第 8 讲 DNA RNA 蛋白质操作技术(1)

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DNA连接酶： DNA连接酶是基因工程第二位重要的工具酶，常用
T4DNA ligase. （一）功能：催化有互补顺序的两个dsDNA分子的粘 性末端或平头末端3′－OH、5′－P连接作用。 （二）来源－噬菌体T4感染E. coli分离的一种单链多 肽酶、MW.68KD。 （三）催化反应：
只羊乳腺细胞基因（“掉包”），放电激活该卵细胞，使之 象正常受精卵一样进行细胞分裂，直至一定阶段，胚胎成熟。
3. 将成熟的胚胎移植到第三只母羊子宫中发育，妊娠 （同正常一样），最后产下多利。
这样一只与第一只羊基因百分之百一样的复制品诞生了。
胚胎细胞克隆: 体细胞克隆
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在这个过程中： 1.“基因剪刀” DNA的酶就像一把“基因剪刀” 2.“缝纫针” 连接不同来源DNA分子的酶就像
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掌握
1. 几种抗生素的英文缩写 2. 多克隆位点的概念 3. 大肠杆菌蓝白斑筛选原理 4. 普通PCR的扩增原理和过程
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Thank you!
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水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 可以阻止四环素进入细胞。 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之
失去毒性。
（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶 使G418（长那霉素衍生物） 失活
（5）hygr
潮霉素β磷酸转移酶 使潮霉素β失活。
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3. 多 克 隆 位 点 （ multiple cloining site，MCS）
①拷贝数多，10-200个，分子量小。 ②复制不受宿主细菌复制系统的限制，其拷贝数猛增 至 1000-3000之多，该性质多基因工程技术十分有利。
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2. 抗生素抗性基因：
（genotype）
编码产物
功能（phenotype）
（1）Ampr （2）tetr （3）camr
酶 1个膜蛋白 乙酰转乙酶
下村修1962年在北美西海岸的水母中首次发现了一种在紫外线下发出 绿色荧光的蛋白质，即绿色荧光蛋白。随后，马丁•沙尔菲在利用绿色荧光 蛋白做生物示踪分子方面做出了贡献；钱永健让科学界更全面地理解绿色 荧光蛋白的发光机理，他还拓展了绿色以外的其他颜色荧光蛋白，为同时 追踪多种生物细胞变化的研究奠定了基础。
（1）原核载体 （2）真核载体 （3）穿梭载体
3.按载体来源分
4.按克隆片段得大小 （克隆能力）分
病毒载体＋
(1)<1kb (2)<10kb (3)<22kb (4)<50kb (5)0.1-0.4Mb (6)0.5-2Mb
PUC8 PBUDCE41 YE
(1)M13 (2)plasmid (3)λphage (4)casmid (5)BAC (6)YAC
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2500 V, ~6 ms
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20 世 纪 80 年 代 ， Kary B. Mullis 发明 该 技 术 。 1993 获 得 Nobel Prize。
Kary B. Mullis (1944 -)
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3. 当代科技发展有两种形式：一是突破，二是融 合。突破是线性的，即从研究开发新一代的科技 成果取代原有一代科技成果。融合是非线性的， 即混合原有不同的科技领域，进而发展新产品， 造成革命性市场，它们是互补和合作的结果。如： XX的技术集成。
基因工程既是科学又是技术，既是突破，又 是融合。她是分子遗传学，生物化学，细胞学， 细胞生物学，分子生物学相互渗透，交叉融合、 突破的结果。
一根“缝纫针”，使二者连在一起
3.“交通工具” 使用载体好比一辆车子 4.“乘客” 有用基因如IL2好比使乘客，车子
把乘客送进理想天堂（宿主细胞）去繁衍生息， 春华秋实，生产我们需要的产品或开展基因治 疗（IL2/LAK→抗癌）。
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“基因剪刀”－限制性内切酶的发明
（1）20世纪40－60年代，科学家们就为 基因工程设计了美好的蓝图，但是面对庞大 的dsDNA束手无策，无从下手把它切成单个 基因片断。
hptII gene
XhoI (9677)
CaM V 3'UTR
M CS(854-953)
SalI (949)
Link e r(9 5 4 -9 9 8 ) nLUC(9 9 9 -2 2 4 6 )
LB
Pst I (2252)
Kanmycin resistance gene
p C AMBIA1 3 0 0 -n LU C
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The Nobel Prize in Chemistry 2008
“for the discovery and development of the green
fluorescent protein, GFP”
Osamu Shimomura
Martin Chalfie
Roger Y. Tsien 钱永健
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多利
1997.2.23，Nature杂志报道，英国爱丁斯堡罗斯 林研究所和PPL生物技术公司已经成功克隆了一只名叫 多利的绵羊（1997－2003/7/12）。这一消息的公布， 全世界震惊的程度不亚于原子弹在长崎和广岛的爆炸， 在全球引起了轩然大波，以至世人惊呼：不要让科学疯 狂！
为什么以前胚胎克隆没有在世界上引起轩然大波呢?
（二）功能 基因工程中主要用于逆转录mRNA→cDNA （complementory DNA）。
（三）商品化逆转录酶有两种 ①AMV（禽成髓细胞瘤） ②Mc-MLV(鼠白血病病毒)。
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载体
一．载体的概念： 1.要把一个有用的基因通过基因工程手段送
到受体细胞，需要运载工具携带外源基因进入受 体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。
（1）需要ATP、Mg2+作辅助因子； （2）缺刻（Nick）DNA也可作该酶的底物。 （3）对粘性末端催化活性大于平头末端（酶量1：100）
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三、逆转录酶
（一）概述 逆转录酶也称反转录酶或RNA依赖的DNA 聚合酶。是由Baltimove和Mizutan于1970年分别各自 发现的，这两个小组论文同时在同一期Nature上，可 见其意义。该酶在逆转录病毒（retro virus）生产循 环中起主宰作用。
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PCR仪
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PCR仪
琼脂糖凝胶电泳
3-4 小时
最终产物
紫外光观察 73
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Log Target DNA
PCR 产物积累规律
Theoretical
Real Life
Cycle
PCR扩增中的“平台效应”，导致常规PCR技术对 最终产物总量定量的不可靠性。
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命名原则: HindⅢ
Haemophilus influenzae d菌株 流感嗜血杆菌d菌株的第3种酶
属 种 菌株 序
① 第一个字母是细菌属名的第一个字母，要大写；
② 第2、3个字母是细菌种名的前两个字母，要小 写；
上述字母都是用斜体。
③ 接着是细菌菌株的第一个字母，用正体字母书
写；
④ 如果同一菌株有不同的内切酶时，按发现次序
第八讲 分子生物学研究方法
--DNA、RNA及蛋白质操作技术（1）
刘志鹏
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内容
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA 基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术
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没有学习的创新是白日梦， 没有创新的学习是噩梦。
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实验室的两个基本原则
1.学会对照 CK+ CK2.学会调整
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科学技术发展的综合化
1. 19世纪中叶以前，科学与技术是 分离的，它们各有独自文化传统，它们的 发展往往是脱节的。
2. 科学回答“是什么”“为什么”， 技术回答“做什么”“怎么做”。当今科 技发展已经密不可分，科学里包含技术， 技术里体现科学。
分别 用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……表示。
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识别序列：
每种限制性内切酶都有一个它所识别、结合并切 割的特异序列，称为限制性位点或切点（4~8bp）。
识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
即反向重复结构，其两侧核苷酸排列呈回文对称的 序列。
BamHⅠ
GGA TCC CCT AGG
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如果用一种限制酶，切割两种不同的DNA时， 产生相同的末端，混合后“退火”，这两种不同的 DNA分子彼此可以连接，形成重组DNA分子。
原因是此克隆非彼克隆，多利取自功能彻底分化的成年
动物乳腺细胞，即体细胞。它推翻了遗传学上一条上百
年的定律：体细胞功能高度分化，不可能重新发育成个
体。
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多利诞生的过程 为什么震惊和惊呼，我们先了解一下多利诞生的过程以
及胚胎细胞克隆和体细胞克隆的区别这两个基因备用。 2. 取出第二只母羊未受精的卵细胞，取出基因换上第一
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载体的构成
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1. Ori－复制起始点（origin，ori） （1）决定质粒自我增殖和拷贝数的主要元件。 （2）使繁殖后细胞维持一定量的拷贝数。 （3）一个质粒只含一个ori，构成一个独立的复制子。 （4）穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子，以确保两 类细胞中都能扩增。 （5）基因工程使用松弛复制子，以获得更多的基因产 品。 松弛复制子的特点