细胞凋亡中Caspase-3活性的检测
细胞凋亡、坏死、细胞活性检查常见方式及试剂
线粒体膜电位指示染料线粒体膜电位的下降是细胞凋亡初期的一个标志性事件. 它在凋亡进程中与caspase 活化同时发生并先于磷脂酰丝氨酸（PS）的外翻。
基于以上研究，Biotium 研发了各类的新型的荧光探针用于测量线粒体膜电位。
MitoView ™ 633MitoView ™ 633 是一种新型的用于测量线粒体膜电位的深红染料(激发光/发射光622/648 nm)。
利用NucView ™ 488 和MitoView ™ 633 凋亡检测试剂盒能够在荧光显微镜(图.1)或流式细胞仪(图.2、3)下同时进行线粒体膜电位和caspase-3活性的检测。
图 1. 利用MitoView ™ 633进行活细胞染色:Hela 细胞图 2. 流式细胞仪分析：Jurkat 细胞一组用CCCP 使线粒体去极化，另一组利用staurosporine 作为凋亡诱导剂。
利用MitoView ™633 染色图3. 流式细胞仪分析：对照（A）与经staurosporine 处置(B)的Jurkat 细胞（JC-1 染色）. FL1 (x- 轴) 为绿色荧光; FL2 (y-轴) 为红色荧光。
(A 图) 较高的红绿荧光比例说明线粒体膜电位未下降. （B 图）较低的红绿荧光比例说明：由于staurosporine诱导了凋亡的发生，细胞的线粒体膜电位大幅下降。
JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒JC-1通常被用于检测细胞中线粒体膜电位的转变。
在健康细胞中,JC-1以聚合体(J-aggregates)，的形式存在在线粒体基质中，能够产生红色的荧光(激发光/发射光585/590nm)。
相反，在正在凋亡或坏死的细胞中，JC-1不能聚集在基质中，以单体的形式存在，从而发出绿色的荧光( 激发光/ 发射光510/527nm)，如此能够利用流式细胞仪和荧光显微镜、荧光计数仪通过测量荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的转变。
经常使用红绿荧光的相对照例来衡量线粒体去极化的比例。
NucView488 caspase-3活性检测双功能试剂盒
NucView TM488 CASPASE-3主要特点：在活细胞中检测Caspase-3并染色细胞核DNA直接加入细胞培液,孵育15-30分钟后即可检测，无需清洗残余染料兼容使用荧光素滤光片的流式细胞仪和荧光显微镜可固定染色NucView TM488 CASPASE-3底物是一种新型的细胞膜渗透性用于检测活细胞内caspase-3的实时活动的荧光蛋白酶底物。
细胞凋亡率从细胞到细胞会有典型的变化，即使在相同的细胞数。
结果导致各种凋亡事件或凋亡标志物，伴随着细胞凋亡过程会出现在不同的细胞中。
因此，关键是要能够探测到在单个细胞基础上的这些凋亡事件。
传统上，caspase活性使用防渗膜荧光酶底物DEVD-R110，或荧光标记抑制物如FLICA试剂等检测。
在前一种情况下，细胞需裂解，从而排除在活细胞caspase活性的检测。
此外，这种蛋白酶检测方法只能在特定时间段的高度异质性细胞群中检测平均caspase活性。
在后一种情况下，虽然FLICA试剂可以进入活细胞检测caspase的活性，但只有最初的荧光信号，可以真实地反映酶的活性或细胞凋亡的状态，因为初始“快照”后的任何检测到的信号都需要考虑酶和细胞凋亡本身抑制剂的潜在干扰。
与传统的caspase检测不同，NucViewTM 488 Caspase-3底物以互不影响的方式检测完整单个细胞内caspase-3活性。
基底由一个荧光的DNA染料和caspase-3特异性的DEVD底物组成。
基底，一种无荧光及功能的DNA染料，可以迅速穿过细胞膜进入细胞质中，经过caspase-3酶的裂解作用，形成一个高亲和力的DNA染料。
释放的DNA染料迁移到细胞核染色细胞核成明亮的绿色。
这样的NucViewTM 488 caspase-3的基板是双向功能，能够在检测细胞内的caspase-3的同时染色细胞核，即可以观察细胞凋亡中细胞核的形态学变化。
caspase-3活性荧光染色是通过标准的固定方法（在3.75％，甲醛PBS用于固定，0.5％的Triton X-100PBS用于细胞通透性），从而促进后续的染色研究。
细胞凋亡检测方法
细胞凋亡的检测方法一、细胞凋亡概念：细胞凋亡是指为维持内环境的稳定，有基因控制的细胞自主的程序性死亡。
细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
细胞凋亡与胚胎发育、自身免疫耐受、肿瘤发生、病毒感染等生理、病理过程密切相关,近年来一直是生物医学领域各专业的研究热点。
选择合适的凋亡检测方法是研究细胞凋亡研究的关键。
二、细胞凋亡的检测方法：1. 磷酯酰丝氨酸(PS)外翻法(Annexin V 法)在凋亡细胞中，磷酯酰丝氨酸 (PS) 从质膜内侧转移到外侧，暴露在细胞外环境中。
荧光基团或荧光蛋白标记的膜联蛋白V 可与暴露在质膜外侧的PS 结合，用于识别凋亡细胞。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。
因此将Annexin-V 与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
应用实例：以FITC Annexin V/ PI Apoptosis Kit 为例子2. Caspase-3活性的检测:半胱氨酸蛋白酶caspase 家族蛋白的激活是凋亡进程中的一个必要的决定性事件。
其中caspase-3的激活在凋亡信号传导的许多途径中发挥着关键的作用。
Caspase-3正常以酶原（32KDa ）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KDa ）和两个小亚基（12KDa）组成，图1. 使用10 μM 喜树碱处理Jurkat 细胞4 小时作为阳性实验组（右图），同时设置未处理组做阴性对照（左图）。
使用FITC Annexin V/ PI Apoptosis Kit 对以上两组细胞进行相应的实验处理，流式细胞仪进行观察。
鉴定细胞凋亡的常用方法
鉴定细胞凋亡的常用方法细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，是维持生物体正常生长发育和组织修复的重要机制。
凋亡与疾病的关系密切，如肿瘤、神经退行性疾病、心血管疾病等。
因此，鉴定细胞凋亡的常用方法对于疾病的诊断和治疗具有重要的意义。
本文将介绍几种常用的细胞凋亡鉴定方法。
一、TUNEL法TUNEL法是一种基于末端脱氧核苷酸转移酶(dUTP-nick end labeling，TUNEL)技术的细胞凋亡检测方法。
该方法通过在细胞凋亡时，末端脱氧核苷酸转移酶(dUTP-nick end labeling，TUNEL)将标记物dUTP标记在DNA的3'末端，然后使用荧光显微镜观察标记物的荧光强度。
该方法的优点是操作简便，结果准确可靠，适用于多种样本类型的细胞凋亡检测。
二、Annexin V-FITC/PI双染法Annexin V-FITC/PI双染法是一种流式细胞术检测细胞凋亡的方法。
该方法通过Annexin V结合细胞膜上的磷脂酰胆碱(PS)和PI结合细胞核DNA，将细胞分为四个区域：Annexin V-FITC(-)/PI(-)区域表示正常细胞；Annexin V-FITC(+)/PI(-)区域表示早期凋亡细胞；Annexin V-FITC(+)/PI(+)区域表示晚期凋亡细胞；AnnexinV-FITC(-)/PI(+)区域表示坏死细胞。
该方法的优点是高灵敏度和高特异性，可以同时检测细胞凋亡和坏死。
三、DNA Ladder检测DNA Ladder检测是一种检测细胞凋亡的传统方法。
该方法通过电泳分离DNA，检测DNA的大小和形态是否发生变化，如出现约180bp 的DNA片段，则提示细胞凋亡。
该方法的缺点是需要较多的细胞样本，且不能区分细胞凋亡的早期和晚期。
四、Caspase活性检测Caspase是细胞凋亡的重要调节因子，Caspase活性检测是一种检测细胞凋亡的方法。
该方法通过检测Caspase活性的改变来判断细胞凋亡的程度，如Caspase-3活性增加，则提示细胞凋亡。
Caspase 3 活性检测试剂盒(比色法)
Caspase 3 活性检测试剂盒(比色法)产品简介：Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)家族在介导细胞凋亡过程的起着极其重要的作用，其成员包括Caspase1~11等,均属于蛋白酶家族。
Caspase 3又称CPP32、Yama、apopain、Caspase-3，属于CED-3亚家族，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。
Caspase 3 可以剪切procaspase 2、6、7和9，可直接特异性剪切许多Caspase底物（如PARP、ICAD等），并在细胞核凋亡过程中起到重要作用。
Jimei Caspase 3活性检测试剂盒（比色法）(Caspase 3 Colorimetric A ssay Kit)的检测原理是利用Caspase 3催化底物acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide(Ac-DEVD-pNA)产生黄色的游离硝基笨胺pNA (p-nitroaniline)，通过测定分光光度比色法测定pNA在400~410nm处吸光值，从而间接获得Caspase 3的活性。
自备材料：1、水浴锅或恒温箱2、96孔板3、酶标仪或分光光度操作步骤（仅供参考）：1、制备标准曲线：①按照Caspase Lysis buffer：Assay buffer=1：9的比例配制适量的标准品稀释液。
②用标准品稀释液稀释pNA(10mM)，使pNA分别达到200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM，另外设置一般不加pNA仅含标准品稀释液作为零管，把以上系列浓度物质作为标准品。
③取pNA浓度分别为200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、0的标准品各100μl加入至96孔板或取适量体积加入至容量不超过100μl的比色杯，测定405nm处吸光值即A405。
④用每一个标准品的A405 减去不含pNA的空白对照的A405，计算出实际的吸光值。
Caspase_3与细胞凋亡的研究_cropped
分子生物医学C aspase23 与细胞凋亡的研究张晓田(综述) ,宋天保(审校)( 西安交通大学医学院组织学与胚胎学教研室,陕西西安710061)关键词: 半胱天冬酶23 ; 细胞凋亡; Bcl22 中图分类号: Q255文献标识码: A文章编号:100622084 (2002) 1120621203His 的咪唑基团在C ys 侧链的极化激活中有重要作用。
精氨酸残基(Arg341 和Arg179) 位于大、小亚基之间的界面上,它们形成S1 亚位点,与P1 位点的天冬氨酸结合。
casp se23 的三维结构揭示大、小亚基共同参与构成其特异性的结合腔( b in d ing cleft ,S42S1) ,其中S4 亚位点是最主要的特异性决定簇, 只由小亚基构成4 ,5 。
2 c a sp a se23 与细胞凋亡2. 1 caspase23 处于细胞凋亡的下游经典的细胞凋亡途径有两条,分别为细胞外途径( 或称细胞表面死亡受体途径) 和细胞内途径(或称线粒体引发途径) 。
在细胞外途径中,死亡信号的传导依赖于死亡配体与受体的结合(如TNFα和TNFR , Fas L 和Fas 的结合) , 接着,死亡受体的死亡结构域( d eath d o2 main ,DD) 与信号传导分子(如FADD 等) 结合,而FADD 又可与caspase28 酶原的DE D 相连接, 形成死亡诱导信号复合物( d eath indu cing sig naling complex ,DISC) ,随之caspase28 被激活, 它通过裂解BID 使线粒体释放细胞色素C , 或直接作用于caspase23 及其他下游的caspase 。
在细胞内途径中, 细胞内的死亡信号,如DNA 损伤、毒素和ATP 耗竭等均可诱发线粒体释放细胞色素C。
细胞色素C、Apaf21 、d ATP 和caspase29 酶原结合形成凋亡复合体(apoptosom e) ,caspase29 被释放并激活,接着下游的caspase23 、7 等被激活降解底物使细胞凋亡2 ,6 。
C1115 Caspase 3 活性检测试剂盒 说明书
A. 对于悬浮细胞：把没有诱导凋亡的对照样品和诱导凋亡的样品，600g 4℃离心5分钟收集细胞，小心吸除上清，同时
确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次。同前吸尽上清后，按照每200万细胞加入100微升裂解液的比例加入裂解
液，重悬沉淀，冰浴裂解15分钟。下转液，备用。用胰酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中。600g 4℃离心5分钟
2. Liu C, Yu K, Shi X, Wang J, Lam P, Wu R, Zhou, B. Induction of oxidative stress and apoptosis by PFOS and PFOA in primary cultured hepatocytes of freshwater tilapia (Oreochromis niloticus). Aquatic Toxicology. (2007), doi:10.1016/j.aquatox.2007.02.006.
5. Qian YF, Yao WB, Wang H, Gao XD. The Mechanism of Kaixin San Inhibiting Apoptosis in Hydrogen Peroxide2induced PC12 Cells. Chin J Nat Med. Sep.2007 Vol.5 No.5.
F. 用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度(由于裂解液中含有较高浓度的DTT，不适合采用BCA法进行蛋白浓度测 定)。这样就可以计算出一个样品单位重量蛋白中所含的caspase 3的酶活力单位。
常见问题：
1. 测定出的A405过低： A. 样品中蛋白含量太低，裂解样品时需设法使样品中的蛋白浓度接近1-3mg/ml。 B. 样品中激活的caspase水平很低。首先确认凋亡现象是否明显，如果凋亡比较明显并且确认该caspase是可以被激活 的，可以适当调节诱导细胞凋亡的时间，希望能找到一个caspase激活比较强的时间点，这样就可以检测出该caspase 的激活。可以作一时间曲线，例如诱导凋亡0、2、4、8、16和24小时，或0、1、2、4、8和16小时，或0、1、2、4、 6和8小时等。具体的诱导凋亡时间需根据具体情况而定。 C. 通过上述优化后A405还是比较低，或浓缩样品或做时间曲线比较困难，可以在测定样品时加大样品的用量，最多可 达40µl。 假设每次测定样品的用量为xµl，则： C1. 此时标准品稀释液需按如下方法配制：按照xµl裂解液加入检测缓冲液至最终体积为100µl的比例配制适量的标 准品稀释液。例如样品用量为40µl，则按照40µl裂解液加入60µl检测缓冲液，即0.4ml裂解液加入0.6ml检测缓冲液的 比例配制标准品稀释液。其余标准曲线的测定方法同上面的使用说明所述。
细胞凋亡测定_实验报告
一、实验目的本实验旨在通过观察细胞凋亡的形态学特征和检测凋亡相关蛋白表达，了解细胞凋亡的发生机制，为细胞凋亡相关疾病的研究提供理论依据。
二、实验材料1. 细胞：人肝癌细胞株HepG2，人正常肝细胞株LO2。
2. 试剂：Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，Caspase-3活性检测试剂盒，DNA ladder检测试剂盒，荧光显微镜，流式细胞仪等。
3. 仪器：CO2培养箱，细胞培养瓶，移液器，离心机，荧光显微镜，流式细胞仪等。
三、实验方法1. 细胞培养：将HepG2和LO2细胞分别接种于培养瓶中，置于CO2培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期时进行实验。
2. 细胞凋亡检测：（1）Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测：将细胞悬液离心后弃去上清，加入Annexin V-FITC/PI染液，室温避光孵育15分钟，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
（2）Caspase-3活性检测：按照试剂盒说明书操作，检测细胞中Caspase-3活性。
（3）DNA ladder检测：按照试剂盒说明书操作，进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA ladder现象。
3. 数据分析：采用SPSS软件进行统计学分析，比较两组细胞凋亡率、Caspase-3活性和DNA ladder的差异。
四、实验结果1. Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测：HepG2细胞凋亡率为（30.2±2.5）%，LO2细胞凋亡率为（2.1±1.2）%，两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。
2. Caspase-3活性检测：HepG2细胞Caspase-3活性为（2.58±0.21）U/mg，LO2细胞Caspase-3活性为（0.83±0.14）U/mg，两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。
3. DNA ladder检测：HepG2细胞出现明显的DNA ladder现象，LO2细胞无DNA ladder现象。
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细胞凋亡中Caspase-3活性的检测
关键词：细胞凋亡活性检测执行分子 2012-09-27 18:04 来源：互联网点击次数：5249
Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。
Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。
但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。
1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
方法：
收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温1.5~2h或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4°C过夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→H RP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应
1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次?→ECL显影或NBT/BCIP显色。
结果如下图
2 荧光分光光度计分析
原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。
根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。
在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。
根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。
方法：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?制备细胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC （caspase-3四肽荧光底物）?37°C反应1h?荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。
结果如下图
3 流式细胞术分析
方法：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?加Ac-DEVD-AMC?37°C反应1h?UV流式细胞计分析caspase-3阳性细胞数和平均荧光强度。
结果：
/experiment/430/488/498/31933.htm。