ｃ ｌ ａ ｅ
ａ ｄ Ｖｅｅｉ ａｙＭｅ ｉｉｅ ｎ ｔｒ ｒ ｄｃｎ ｎ № ２ ２０ ０８
近。 由于 Ｖ Ｐ 在 立 体 结 构 上 与 天 然 病 毒 相 同或 类 Ｌｓ 似， 因此 Ｖ Ｐ Ｌ ｓ能激 发 体 液 免疫 、 细胞 免 疫 和黏 膜 免 疫， 具有 安全 、 高效 的特 点 ， 是很 有发 展前 景 的候 选疫 苗 。但 是 ， 目前 Ｖ Ｐ 主要 通 过基 因工 程 手 段从 酵母 Ｌｓ 或感染重 组杆状 病毒 的昆虫细 胞 中制备 ， 这对操 作者 有 较高 的要求 和较复杂 的试验 操作 条件 。 ３ 利用 反 向遗传 操作 技术制 备的疫 苗
随着 人类 基 因组 计 划 的完 成 及后 基 因组 计划 的 启 动 ， 异基 因表达就 成 了一 项热 门 的技 术 。由于分 差
工程疫 苗及 反 向遗 传疫苗 并存应 用 的局 面。
参 考文献 ：
［ ］ 丁壮 ， １ 金宁一 ， 王兴 龙 ， 鸡 新城疫病毒 Ｈ 等． Ｎ基因亚单 位疫苗
诱导免疫保护 的试验 研究 ［ ］ Ｊ ．动物 医学进 展 ，０ ２ ２ （ ） ２０ ，３ １ ：
４ —５ ． ９ １
清学 方法 无 法 区 别 是疫 苗 株 还 是 野 毒 株 感 染 所 致 。 因此通过 改变免疫 原蛋 白的某 些 中和表 位 ， 构建一 个 能用 合适 的血 清 学 方法 鉴 别 的疫 苗 是 十分 必 要 的 。 Ｐｅｅ ｅｔｓＢＰ等人 通过 反 向遗传 操作 构建 了 Ｎ Ｖ感 染 ｒ Ｄ
３ １ 卵内免疫 疫苗 ．
其 表达外 源基 因 ， 诱 发 对 载体 和表 达基 因的 免疫 。 来 葛金英 等人利 用反 向遗传 操作 技术 以 Ｎ Ｖ 的 ＬＳｔ Ｄ ａｏ ａ 疫 苗株 为载体 ， 入 Ｈ ＡＶ 的 Ｈ Ｎ 插 ＰＩ ５ １株 Ｈ Ａ基 因 ． 研
抑制性消减杂交技术的应用[1]
![抑制性消减杂交技术的应用[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/a11ab97801f69e3143329423.png)
・技术与方法・生物技术通报B I O TECHNOLOGY BULL ET I N2009年第5期抑制性消减杂交技术的应用李小庆 景志忠(中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室,兰州730046) 摘 要: 基因的差异表达是调控各种生命活动的核心分子机制,而分离、克隆并进一步研究差异表达基因已成为现代分子生物学研究的热点,也是功能基因组学研究的重要内容。
在研究差异表达基因的诸多项技术中,抑制性消减杂交(SSH )技术具有特异性强、假阳性率低、灵敏度高和快速简便等优点,被广泛地应用于生命科学和医学领域的基因差异表达的研究中。
近年来,抑制性消减杂交(SSH )技术得到了相应的改进和完善,而在许多研究领域,该技术在广度和深度上都有了一些新进展。
主要就抑制性消减杂交技术的产生背景、原理、技术流程、特点及其最新应用研究进展等方面作简要综述。
关键词: 抑制性消减杂交 差异表达 功能基因 DS N 均一化技术 c DNA 微阵列Suppressi on Subtracti ve Hybr i di zati on Techn i que andProgress i n the Appli cati onL i Xiaoqing Jing Zhizhong(Lanzhou Veterinary R esearch Institute CAAS,Key Laboratory of Ani m al Parasitology of Gansu P rovince,Key Laboratory of Veterinary PublicHealth of M inistry of Agriculture,S tate Key Laboratory of Veterinary E tiological B iology,Lanzhou 730046) Ab s trac t: D ifferential exp ressi on of genes is the centralmolecular mechanis m of regulating all kinds of life acti ons 1Among all thetechnol ogies of identifying differential exp ressed genes,supp ressi on subtractive hybridizati on (SSH )is considered t o be with high s peci 2ficity,l ow backgr ound,high sensitivity,convenient mani pulati on,and had been widely app lied in life science and medicine research fields 1I n this paper,the p rinci p le,method,characteristics and the research p r ogress of SSH technique were intr oduced 1Key wo rd s: Supp ressi on subtractive hybridizati on D ifferential exp ressi on Functi onal genes DS N (dup lex 2s pecific nuclease )2nor malizati on method c DNA m icr oarray收稿日期:2008211211基金项目:国家自然科学基金项目(30871884),国家高新技术“863”项目(2006AA10A203),甘肃省支撑计划项目(0804NKCA076)作者简介:李小庆(19832),男,硕士,专业方向:畜禽疫病的分子生物学与免疫学通讯作者:景志忠,博士,研究员,主要从事病原与宿主的分子生物学与免疫学研究;E 2mail:zhizhongj@yahoo 1com 1cn 上世纪90年代以来,随着分子生物学技术的快速发展以及多物种包括人类的基因组全序列测定计划的陆续完成,分子生物学的研究热点已经从结构基因组研究转向基因功能和表达调控的功能基因组研究,于是多种用于差异表达分析的基因克隆技术相继问世。
抑制性差减杂交技术_SSH_在植物学研究中的应用
抑制性差减杂交技术( SSH) 在植物学研究中的应用
阎爱华, 王冬梅
( 河北农业大学 生命科学学院, 河北 保定 071001)
摘要 : 抑制性差减杂交是一种基于转录水平的杂交技术, 能将差异表达 基因扩增 千倍后富集, 具有 高效、灵 敏、操 作简单, 假阳性率低等特点, 已经越来越多的被应用在植物学研究领域。就该 技术的原理、特点 及其在植物 学方面的 应用研究进展作一简要介绍。
DNA 微阵列技术 DNA microarray
巨克隆技术 M egaclone
将基因片段、寡聚核苷酸、cDNA 等固定 在硅质、塑料、玻 璃或尼龙膜 上, 用不 同组 织或 来源 的 mRNA 制 成探 针, 与芯片杂 交, 根 据信 号 查找 差 异 片段 并 进行 克 隆 和分 析。 cDNA 连上不 同的标签 ( tag ) , 与 带有 antitag 的 microbeads 杂交, 固定 cDNA, 并 且每 个 microbead 上 只与 一个 c。
基因差异表达分析方法
Methods of different gene expression techniques
基本原理
The basic principles of different gene expression techniques
优点 Advantage
缺点 Disadvantage
mRNA 差异显示 PCR mRNA differential display
收稿日期: 2008- 08- 11 基金项目: 国家自然科学基金资助项目( 30671244) ; 河北省应有基础研究计 划重点基础研究 项目资助( 08965505D) ; 河北省自然科 学基金
抑制性消减杂交技术介绍
M: ФX174-Hea Ⅲ消化。 1: 杂交骨骼肌肉tester二次PCR产物 2 : 未杂交的骨骼肌肉tester
18
G3PDH基因得到了极大的扣除
January 17, 2020
•
差异表达基因的富集与看家基因的扣除
以2ug/ml PHA和2ng/ml PMA处理72小时后的人类Jurkat T细胞的cDNA作 为Tester ，未处理的cDNA作为Driver。Tester cDNA、Driver cDNA及消减 后的cDNA扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳（每个孔上样量为 0.3ug）并转移到尼龙膜上，分别与已知活性的IL-2Rα基因和看家基因 G3PDH核酸探针进行杂交。
•
抑制后的应答基因 鉴定抗病毒相关基因 ......
6
January 17, 2020
•
抑制性消减杂交实验方法
正向消减
Tester
处理组
反向消减 Driver
Driver
7
非处理组
Tester
January 17, 2020
抑制性消减杂交
主要内容
1 抑制性差减杂交技术概 述
2 抑制性差减杂交原理
3 抑制性差减杂交流程
4
2
January 17, 2020
•
抑制差减杂交技术SSH
定义：抑制差减杂交（SSH）SSH 是一种基于抑制PCR和差减杂交 技术建立的,在转录水平上研究基 因表达的技术。
3
January 17, 2020
12
A, B, C, D
A B C
E
末端补齐
D
EE
January 17, 2020
•
实验流程
抑制性消减杂交技术(SSH)及其在烟草生物学研究中的应用
科学研究表明， 因的选择性差异表达决定植 基 物的生长 、发育、衰老、死亡 、对逆境 的适应等生 理过程 。分离差异表达基因对于了解和揭示植物体 的生长 、发育规律 ， 进而有针对性地对生物性状进 行改良具有重要意义。近年来随着 Ｐ Ｒ 技术 的兴 Ｃ 起， 出现了许多基于 Ｐ Ｒ的分离差别表达基因的新 Ｃ
由于速度快 、假阳性率低 、灵敏度高等优点 ，现 已 广泛应用于植物学研究 的各个领域【 ６ 】 。烟草是我 国
重要 的经济作物之一 ，面积 和总产量都 居世界第
一
。
与此 同时，它作为模式植物 ， 在植物学的研究
领域具有重要 的科研意义 ，尤其是在遗传 、繁育、
生理、 生化和转基 因等研究领域 。 笔者就 Ｓ Ｈ技术 Ｓ
Ｒｅ ｅ ｃ ｓ ａｒ ｈ
ＬＩＬｉ ｎ． ｑｉ ＬＵ ｍｉ Ｌｉ ｎｇ
（ ｒ ｎ ｍｙＣ ｌ ｇ ｆ ｉｈ ａ ｒ ｕｔｒｌ ｎ ｖ ｒ ｔ， ａ ａ ， ｉ ｕ ２ ０ ４ Ｃ ｉａ Ａｇｏ ｏ ｏｌ ｅ ｃ ｕ ｎ ｉ ｌ ａ Ｕ ｉｅｓ ｙ Ｙ ’ Ｓｃ ａ ６ ５ １ ， ｈｎ ） ｅ ｏＳ Ａｇ ｃ ｕ ｉ ｎ ｈｎ Ａｂ ｔａ ｔ Ａ ｎ ｗ ｍｅ ｏ ，ｅｍｅ ｐ ｒｓｉｎｓ ｂｒｃｉｅ ｙ ｒ ｉ ｔ ｎ（ Ｓ ， ａ ｅ ｎｄ ｖ ｌｐ ｄｂ ｓｄｐ ｍａ ｌ ｎｔｅ ｅ ｈ ｉｕ ｓ ｒ ｃ ： ｅ ｔ ｄ ｔｒ ｄｓ ｐ ｅ ｓ ｔ ｔ ｂ ｄｚ ｉ Ｓ Ｈ）ｈ ｓ ｅ ｅ ｅｏ ｅ ａ ｅ ｒ ｒ ｙｏ ｃ ｎｑ ｅ ｈ ｕ ｏ ｕ ａ ｖ ｈ ｉ ａｏ ｂ ｉ ｉ ｈ ｔ
Ｄ Ｉ ０ ９９ ．ｓ． ０—１９ ０１ ３ １ Ｏ ：１． ６￣ｉ ｎ ０７５ １． １． ． ９ ３ ｓ １ ２ ００
差减杂交的基本原理
抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)技术是1996 年Diatchenko 等人发明的一种快速分离两种材料中差异表达基因的强有力技术，是以抑制PCR(suppression PCR)和差减杂交技术为基础，将标准化检测子cDNA 单链步骤和差减步骤合为一体的技术。
在众多差别表达基因的筛选方法中，以较为简单，假阳性低等众多的优点脱颖而出，近年来该技术在植物，动物差异表达基因的筛选中得到了最为广泛的应用，受到越来越多的重视。
运用差减杂交的方法可以用来进行两种材料中差异表达基因的分析，用来克隆缺失或突变的基因，差减杂交尤其较适合运用在一些基因组信息较为不清楚的物种上，从而分离到一些未知功能的新基因。
因此差减杂交可以为我们进一步研究差异基因或寻找新的功能基因提供基础。
它的主要原理是首先将两个真核生物mRNA样本均转化为cDNA，我们将需要检测的物种cDNA 设为“tester”，将作为对照的物种cDNA 设定为称为“driver”，通过两轮杂交，将表达没有差异的基因消减下去，差异的基因被大量富集，然后经过两轮抑致性PCR将差异的基因扩增出来。
首先将待检测的样品(Tester)和对照样品(Driver)中的总RNA 提取出来，分离出mRNA，然后将分离出的Tester和Driver中的总的mRNA合成为cDNA。
再把由mRNA 逆转录来的检测子cDNA(Tester)和驱动子cDNA(Driver)分别用同一种识别四碱基序列的限制性内切酶RsaI 消化。
一般选用Rsa I 或HaeIII 两种限制性内切酶对cDNA进行酶切，产生大小适当的末端为平头的片段。
识别四碱基酶切位点的RsaI内切酶是最为常用的内切酶，因为RsaI 酶切识别位点在基因组中相对较少，酶切后产生的片段较大。
因而既减少了基因组cDNA的复杂性，又提高了每个基因的代表性，这样可以形成适当长度平末端的cDNA片段。
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将RsaI酶切完全的cDNA用adapter1和adapter2R两 种接头连接。通过PCR扩增检测连接效率。 PCR的引物根据RsaI位点和adapter1、adapter2R 的序列设计。这一般要求扩增的片段中不含RsaI 位点序列。在扩增后琼脂糖胶电泳检测结果中, 如果用一个基因特异性引物和一个接头引物所得 到的带亮度与两个基因特异性引物所得到的带的 亮度一致,说明连接较好;如果用一个基因特异性 引物和一个接头引物所得到的带亮度只有两个基 因特异性引物所得到的带的亮度的25%,则说明连 接效率不到25%,应检查RsaI酶切效果并重新连接。
3 抑制差减杂交技术的优缺点
3.1 与其他几种方法相比,SSH技术具有较明显的优越性: (1)通过两步消减杂交和两次抑制PCR可DDRTPCR和cDNA-RDA法中,低丰度的 mRNA一般不易被检测到,SSH方法所做的均等化和目 标片段的富集,保证了低丰度mRNA 也可被检测出。 (3)速度快,效率高。一次SSH反应可 以同时分离几十或成百个差异表 达基因。
抑制差减杂交技术原理 及常见操作结果分析
摘要
抑制差减杂交 (SuppressionSubtractiveHybridization,SSH)是一种 高效鉴定和分离克隆差异表达基因的新技术。 目前,该技术在分子生物学研究的各个领域得 到了广泛的应用作了较全面的介绍,可为研究者们 提供参考。
2.4 第一次杂交、第二次杂交和PCR扩增
将经RsaI消化的drivercDNA和分别连接有adapter1、 adapter2R的testercDNA混合进行第一次杂交。再将第一次 杂交的两个样本混合在一起,同时加入新鲜的drivercDNA, 以进一步富集差异表达序列。在两端具不同接头的差异 表达的cDNA形成新的杂交分子。
先将差异表达的cDNA杂交分子的接头缺失部 分补平,进行第一轮扩增。在第一轮扩增中,仅具 有不同接头的双链cDNA分子能指数增长。接 着通过巢式PCR可进一步降低背景,且富集差异 表达的序列,不同丰度的差异表达的转录物也得 到了平衡化。通过电泳检测第二次PCR的效率。 未克隆净,则说明有DNA、蛋白质或 多糖污染,应进一步纯化。如果亮度呈:28s<18s<5s, 则说明RNA发生了降解。RNA的纯度还可以通过 分光光度计测定在26nm和28nm下的OD值来确定。 如果在260nm和280nm下的OD值之比为1.7～2.0,说 明RNA较纯;如果比值小于1.7～2.0,说明样品中有 蛋白质或多酚污染。 在分离mRNA之前,首先测定RNA在260nm下的 OD值,计算RNA的浓度。然后按Oligotex mRNAS pin-Column试剂盒从总RNA中分离mRNA。mRNA 分离出来后,与分离剩余物同时点样,进行1×TAE 琼脂糖胶电泳,可以见到:分离的mRNA在18s和28s 之间呈较亮的smear;而剩余物则表现为18s和28s两 条亮带。2.5 差减的构建与Tester特异序列的验证
将扩增的差减cDNA插入T/A克隆载体,用NotI位点(SmaI, XmaI)在接头1和EagI位点在接头2R处作位点特异性克隆,或 用RsaI位点在析和差异筛选来 验证PCR扩增,点膜,分别用标记的Tester和DrivecDNA作探针 进行点杂交。 凡只与TestercDNA有杂交信号而 与Driverc DNA无杂交的克隆,即为含 Test0%以上。
生物的生长、发育、代谢、繁殖和死亡等生命活动 都是由不同的基因表达来控制的,一般认为某一时期的表 达基因的数量约为全部基因的1.5%,所以基因的表达具有 时空性和组织特异性。研究基因的差异表达,可探究造成 生物细胞表型差异的遗传原因,提供研究复杂生命过程的 基本信息。 研究差异表达基因的方法很多,如组织或特异时期的 同工酶谱分析、差减杂交(subtractivehybridization, SH)、 mRNA差别显示法(differentialdisplay,DD)、代表性序列差 别分析(representationaldifferenceanalysis,RDA)和抑制差减 杂交技术(suppressionsubtractivehybridization,SSH)。 近年来,抑制差减杂交技术(SSH)以其高效便捷和低假 阳性的优越性受到广大研究人员的重视,已在分子生物学 的各个领域得到了广泛的应用。
2.2 cDNA的合成
cDNA两条链的合成用Clontech PCRSelectcDNASubtractionKit(试剂盒)来完成。
2.3 RsaI消化和adapter1、adapter2R的连接
用RsaI酶切合成的cDNA可产生短的双链平末端cDNA 片段。检测酶切效果。取0.2μg未经酶切的cDNA和5μl用 RsaI消化的cDNA进行琼脂糖胶电泳(1%),前者为接近点样 孔的高分子量带,后者为0.1～2kb之间的smear。如果用RsaI 消化后的cDNA未变小或仍大于2kb,说明酶切效率不高,可 能是cDNA中不含有RsaI的酶切位点或cDNA中混有酶的抑 制剂。可以考虑选择HaeIII或AluI或其他六碱基位点的酶。 如果是杂质污染,可以用氯仿/酚抽提纯化。
2 抑制差减杂交技术流程及常见操作结果分析 2.1 RNA的抽提和mRNA的分离纯化
对植物材料而言,RNA的抽提一般有两种方法,其一是 异硫氢酸胍法,其二是酚/SDS法。提取的RNA的质量, 可通过1×TAE琼脂糖胶电泳和分光光度计检测。对于 高质量的RNA,胶电泳呈三条带:28s、18s和5s,点样孔干 净,且三条带的亮度呈:28s>同来源组织的mRNA(tester和driver),反转录成 cDNA,用4碱基识别酶(RsaI)或HaeIII酶切两种cDNA产生平端片 段;将testerc DNA分成均等的两份,分别接上dapter1和adapter2两 种接头,并与过量的经RsaI消化的driver样本变性后退火杂交。 第一次杂交后有4种产物:a是单链testercDNA;b是自身退火的 testercDNA双链;c是tester和driver的异源双链;d是drivercDNA。 根据复性动力学原理,丰度高的单链cDNA退火时产生同源杂交 速度快于丰度低的单链cDNA,因此第一次杂交使得丰度有差别 的cDNA的单链分子的相对含量趋向一致。 混合两份杂交样品,同时加入新的变性driver cDNA 进行第二 次消减杂交。杂交完全后补平末端,加入合适引物(即adapter1和 adapter2的部分特异序列)进行PCR扩增,只有含不同接头的双链 DNA分子(e)才可进行指数扩增,扩增产物即为目的片段。利用 adapter上的酶切位点可进行克隆、测序等。
抑制差减杂交技术原理及 常见操作结果分析
3 .2抑制差减杂交技术的缺点 SSH也存在一定的缺点: 所得到的差异cDNA是限制消化的c而且对于组成型表达的目的基因筛选效果不好。
抑制差减杂交技术原理及 常见操作结果分析
1 抑制差减杂交技术原理
抑制差减杂交技术(SSH)是由 Diatchenko等建立的以抑制性PCR和 DNA差减杂交方法相结合的方法。其 依 据 的 主 要 技 术 有 两 点 : (1)消减杂交; (2)抑制PCR。 经抑制差减杂交后的cDNA群体不 仅富集了差异表达基因(目的基因),而 且目的基因间丰度的差异经过均等化 作用已基本消除,使消减后的cDNA群 体为丰度一致的目的基因群体。
巢式PCR:
巢式聚合酶链反应(nested polymearse chain reaction, nPCR)也称套式PCR。在这种技术中，首 先用一对外引物进行第1轮PCR，然后再使用第1 对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩 增，所以称为巢式PCR。由于使用了两对引物并 且进行了两轮扩增反应，因此试验的敏感性和特 异性均增强。在一定情况下，这种方法对减少 PCR后扩增产物的污染问题极为有用，但它增加 了每次试验的复杂性。为了经济节约，可在第2 轮扩增时采用半巢式，设计单条引物，另一条引 物与第1轮扩增共用，效果也优于单次扩增。一 般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体， HIV，肿瘤基因等 。