实验方案
实验设计方案范例5篇

实验设计方案范例5篇通过组织“班级读书会”、美文诵读角逐、读书演讲角逐、故事会、书签制作、小小报、报刊剪辑、古诗擂台赛等各类读书活动,激发阅读兴趣,呈现读书成果。
2、主动开展小课题争论。
在全校“主题学习”试验的大框架下,各试验老师可依据个人状况和学段特点申报开展小课题争论,例如:“主题学习”课型、教学模式、小组建设、导学案设计、主题作文教学、阅读呈现汇报、语文综合性学习、单元集中识、亲子共读、师生共读等等,并将争论成果在校内推广,丰富试验争论的内涵,提升试验争论的效果。
3、认真开展试验争论。
依据试验目标的要求,深入到到理解“语文主题学习”的理念实质,努力开展语文课堂教学争论。
要转变传统的教学模式,探究符合实际的操作方法。
尝试学案导学,单元集中授课,制定科学细致的教学方案,合理支配教学课时。
建设自主互助学习型高效课堂,最大限度地调动同学学习的主动性,激发课堂活力,提高教学效率。
留意培育同学科学的阅读方法、良好的阅读习惯和深厚的阅读兴趣,全面提高同学的语文素养和综合素养。
4、留意积累试验成果。
试验老师要留意收集积累试验过程性材料,结合试验经受认真撰写试验论文、教学反思、个案报告、试验总结等,并将试验取得成果和存在问题通过学校组织的老师论坛、试验论证会、小课题相互沟通会、成果推动前进会等途径进行汇报、相互沟通、研讨。
(三)同学层面1、适应自主合作探究的学习方式。
在老师指导下组建学习小组,通过“学案”进行小组互助自学,合作探究,相互沟通呈现。
2、在老师指导下完成语文教材和《主题学习丛书》的学习,多读书、读好书,在读书中养成科学的阅读方法、良好的阅读习惯和深厚的阅读兴趣,提高自己的语文素养和综合素养。
3、主动参预班级和学校组织的各种读书活动,在活动中呈现自我,在实践中体验成功,争当“阅读之星”。
(四)家长层面1、支持孩子购买《语文主题学习丛书》和课外阅读书籍。
2、协作语文老师开展试验争论,指导孩子认真完成课文预习和课外阅读任务。
什么是实验方案

什么是实验方案在科学研究领域中,实验方案是指为了验证某一假设或者解决某一问题而设计的一系列实验步骤和方法。
实验方案是科学研究的基础,它需要科学家们通过系统性的研究和分析来得出科学结论。
本文将就实验方案的定义、重要性以及设计实验方案的基本原则进行探讨。
实验方案的定义:实验方案是科学研究中用来验证假设和解决问题的一套具体操作步骤和方法。
它包括实验的目的、实验的步骤、实验所需的材料和仪器、实验的数据分析方法等内容。
实验方案的设计需要符合科学的原理和方法,确保实验的可重复性和可验证性。
实验方案的重要性:实验方案在科学研究中具有重要的作用。
首先,实验方案确保了科学研究的可靠性和可信度。
通过有规划的实验方案,研究者们可以控制变量、排除干扰因素,保证实验结果的准确性。
其次,实验方案可以帮助研究者们更好地识别问题和解决问题。
通过明确实验的目的和步骤,科学家们可以有针对性地收集和分析数据,从而得出科学结论。
最后,实验方案的编写和记录对于科学研究的复现和分享起到了至关重要的作用。
只有通过详细和准确的实验方案,其他科学家们才能重复实验并验证结果,从而推动科学知识的发展。
设计实验方案的基本原则:设计一个科学合理的实验方案需要遵循一些基本原则。
首先,实验方案应该明确具体的研究问题和目的,确保实验的针对性。
其次,实验方案应该规定实验所需的材料、仪器和实验条件,并保证其可获得性和可操作性。
第三,实验方案需要明确实验的步骤和操作流程,包括样本的采集、实验的操作方法等。
第四,实验方案应该设计合理的对照组和实验组,以便比较和分析数据。
最后,实验方案需要规定数据的收集和分析方法,以及结果的解读方式。
总之,实验方案在科学研究中具有重要的地位和作用。
它是科学研究的基础,能够确保实验的可靠性和可验证性。
科学家们在设计实验方案时需要遵循科学原理和方法,确保实验的科学性和准确性。
只有通过严谨和规范的实验方案,科学研究才能取得可靠的结果,并为人类社会的进步和发展做出贡献。
实验设计方案(10篇)

实验设计方案(10篇)1. 实验名称:植物生长与光照关系研究实验目的:探究不同光照条件下植物生长的变化情况。
实验材料:同种植物、不同光照强度的光源、土壤、水等。
实验步骤:(1)将同种植物分成三组,每组10株。
(2)第一组植物置于自然光照下,第二组植物置于较弱的光照下,第三组植物置于较强的光照下。
(3)每天观察并记录每组植物的生长情况,包括高度、叶片数量等。
(4)实验持续一个月,实验结束后,分析各组植物的生长情况,得出结论。
2. 实验名称:不同水温对鱼类生存的影响实验目的:研究不同水温对鱼类生存的影响。
实验材料:同种鱼类、不同温度的水源、鱼缸等。
实验步骤:(1)将同种鱼类分成三组,每组10条。
(2)第一组鱼类置于正常水温的鱼缸中,第二组鱼类置于较低水温的鱼缸中,第三组鱼类置于较高水温的鱼缸中。
(3)每天观察并记录每组鱼类的生存情况,包括活动频率、食欲等。
(4)实验持续一个月,实验结束后,分析各组鱼类的生存情况,得出结论。
3. 实验名称:土壤类型对植物生长的影响实验目的:研究不同土壤类型对植物生长的影响。
实验材料:同种植物、不同类型的土壤、水等。
实验步骤:(1)将同种植物分成三组,每组10株。
(2)第一组植物种植在沙质土壤中,第二组植物种植在粘质土壤中,第三组植物种植在壤土中。
(3)每天观察并记录每组植物的生长情况,包括高度、叶片数量等。
(4)实验持续一个月,实验结束后,分析各组植物的生长情况,得出结论。
4. 实验名称:不同饲料对家禽生长的影响实验目的:研究不同饲料对家禽生长的影响。
实验材料:同种家禽、不同类型的饲料、养殖环境等。
实验步骤:(1)将同种家禽分成三组,每组10只。
(2)第一组家禽喂养普通饲料,第二组家禽喂养高蛋白饲料,第三组家禽喂养高纤维饲料。
(3)每天观察并记录每组家禽的生长情况,包括体重、羽毛颜色等。
(4)实验持续一个月,实验结束后,分析各组家禽的生长情况,得出结论。
5. 实验名称:不同肥料对植物生长的影响实验目的:研究不同肥料对植物生长的影响。
实验方案是指什么

实验方案是指什么
实验方案是指什么
实验方案是指科学研究或工程技术项目中的一项重要内容,它是研究者或工程师为了解决问题、验证假设或实现目标而制定的计划和方法。
实验方案通常包括实验的目的、步骤、材料、仪器设备、数据采集与分析方法等内容,是科学研究和工程实践中重要的指导性文件。
在科学研究中,实验方案起到了指导研究者开展实验的作用。
在制定实验方案时,研究者首先需要明确研究的目的和科学问题,然后确定实验的步骤和方法,选择合适的实验材料和仪器设备,并设计合理的数据采集和分析方案。
通过细致、严谨的实验方案,研究者可以保证实验的可靠性和可重复性,从而获取准确的实验结果,进而推动科学的进步。
在工程技术项目中,实验方案也发挥着重要的作用。
工程师在制定实验方案时,需要明确项目的目标和需求,然后确定实验的步骤和方法,选择适当的材料和设备,并设计合理的测试方案。
通过实验方案的执行,工程师可以评估工程项目的可行性和可靠性,发现问题并解决问题,最终实现项目目标。
实验方案的制定需要科学性、可操作性和合理性。
科学性是指实验方案必须符合科学原理和方法,确保实验结果的准确性和可靠性。
可操作性是指实验方案必须具备可实施性,包括实验步骤明确、材料和设备易获取等。
合理性是指实验方案必须符合项目的实际需求和条件,能够达到研究或工程目标。
总之,实验方案是科学研究和工程实践中不可或缺的一部分,它为研究者和工程师提供了指导和规范,确保实验的可靠性和有效性。
通过制定科学、可操作和合理的实验方案,我们可以更好地开展研究和工程项目,推动科学技术的发展。
实验方案的意思

实验方案的意思
实验方案的意思
实验方案是指在科学研究或工程实践中,为了解决问题或验证某种假设而制定的具体操作步骤和计划。
它是进行实验的指导性文件,也是科学研究的重要组成部分。
实验方案的制定需要考虑到研究目的、研究对象、实验方法、实验步骤、数据采集和分析等方面的内容。
首先,研究目的明确是制定实验方案的首要任务。
研究目的可以是验证一个假设、解决一个问题,或者发现某种规律性的现象。
其次,研究对象是指实验的主要研究内容,包括研究样本、实验设备等。
在选择研究对象时,需要考虑到其代表性和可操作性。
然后,确定实验方法是实验方案的核心。
实验方法包括实验设计、实验操作和数据采集等方面的内容,要确保实验方法的科学性和可行性。
最后,实验方案还需要明确实验的步骤、数据采集和分析方法,以及实验结果的展示方式。
实验方案的制定有助于实验的高效进行和结果的可靠性。
通过制定详细的实验方案,可以减少实验过程中的偶然误差,并提高实验的重复性和可比性。
实验方案也可以作为实验结果的有效论证依据,使其他研究人员能够复现实验并验证实验结果的可靠性。
总之,实验方案是进行科学研究或工程实践的重要指导文件,它的制定需要考虑到研究目的、研究对象、实验方法、实验步骤、数据采集和分析等方面的内容。
制定科学合理的实验方案有助于实验的高效进行和结果的可靠性,同时也有利于研究成果的交流和验证。
在实践中,我们要重视实验方案的制定,确保科学研究和工程实践的顺利进行。
实验方案的概念和内容是什么

实验方案的概念和内容是什么实验方案的概念和内容是什么摘要:实验方案是科学研究中不可缺少的一环,它是指为了解决特定问题而制定的一系列实验步骤和方法的计划。
一个完善的实验方案能够确保研究的可重复性、可验证性以及结果的可信度。
本文将从六个方面详细阐述实验方案的概念和内容,包括目的、背景、研究问题、假设、实验设计和数据分析。
1. 目的实验方案的首要任务是明确研究的目的。
目的是研究者想要解决的问题或者验证的假设。
在实验方案中,研究者应清晰地描述研究目标,明确研究的意义和价值,并与相关研究领域的前沿知识和现有研究工作进行联系。
2. 背景实验方案的背景介绍是为了让读者了解该研究的相关领域的背景知识和现有研究进展。
研究者应该对前人的工作进行综述,指出前人工作的不足之处,明确自己的研究问题在当前领域的重要性和创新性。
3. 研究问题研究问题是实验方案的核心,也是推动研究的动力。
研究问题应该具有明确的界定和可操作性,能够通过实验方法来解答。
在实验方案中,研究者需要明确提出研究问题,并解释为何选择这个问题进行研究。
4. 假设在实验方案中,研究者通常会提出一个或多个假设,以解释研究问题。
假设应该是明确的、可测量的,并能够通过实验证据进行验证或者推翻。
研究者需要详细说明每个假设的内容和假设的依据,以及如何设计实验来验证或者推翻假设。
5. 实验设计实验设计是实验方案的核心内容之一,它是指为了验证研究假设而进行的一系列实验步骤和方法的安排。
实验设计应该符合科学原理和实验规范,确保实验的可靠性和有效性。
在实验方案中,研究者需要详细描述实验的具体步骤、实验条件、实验材料和实验方法,并说明如何处理可能的干扰因素。
6. 数据分析数据分析是实验方案的最后一步,它是指对实验结果进行统计和解释的过程。
研究者需要选择合适的统计方法和工具,对实验数据进行分析,并根据分析结果得出结论。
在实验方案中,研究者需要明确说明数据分析的步骤和方法,以及如何解释分析结果,并与研究问题和研究目的进行联系。
实验设计方案范文5篇

实验设计方案范文5篇实验设计方案1药品:半枝莲、95%乙醇、盐酸小檗碱对照品、蒸馏水、盐酸溶液、氢氧化钠溶液、碘-碘化钾试剂仪器:722型紫外分光光度计、电子分析天平、电热恒温水浴锅、数据超声波清洗器、微型植物粉碎机、PH计、加热板、循环水式多用真空泵实验方法:超生波提取法、半仿生法、正交实验、生物碱的鉴定方法实验步骤:一、药品、仪器的准备二、对照品溶液的制备、波长的测定、标准曲线的制作、推算出回归方程三、样液的制备四、用半仿生法提取半枝莲中生物碱1、单因素实验(1)温度对提取效果的影响(2)酸度对提取效果的影响(3)碱度对提取效果的影响(4)料液比对提取效果的影响2、因素、水平的确定及进行正交实验设计:由单因素温度、酸度、碱度和料液比作为正交试验的四个水平进行正交实验以确定半仿生法中最优的提取条件五、超声波辅助半仿生法提取半枝莲生物碱:在上述半仿生法得到的最优提取条件下进行超声波提取1、单因素实验(1)温度对提取效果的影响(2)提取次数对提取效果的影响(3)酒精浓度对提取效果的影响2、因素、水平的确定及进行正交实验设计:由单因素温度、提取次数、酒精浓度作为正交试验的三个水平进行正交实验以确定在超声波辅助半仿生法提取中的最优条件六、在超声波辅助半仿生法提取的最优条件下提取半枝莲中生物碱七、利用紫外分光光度计测定上述提取到的生物碱的吸光度,与标准曲线进行比较,计算出生物碱的量及产率。
八、生物碱的鉴定:生物碱沉淀反应1、碘化铋钾试剂反应取渗漉液1ml,加碘化铋钾试剂1滴~2滴,生成棕色至棕红色者为阳性反应在。
2、碘-碘化钾试剂反应取渗漉液1ml,加碘-碘化钾试剂1滴~2滴,生成棕黄色沉淀者为阳性反应。
3、硅钨酸试剂反应取渗漉液1ml,加硅钨酸试剂数滴,生成淡黄色沉淀者为阳性反应。
实验设计方案2一、【实验题目】:印刷条件对预涂膜覆膜质量影响探究二、【实验设计思路】:影响覆膜质量因素主要分为两类,即覆膜工艺的影响和印刷条件的影响。
实验设计方案范文(精选5篇)

实验设计方案范文(精选5篇)实验设计方案1一、实验原理(1)鉴定实验设计的理念:某些化学试剂+ 生物组织中有关有机化合产生特定的颜色反应。
(2)具体原理:①可溶性还原糖+ 斐林试剂→砖红色沉淀。
②脂肪小颗粒+ 苏丹Ⅲ染液→橘黄色小颗粒。
③蛋白质+ 双缩脲试剂→紫色反应。
二、目标要求初步掌握鉴定生物组织中可溶性还原糖、脂肪、蛋白质的基本方法。
三、重点、难点1.重点①初步掌握鉴定生物组织中可溶性还原糖、脂肪、蛋白质的基本方法。
②通过实验的操作和设计培养学生的动手能力,掌握探索实验设计技巧,从而培养创新思维能力。
2.难点根据此实验方法、原理,设计实验来鉴定常见食物的成分。
四、实验材料1.可溶性还原糖的鉴定实验:选择含糖量较高、颜色为白色或近白色的植物组织,以苹果、梨为最好。
2.脂肪的鉴定实验:选择富含脂肪的种子,以花生种子为最好(实验前浸泡3h~4h)。
3.蛋白质的鉴定实验:可用浸泡1d~2d的黄豆种子(或用豆浆、或用鸡蛋蛋白)。
五、仪器、试剂1.仪器:剪刀,解剖刀,双面刀片,试管,试管架,试管夹,大小烧杯,小量筒,滴管,玻璃漏斗,水浴锅,研钵,石英砂,纱布,载玻片,盖玻片,毛笔,吸水纸,显微镜。
2.试剂:①斐林试剂(0.1g/L的NaOH溶液+ 0.05g/mL的CuSO4溶液);②苏丹Ⅲ染液;③双缩脲试剂;④ 体积分数为50%的酒精溶液;⑤蒸馏水。
六、方法步骤1.制备试剂。
2.可溶性还原糖的鉴定、方法、步骤。
3.脂肪的鉴定、方法、步骤。
4.蛋白质的鉴定、方法、步骤。
七、实验过程新课引入:我们在化学中学习过物质的鉴定,其原理是被鉴定的物质与所用的化学试剂要么发生颜色反应,要么产生沉淀,我们生物学上也采用此原理,在生物学中物质鉴定的理念是:某些化学试剂能够使生物组织中的有关有机化合物产生特定的颜色反应。
新课教学:(具体原理)①可溶性还原糖+ 斐林试剂→砖红色沉淀。
(水浴加热)②脂肪小颗粒+ 苏丹Ⅲ染液→橘黄色小颗粒。
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实验方案繁殖障碍类病毒病(PR、PP、PRRS)弱毒疫苗的研制1. 病毒的克隆1.1 细胞制备原种细胞系(MARC-145,IBRS-2)复苏、传代1.1.1复苏(a)取液氮冻存的Marc-145(34代)细胞1支,立即置37℃水浴中不断摇晃,待融化后,将细胞倒入25mL的克氏瓶中,加入含10%BCS的MEM生长液,37℃培养,5-6h后换液以倾去死亡细胞, 37℃培养。
待长成单层后,进行传代培养。
(b)取液氮冻存的Marc-145(34代)细胞1支,立即投入37-38℃水浴中,待融化后(约1min),室温下在5min内用25℃左右的血清营养液稀释至原体积的4倍,500r/min离心10min,弃上清,加新鲜营养液悬浮细胞,并将细胞转入25mL的克氏瓶中补足营养液,37℃培养。
1.1.2传代取长满单层后的细胞(约72h),倾去原来的营养液,用Hank’s液冲洗一次,加入0.25%的胰酶(或是0.5%的胰酶和0.04%EDTA的等量混合液),其加入量以能在细胞上形成1mm 厚的液层为宜。
置室温或37℃温度中消化,当细胞层开始由瓶壁脱离时(眼观可见细胞面呈毛玻璃样,镜下观察可见细胞圆缩,间隙增大,即将脱落),将消化液倾出,加入少量营养液,轻晃冲洗细胞层后倾弃,再加入相同于原营养液量的新营养液,以大口径吸管充分吹打,直到细胞完全分散,再加同量营养液,吹打数次后即可分瓶。
(为便于吹打和分散细胞,开始时可以少加一些营养液,吹打分散后再逐步追加营养液至需量。
)其分种率为1:2或1:3,37℃培养。
1.2 病毒培养种毒(PRRSV[欧美株]、PRV、PPV)复壮、病毒增殖1.2.1种毒复壮(PRRSV[欧美株]、PRV)(1) 取刚长成单层的Marc-145细胞,倾弃营养液后,加入不含血清的维持液[1%Gln,2%NaHCO3(7.5%),1%双抗的MEM],洗2-3遍,倾弃清洗营养液;(2) 接毒冻干毒种(原装量为2mL,湿毒1mL,保护剂1mL),以无血清MEM恢复为原装量,每瓶(100mL瓶)接毒1mL;(3) 吸附37℃吸附1h,其中每20min轻轻晃一次,以使接种毒液能与细胞层更好地接触以利病毒吸附。
吸附1h后,倒出接种病毒液,再加入含3%BCS的维持液,置37℃培养。
(4) 收获每日观察细胞的CPE。
接毒后24h、36h、48h各观察一次CPE,或根据CPE 的形成情况,适当缩短观察间隔时间,待细胞形成80%的CPE时,冻融三次后-20℃冻存。
1.2.2 病毒增殖(1) 取刚长成单层的Marc-145细胞,倾弃营养液后,加入不含血清的维持液,洗2-3遍,倾弃清洗维持液;(2) 接毒冻融湿毒1mL以无血清MEM做10-100倍稀释,每瓶(100mL瓶)接毒1mL;(3) 吸附37℃吸附1h,其间每20min轻轻晃动一次,以使接种液能与细胞层更好地接触以利病毒吸附。
(4) 补充维持液吸附1h后,补足维持液或倒出接毒液再加入足量的维持液,37℃培养。
(5).收获每日观察细胞的CPE。
接毒后24h、36h、48h各观察一次CPE,或根据CPE 的形成情况,适当缩短观察间隔时间,待细胞形成80%的CPE时,冻融三次后-20℃冻存。
1.3. 增殖病毒TCID50测定(Reed-Muench法)(1) 细胞板的制备取长成单层的细胞,倾弃营养液,冲洗2-3次,加入0.25%的胰酶消化,制备细胞板(96孔板)。
制板时每孔加100u L,37℃培养。
(2) 接毒吸出细胞板中的营养液,取待测湿毒1ml在试管中用无血清维持液做10×连续稀释,每稀释度接种8孔,每孔接种100ul,接种7-8个稀释度,同时另用8孔,每孔只加入100ul维持液做对照。
37℃培养。
(3) 结果判定37℃培养48h后开始观察CPE,至120h。
记录每一稀释度出现明显CPE 的孔数,根据Reed-Muench公式计算TCID50值。
1.4. 病毒克隆PRRSV、PRV采用蚀斑克隆、PPV采用终点稀释法克隆1.4.1 PRRSV、PRV蚀斑克隆(1) 在细胞培养扁瓶或平皿中使细胞长成密集的单层,不能有空隙(细胞接种浓度不能低于1×106/ml)。
(2) 吸去生长液,用MEM维持液将细胞单层洗一次。
(3) 病毒检样用MEM液(pH7.2-7.4)作连续10倍稀释。
要能检出孤立可数的空斑,病毒浓度最好在100-500 TCID50/ml,稀释时要注意。
每一稀释度接种4个培养瓶(3瓶用于覆盖MEM营养琼脂,1瓶只加维持液用于对照)。
接种剂量随容器大小而异。
25mL的培养瓶接种量约为0.3ml,以此类推。
同时设立不接毒的空白对照(1瓶覆盖MEM营养琼脂,1瓶只加MEM维持液)。
(4) 将培养瓶放在37℃吸附60min,使病毒吸附于细胞,每15min将培养瓶轻轻转动,使接种液分布均匀。
(5)加入适量维持液,37℃培养约12-24h。
(6) 将培养瓶放在水平桌面上。
按照3所设计的方案加入融化后冷却到42-44℃的不含中性红的MEM营养琼脂覆盖层,厚度约3mm,约10mL。
如果用培养瓶,只需将瓶塞塞紧即可;如果是平皿,应将其放在CO2培养箱中培养,以保持适宜的CO2浓度和湿度(7) 琼脂凝固后将培养瓶瓶或平皿翻转,在37℃继续培养24-48h。
(8) 加入融化后冷却到42-44℃的含0.1g/L中性红的MEM营养琼脂覆盖层,约5mL。
37℃继续培养,观察CPE并天后计数空斑数形成单位(PFU)。
空斑应为淡白色,背景呈淡红色。
(9) 为了分离病毒克隆株,在培养瓶内出现清晰的蚀斑时,即可进行挑斑。
最好选择蚀斑数较少,各斑间的距离不小于10mm小而孤立的空斑(或挑选大、中、小不同斑径及不同形态的蚀斑(主要根据斑径选择)。
先在选定的蚀斑部位的瓶壁上做好标志,随后应用带有橡皮乳头的弯头吸管或巴斯德吸管连同琼脂一块吸出选定的蚀斑。
如系平皿内的蚀斑,则可直接用吸管吸取。
将吸取的蚀斑琼脂糖放入含有0.5~l ml营养液的Eppendorf管内,反复冻融三次,使病毒充分释放,3 000r/min离心10min,取上清,用于接种敏感细胞,待其充分增殖以后,挑选斑径、形态稳定,产斑数高,细胞病变明显的蚀斑克隆进行下一轮的蚀斑纯化。
如此操作2~3次后,滴定克隆病毒的毒价(TCID50)并进行鉴定。
1.4.2 PPV终点稀释法克隆或是采用对带毒细胞进行终点稀释法细胞克隆方案A:PPV终点稀释法克隆(1) 制备96孔细胞板。
(2) 接毒吸出细胞板中的营养液,取湿毒1ml在试管中用无血清维持液做10×连续稀释,每稀释度接种8孔,每孔接种100ul,接种7-8个稀释度,同时另用8孔,每孔只加入100ul维持液做对照。
37℃培养。
(或者是从开始接种,每个稀释度接种至少48孔)(3) 37℃培养48h后开始观察CPE,至120h。
记录每一稀释度出现明显CPE的孔数,根据Reed-Muench公式计算TCID50值。
(4) 以TCID50值的稀释度或更高的倍数稀释病毒并接种96孔细胞板。
培养至出现适当病变时,刮下(或用胰酶消化)有病变孔内的细胞,连同本孔内的营养液一起冻融3次,20℃冻存。
或经适当增殖后再次进行克隆。
方案B:带毒细胞进行终点稀释法细胞克隆(1)营养液的条件化取新培养而即将长成单层的IBRS-2细胞,倾弃原来的营养液,加入新鲜营养液(含20%的犊牛血清),37℃培养1天后,吸出营养液,经微孔滤膜或以3 000 r/min的速度离心30min,除去可能混悬其中的细胞,取上清液装瓶备用,应用时要加入1%葡萄糖,并将pH调到7.0-7.2,保存备用。
(2) 倾弃处于旺盛生长期的单层细胞(分瓶后刚刚贴壁的细胞瓶)生长液,用不含血清的维持液清洗一遍后,加入接种量(按TCID50的倍数稀释接种)的病毒吸附1h后,倾弃接种液,加入生长液于37℃培养12~24 h后(视试验情况而定),胰酶消化,用前述条件化了的营养液作高倍稀释(10-1-10-7左右),然后从10-5开始分别接种96孔,微量细胞培养板,每个稀释度至少接种50孔,最好是一板(96孔),从培养48~72h后开始,逐日在倒置显微镜下观察,取最高稀释度有细胞增殖的孔,胰酶消化并适当扩增培养后,冻融3次后,再盲传,观察是否有细胞病变。
收获有病变的培养再次进行克隆二次后进行的TCID50测定。
1.5.克隆毒的增殖培养2.1. 克隆毒的形态和主要理化特性2.1.1 纯化病毒的形态学观察病毒纯化、电镜下的形态学观察(1) PRRSV的纯化收获病毒经3次冻融处理后,8 000r/min 4℃离心15min,取上清,45 000 r/min离心2h,用原体积1/20的TE缓冲液(10 mM Tris-HCl pH8.0 ,1.0mM EDTA)稀释沉淀,-20℃保存备用。
(2) PPV的纯化方案A:将收获的病毒液经氯仿处理两次,水相加等量TES(Tris.Cl, 20mmol/L EDTA, pH 8.0, 0.5mol/L NaCl),6000r/min 离心20 min,上清液中缓缓加入40%聚乙二醇(PEG6000),使其终浓度达到6%,4℃条件下磁力搅拌过夜,6000r/min 离心30 min,沉淀用TES稀释,超声波打碎沉淀块,再次用氯仿处理。
在浓缩的病毒液中加入CsCl(终浓度达到35%)混均,37500r/min 离心22 h,分管收集离心管中液体(200μL/管),测定各管密度。
收集密度在1.35~1.42g/mL的病毒液,混合后于40000r/min 离心4h,再用适量TES溶解沉淀,-20℃保存备用。
方案B:收获病毒经3次冻融处理后,8 000 g 离心30min,取上清,上清液中缓缓加入1/5体积20%聚乙二醇(PEG8000,含2.5M NaCl),4℃条件下磁力搅拌过夜,30 000g(6 000r/min?) 离心30 min,沉淀用1×TE缓冲液(10 mM Tris-HCl pH8.0 ,1.0mM EDTA)稀释沉淀,-20℃保存备用。
(3) PRV的纯化收获病毒经3次冻融处理后,6 300r/min 4℃离心30min,取上清,27 000 r/min 4℃离心2h,用原体积1/20的TE缓冲液(10 mM Tris-HCl pH8.0 ,1.0mM EDTA)稀释沉淀,-20℃保存备用。
(4) 形态学观察将收获的细胞培养液、冻融后的培养液及纯化的病毒经磷钨酸负染后,在透射电镜下观察病毒形态。
2.1.2. 克隆毒主要理化特性主要测定克隆病毒对乙醚和氯仿等脂溶剂、酸碱度、温度、胰酶等理化因素的敏感性和耐受性试验。
2.2血清学鉴定PRV拟采用病毒中和试验鉴定(固定病毒-稀释血清法),或以琼脂间接免疫凝集试验(AGID)进行鉴定。