CRISPR-Cas技术

基因敲出：如向受精卵中注射Cas9mRNA和 sgRNA、构建gRNA-Cas质粒结合非同达调控：改造成转录激活因子、转录抑制因 子等调节蛋白对基因表达进行调控。如使Cas9两个 活性位点突变形成dCas9，dCas9不切割DNA，而 是引导抑制因子或转录因子的结合到靶位点上，从 而达到抑制基因的表达或激活基因的表达。目标位 置可以是启动子区域、调控区域或早期编码区域。
在真核生物中DSB （DNA双链切口）可被两种不同的机体自身 修复机制修复DSB——非同源性末端连接（NHEJ）和同源重组 （ HDR）进行修复。NHEJ能够高效地引入不同长度的插入或 缺失突变（indel），产生由于移码突变而导致的基因功能受 损，多用于细胞或动物模型中的基因敲除、功能基因组的筛 查、转录调控和基因沉默的研究；HDR以DNA结构的同源性为 基础，修复会带入特定位点的突变或在外源DNA供体模板存在 下对靶点形成可预测的插入.此外还有一种微生物学介导的末 端连接，这种在实验中比较少应用。 除了DSB，实验时也能利用Cas9突变的“切口酶”形成单链切 口（Nick），可通过同源重组（ HDR）进行修复，以完整的 链为模板修复缺口。
基于CRISPR-Cas基因保守型和位点构成的 不同，可分为TypeⅠ、TypeⅡ 、TypeⅢ三 种类型。 TypeⅠ和Ⅲ 行较为复杂，Ⅰ类的特征蛋白 是Cas3，在细菌和古生菌中都有。 Ⅲ类的 有Cas6和Cas10两种酶。 TypeⅡ系统较简单只存在与细菌，主要是 Cas9酶介导降解外源基因和crRNA的成熟。 CRISPR-Cas系统目前广泛应用，由系统 Ⅱ改造而的，为第三代人工核酸内切酶，比 第一代（ZFN）和第二代（TALEN）的人工 核酸内切酶操作更加简单、修饰更为精确、 且成本低。
实验思路
选着合适的载 体
选择表达系统 和传递方式
是全基因操作 还是单基因操 作？
设计gRNA并 进行克隆
传递CRISPR 组件 和验证你 的基因组编辑
用CRISPR-Cas9技术筛选跟肿 瘤转移密切相关的基因
以高度转移的肿瘤细胞株作为模式细胞， 筛选跟肿瘤转移密ISPR/Cas9系统是一特殊的DNA重复序列家族，又命名为成簇的、规 律间隔的、短回文、重复序列，是目前用于基因敲除、点突变、基因插入、 基因修复等基因编辑方面的新方法。 CRISPR/Cass系统是从细菌和古生菌内发现的，它参与细菌的免疫过程， 抵挡外源遗传物质的侵袭，是一种后天获得的防御系统。 以往的基因编辑技术（ZFN/TALEN）一次只能编辑一个基因，并且耗时 耗力。 CRISPR/Cas9 技术最大的优势就在于一次可以编辑很多个基因位 点，只需设计多个不同的 g RNA，它可以介导 Cas9 核酸酶进行多靶点基 因编辑 。 CRISPR/Cas9 技术可以通过核酸之间的相互识别，防止 DNA 甲基化对 基因编辑的干扰。编辑效率显著高于ZFN/和ALEN。且不需要反复设计核 算内切酶载体，操作简单。
实验过程
① 以质粒毒中。 ④ 转染细胞时，腺病毒会把质粒传递到细胞中。
构建reporter腺病毒载体:把荧光蛋白报告基因 （FP）整合到腺病毒上合成报告因子，载体 中需要包含有包含有Cas9和报告基因。表达 形成Cas9-FP复合物，gRNA序列会将dCas9FP融合物导向特定的基因组序列。（荧光蛋白
2
1
Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA的引导下切割 靶位点， Cas9 具有 HNH 和 Ruv C 两结构域，都可以切割 DNA，其中 HNH 结构域切割互补的 DNA 链，Ruv C 切割非互 补的 DNA 链。Cas9切割双链时无特异性，可作用于任何基因。
CRISPR之间的间隔区转录成前体cr-RNA（pre-crRNA）， 经核酸酶切割成熟，与tracr RNA结合成sgRNA，sgRNA具 有特异性，作用于特定的基因序列。 实验时只需要改造CRISPR的部分序列，就可以得到针对特 定基因的CRISPR/Cas系统。
实验过程
基因测序，以没转染的细胞做空白对照，检 测突变细胞序列的突变情况。 提取突变细胞的蛋白质。 通过Western blose验证突变细胞的蛋白质表 达情况。 筛选出gRNA高表达的成功敲除的肿瘤细胞。 用Transwell侵袭实验检测突变的肿瘤细胞和 没突变的肿瘤细胞的迁移能力。
前导区调控细菌CRISPR之间的间隔 区转录为前体crRNA，反式激活 cr RNA（tracr RNA）与 pre-cr RNA 重 复序列互补介导核酸酶 Rnase III 对 pre-cr RNA 进行加工处理，切割成 成熟crRNA。
crRNA 和tracrRNA结合成sgRNA，指 导Cas9对外源基因进行切割。Cas9识 别目的基因中的PAM片段，而crRNA识 别ＰＡＭ 的５′端互补的20bp的DNA序 列片段（外源DNA），使基因组与 Cas9稳定结合，从而对靶位点进行切割， 基因组双链发生断裂，形成双链缺口 （DSB）。
实验过程 制备高度转移的肿瘤单细胞悬液。
载体和gRNA载体可通过addgene网站获取）
用构建好的gRNA腺病毒转染肿瘤细胞。 在培养基中加入嘌呤毒素筛选出转染成功的 细胞。 裂解细胞提取质粒DNA。 通过酶切电泳鉴定和DNA测序鉴定。
实验过程
把构建好的reporter载体转染到筛选出来的肿 瘤细胞中，以reporter转染空肿瘤细胞做空白 对照。 培养一段时间后，通过荧光显微镜观察细胞 荧光表达情况。 制备单细胞悬液。 用流式细胞仪分选出突变的细胞并进行扩大 培养。 对发生突变的细胞进行单克隆培养。 提突变的肿瘤细胞基因组DNA。 PCR扩增。
1
CRISPR-Cas系统包括不连续的重复序列 （Repeats）、间隔序列（Spacers）间隔 排列成CRISPR簇、前导序列（L）和编码 Cas酶的基因、tracrRNA基因。
Repeaeas两端序列是严格保守的分别为ＧＴＴＴ／ Ｇ和ＧＡＡＡＣ／Ｇ，能使转录岀的RNA二级结构 保持稳定。 Spacers均为外源的DNA插入。前导序 列可能在插入新的Spacers时起到识别作用或者作为 转录CRISPR的启动子。
CRISPR/Cas9 来源于细菌免疫系统，经过人 为改造后，可在真核细胞中实现高度灵活且特 异的基因组编辑。CRISPR /Cas9 系统是一种 后天免疫防御系统，用以保护细菌或古细菌免 受外来质粒或噬菌体的侵入。当病毒首次入侵 时，细菌会整合病毒基因到CRISPR的间隔区， 当再次入侵时，CRISPR转录相应的crRNA， crRNA与病毒基因的同源序列结合，介导Cas 酶切割病毒基因，从而保护自己。
2
3
crRNA与tracrRNA碱基互补配对结合成gRNA，此 复合物能引导核酸酶Caቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ9 蛋白切割与crRNA配对 的双链DNA。
1
CRISPR间隔区的获得
crRNA的表达和成熟 外源基因的切割
作用过程
2 3
噬菌体或质粒上与CRISPR－Cas9系 统中间隔序列对应的序列被称为 protospacer（PAM），一般为５‘－ ＮＧＧ－３’。 当外源基因入侵时，宿主识别PAM， 以PAM附近的序列作为protospacer； 把protospacer整合到CRISPR基因座 的5’端的两个重复序列之间，从而获得 相应的间隔区。
脱靶现象是基因编辑实验的资格重要问题， CRISPR/Cas的脱靶受到sgRNA、PAM、Cas9等 的影响。实验时可以通过设计优化的sgRNA、控 制Cas9-sgRNA的用量、改造Cas9、选着合适的 PAM系列和适中的酶浓度等方法降低脱靶率。
六、实 验设计
提出生物问题
选着操作方式
是敲除基因，还是 编辑基因或上调表 达或抑制表达？
CONTENTS
一、CRISPR-Cas系统的简介
1，CRISPR/Cas系统的由来 2，CRISPR/Cas系统的分类 3，CRISPR/Cas系统的结构
二、CRISPR-Cas系统的作用机理 1，CRISPR间隔区的获得 2，crRNA的表达和成熟 3，外源基因的切割
三、DSB的修复 四、CRISPR-Cas系统的应用 五、CRISPR技术的脱靶问题 六、实验设计