分子生物学第五章 分子生物学研究法--DNA、RNA及蛋白质操作技术
现代分子生物实验技术PPT(上)
3. Ct值与起始模板的关系 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数(Log值）存在线 性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的 标准品可作出标准曲线，其中纵坐标代表起始拷贝数的对数， 横坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准 曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
• 将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合 适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有 重nomic library: a storable collection of cellular clones that contains copies of every sequence in the whole genome inserted into a suit基因, 也可以克隆调控基因, 有利于研究基因的结构、功 能和调控机理。
常用的琼脂糖凝胶电泳缓冲液
缓冲液 Tris-乙酸 （TAE） 工作溶液 1×:0.04mol/L Tris-乙酸 0.001mol/L EDTA 贮 存 液（1000 ml） 50×: 242g Tris 57.1ml冰乙酸 100ml0.5mol/L EDTA （pH8.0） 10×: 108g Tris 15.5ml85%磷酸（ 1.679g/ml） 40ml 0.5mol/L EDTA （pH8.0） 5×: 54g Tris 27.5g 硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA （pH8.0）
核酸电泳技术要点
• 制备凝胶：准确称取琼脂糖粉末，以电泳缓冲液（ TAE/TBE）溶解，微波加热至沸腾，待温度降至约60℃ 时，加EB液，混匀后，迅速倒入预先制好胶槽内。 • 电泳：随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，对于大分 子DAN片断。电场强度不宜高于5V/cm。 但对于小片断的 DNA可以5-20 V/cm电压电泳。
分子生物学研究法DNARNA及蛋白质操作技术
• PCR反应条件957502℃
Taq• PCR过程
• PCR的特点
Taq
Taq
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• PCR反应条件72℃ • PCR过程 • PCR的特点
第2轮结束
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第模1板轮D扩N增A 第2轮扩增
重复30轮后
2 =1,073,741,824 • PCR反应条件
• PCR过程 第3轮扩增
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PCR反应的全过程，即三步，可以被不断重复： •DNA解链（变性）， •引物与模板相结合（退火）， •DNA合成（链的延伸）。
经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合 位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n。
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PCR的主要步骤
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重组DNA操作过程：
获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种分子后，将其重新导入到 寄主细胞中，通过细菌（如：大肠杆菌）转化，选择转化子，通过筛选，获得 DNA重组表达。 并可在宿主细胞中保持下来，也可以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。
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55 酶
22
12
3
高温变性 低温退火 适温延伸
DNA 2
形 成
条 单 链
变 性
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
时间（min）
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
4
5
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PCR的基本原理
• PCR反应条件95℃ • PCR过程 • PCR的特点
分子生物学课程教学大纲
分子生物学课程教学大纲课程名称：分子生物学（Molecular Biology）课程编号：1313072215课程类别：专业课总学时数：68 课内实验时数：18学分：3.5开课单位：生命科学学院生物技术教研室适用专业：生物技术适用对象：本科（四年）一、课程的性质、类型、目的和任务分子生物学为高等学校生物技术专业学生必修的一门专业基础课，是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，主要研究核酸、蛋白质等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
通过分子生物学的教学，应使学生了解分子生物学的发展历史以及最新研究成果；熟练掌握DNA的结构与功能、RNA在蛋白质合成中的功能、蛋白质的结构与功能、遗传密码及基因表达调控的本质；了解现代分子生物学基本研究方法，并能运用分子生物学的理论知识分析、研究和解决问题，为进一步学习有关专业课程及从事基因工程领域的研究工作奠定基础。
二、本课程与其它课程的联系与分工从学科角度来讲，分子生物学涵盖面非常广，与生物学、生物化学和细胞生物学、遗传学等生命科学课程有交叉，《生物化学》是先修课程。
三、教学内容及教学基本要求[1]表示“了解”；[2]表示“理解”或“熟悉”；[3]表示“掌握”；△表示自学内容；○表示略讲内容；第一章绪论第一节引言创世说与进化论[1]；细胞学说[2]；经典的生物化学和遗传学[3]；DNA的发现[2]第二节分子生物学简史[1]第三节分子生物学研究的主要内容分子生物学的含义[3]；DNA重组技术、基因工程技术概念[3]；分子生物学研究的主要内容[3]第四节展望分子生物学的一些分支学科[1]；分子生物学发展的趋势[1]重点：分子生物学的含义和研究内容难点：分子生物学的研究内容教学手段：多媒体教学教学方法：讲授法作业：1．简述阵德尔、摩尔根和沃森等人对分子生物学发展的主要贡献。
分子生物学研究法上DNARNA及蛋白质操作技术分子生物精选全文
可编辑修改精选全文完整版第五章分子生物学研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因之一是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。
基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。
基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增殖能力和表达。
因此，基因工程技术其实是核酸操作技术的一部分，只不过我们在这里强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。
事实上，这种跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。
本章将在回顾重组DNA技术发展史的基础上，讨论DNA操作技术、基因克隆、表达分析技术及蛋白质组学、单核苷酸多态性分析等现代生物学领域里最广泛应用的实验技术和方法。
5. 1 重组DNA技术史话近半个多世纪来，分子生物学研究取得了前所未有的进步，概括地说，主要有三大成就：第一，在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。
但是，由于缺乏有效的分离和富集单一DNA分子的技术，科学家无法对这类物质进行直接的生化分析。
事实上，DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生与发展。
因为重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease，RE）和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接，所以，科学家认为，这些工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件（表5-1）。
分子生物学内容方法
分子生物学内容方法
分子生物学是一门研究生物分子的结构、功能和相互作用的学科。
该学科主要研究DNA、RNA、蛋白质等分子在生物体内的生物学功能以及它们之间相互作用所涉及的分子机制。
分子生物学的主要研究方法包括：
1. DNA克隆技术：通过PCR反应将DNA片段扩增、定向切割并插入载体，构建出可以自我复制的DNA分子。
2. 基因编辑技术：包括CRISPR-Cas9等可精准调整基因序列，实现基因改良。
3. 蛋白表达速成技术：如GST-tag、6xHis-tag等融合表达，简化蛋白纯化步骤，提高表达纯度。
4. PCR技术：多项PCR技术可扩增DNA样品，在基因诊断、疾病检测、病菌检测和基因操作等方面有广泛应用。
5. 蛋白质鉴定技术：包括2D PAGE、Tandem Mass Spectrometry 等，可对蛋白质进行鉴定、定量和分析。
这些方法在研究生物分子间相互作用以及调控机制方面具有广泛应用，对于生命科学领域的研究和实际应用具有重要意义。
分子生物学第五章分子生物学研究法(上)
分子生物学第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术第三节RNA操作技术第四节SNP的理论与应用第五节基因克隆技术第六节蛋白质组与蛋白质组学技术夏玉琼2013-10-10目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建切割位点用四碱基特异性的限制性内切酶部分消化DNA 片段，有的仍有切割位点质粒DNA将DNA 克隆进质粒DNA细菌克隆每个细菌都带有不同片段的DNA细菌转化分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建cDNA的长度0.5-8 kb载体：质粒载体和噬菌体类载体完整的cDNA文库包含大于5*105的独立克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学基因文库的筛选含义通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程筛选方法核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学核酸杂交法培养基上的菌落盖上硝酸纤维素膜移去硝酸纤维素膜裂解、中和去除细菌蛋白DNA 印迹32P 标记探针杂交放射自显影图像挑出阳性克隆保存母板分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学PCR筛选法需获得基因特异性引物将整个基因文库保存在多孔培养板上用设计好的基因探针对每个孔PCR筛选，挑出阳性的孔对阳性的孔再稀释到次级多孔板中PCR筛选重复稀释重复筛选直到与目的基因对应的单个克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学免疫筛选法文库铺于E.coli 形成噬菌斑转移到硝酸纤维素膜吸收λ噬菌体中表达的外源蛋白保存原板，加入一抗筛选膜上的噬菌斑印迹洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗加底物显色从保存板上挑出阳性噬菌斑一抗：第一抗体，识别目标蛋白二抗：抗体的抗体，能增强信号，增加该方法的灵活性分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术SNP的理论与应用SNP概述SNP的检测技术SNP的应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学SNP概述single nucleotide polymorphism,pronounced “snips”单核苷酸多态性基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性，发生频率1%或更高例如：某些人的染色体上的某个位置为A，而另外一些人的同样位置是T，染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记遗传标记：在遗传分析上用作标记的基因分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学第一代遗传标记：RFLPRFLP标记是发展最早的DNA标记技术。
分子学研究法——DNARNA及蛋
分子学研究法——DNA、RNA和蛋白质PPTxx年xx月xx日contents •引言•DNA和RNA的结构和功能•蛋白质的结构和功能•DNA、RNA和蛋白质的分析方法•分子学研究的应用•结论目录01引言1分子学研究的重要性23分子学研究对于理解生物体和疾病的机制至关重要分子学研究有助于疾病的预防、诊断和治疗分子学研究为新药发现和开发提供理论基础DNA是生物遗传信息的载体，负责编码生物体的所有特征RNA在细胞内扮演多种角色，包括转录、翻译和调节蛋白质是细胞内功能最丰富的分子，参与细胞构造、代谢和信号传导等DNA、RNA和蛋白质的生物角色分子学研究的历史和发展分子生物学起源于19世纪末，遗传学家孟德尔的实验研究分子生物学在20世纪末得到了迅速发展，推动了基因组学和蛋白质组学的研究20世纪中叶，DNA双螺旋结构被揭示目前，分子生物学已经渗透到生物学、医学和农学等多个领域，为人类健康和发展做出了巨大贡献02DNA和RNA的结构和功能DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链组成，通过氢键相互作用形成双螺旋结构。
DNA双螺旋结构脱氧核糖核苷酸是DNA的基本单位，由一分子脱氧核糖、一分子磷酸和一分子含氮碱基组成。
DNA的基本单位DNA是生物体的遗传物质，负责储存和传递遗传信息。
DNA的功能DNA的结构和功能03RNA的功能RNA在蛋白质合成过程中起关键作用，负责将DNA中的遗传信息转录成mRNA，并将氨基酸转运到核糖体中。
RNA的结构和功能01RNA的分类RNA分为信使RNA（mRNA）、转运RNA（tRNA）和核糖体RNA（rRNA）。
02RNA的结构RNA分子由核糖、磷酸和含氮碱基组成，通过磷酸二酯键形成线性分子。
DNA和RNA的相互转化DNA和RNA在细胞内可以相互转化，DNA可以转录成mRNA，而mRNA可以翻译成蛋白质。
DNA和RNA在生物体内的相互作用DNA和RNA的遗传信息传递DNA中的遗传信息通过DNA复制传递给子代细胞，并通过mRNA的转录和翻译传递给蛋白质。
分子生物学考点整理1
分子生物学考点整理符广勇朱兰第一章．绪论一、分子生物学概念分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子结构与功能相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界奥秘、由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
二、重组DNA技术又称基因技术，是20世纪70年代初兴起的技术科学，目的是将不同的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。
三、基因表达的调控基因表达的调控主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA剪辑三个方面。
四、转录因子转录因子是能与基因5`端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。
第二章．染色体与DNA一、染色体上的蛋白质染色体上的蛋白质主要包括组蛋白和非组蛋白。
根据凝胶电泳性质可以把组蛋白分为H1、H2A、H2B、H3、H4。
这些组蛋白都含有大量的赖氨酸和精氨酸。
二、组蛋白的特性1．进化上的极端保守性不同种生物组蛋白的氨基酸组成是十分相似的，特别是H3、H4。
2.无组织特异性到目前为止，仅发现鸟类、鱼类及两栖类红细胞不含H1而带有H5，精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白这两个例外。
3．肽链上氨基酸分布的不对称性碱性氨基酸集中分布在N端的半条链上。
4.组蛋白的修饰作用包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化及ADP核糖基化。
5.富含赖氨酸的组蛋白H5三、HMG蛋白叫高迁移率蛋白四、真核细胞DNA序列的分类1.不重复序列2.中度重复序列3.高度重复序列重复序列的意义：若某一重复序列出现错误，对基因的影响不大，稳定性较高；在短时间内可同时产生大量的基因产物。
重复序列的应用:应用于分子标记的作用：卫星DNA（便于分子标记）和微卫星DNA五、真核生物基因组与原核生物基因组的区别1.真核基因组庞大，原核生物基因组小2.真核基因组存在大量的重复序列，原核基因组没有重复序列3.真核基因组大部分是非编码序列，原核基因组大多是编码序列4.真核基因组的转录产物为单顺反子，原核基因组转录产物多为多顺反子5.真核基因是断裂基因，有内含子结构，原核基因为连续基因，几乎没有内含子结构6.真核基因组存在大量的顺式作用原元件，包括启动子、增强子和沉默子等，原核基因组基本没有增强子和沉默子7.真核基因组存在大量的DNA多态性，原核基因组很少有8.真核基因组具有端粒结构，原核基因组没有端粒结构六、重叠基因（Overlapping gene）指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上的基因的组成部分。
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内容提要：
•重组DNA技术回顾 •DNA基本操作技术 •RNA基本操作技术 •SNP的理论与应用 •基因克隆技术 •蛋白质组与蛋白质组学技术
基因操作主要包括： • DNA分子的切割与连接； • 核酸分子杂交； • 凝胶电泳； • 细胞转化； • 核酸序列分析以及基因人工合成； • 定点突变和PCR扩增等。
2003 美国科学家完成狗基因组全序列测定 2004 中国科学家完成家蚕基因组全序列测定 2005 中、美、日科学家联合完成水稻基因组序
列测定 2005 美、德、日、意、以科学家完成黑猩猩基
因组全序列测定
限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定 碱基序列并从这个位点切开DNA分子。 第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在 1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序 列，将双链DNA分子在这个位点切开并产 生具有粘性末端的小片段。
重组DNA操作过程：
获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂 种分子后，将其重新导入到寄主细胞中，通过细 菌（如：大肠杆菌）转化，选择转化子，通过筛 选，获得DNA重组表达。 并可在宿主细胞中保持下来，也可以完整的形式 从细胞中被分离纯化出来。
重组DNA实验中常见的主要工具酶
5. 2 DNA操作技术
基因工程： 指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它 载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进 入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持 续稳定的繁殖和表达。 基因工程技术强调了外源核酸分子在另一种 不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。
5. 1 重组DNA技术回顾
三大成就： ① 在20世纪40年代Avery确定了基因的分细菌转化与目标DNA分子的增殖
细菌转化：一种细菌菌株由于捕获了另一种细菌菌株 的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。 •提供转化DNA的菌株叫作供体菌株； •接受转化DNA的细菌菌株称为受体菌株。 大多数细菌，正常条件下转化效率很低。 为了高效转化这些细菌，必需对受体细菌进行一些理 化处理，以增加它们获取DNA的能力。经历了这种 处理的细胞被称作感受态细胞（competent cells）。
核酸的凝胶电泳 自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺 （polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来， 按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已 经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及研 究蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。
琼脂糖是从琼脂中提纯到的。它由β-D半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合形成 的线性多聚糖。利用琼脂糖热溶液冷却 时能凝胶化的特点，采用不同浓度的琼 脂糖溶液，成球后可得到不同孔径的球 状凝胶，用于分离核苷酸类化合物。
凝胶电泳的基本原理： • 一种分子被放置到电场中，就会以一定的速度移 向适当的电极。把这种电泳分子在电场作用下的迁 移速度，叫做电泳的迁移率。 • 电泳迁移率与电场强度和电泳分子本身所携带的 净电荷数成正比，与片段大小成反比。 • 生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状 态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离子，在 电场中向正极的方向迁移。 由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量 的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此都能以同 样的速度向正电极方向迁移。
EB（Ethidium bromide，溴化乙锭），分子式： C21H20BrN3，熔点：260 - 262°C ，是一种高度灵敏 的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中 的DNA。 溴化乙锭用标准302nm 紫外光透射仪激发并放射出橙 红色信号，可用Polaroid 底片或带CCD成像头的凝胶 成像处理系统拍摄。 溴化乙锭可以嵌入碱基分子中,导致错配。溴化乙锭是 强诱变剂,具有高致癌性! EB可以被皮肤吸收。做实验时一定要带手套。
1 严禁随便丢弃。因为EB是强致癌性，而且易挥发， 挥发至空气中，危害很大。 2 废 EB溶液的处理方法 (1) 对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下处理： a. 将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml； b. 加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4 ，混匀，再加入 等量的25mol/L HCl，混匀，置室温数小时； c. 加入一倍体积的2.5mol/L NaOH，混匀并废弃。 (2) EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下处理： a. 按1mg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放 置1小时； b. 用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。 3 废EB接触物，如抹布，枪头。 一般回收至黑色的玻璃瓶中，定期进行焚烧处理。
•琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为 0.2~50kb之间。 •聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱 基对之间。 •凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小， 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。
在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（ethidium bromide，EtBr）染料对核酸分子进行染色， 然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地 检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每 条DNA带中仅含有0.05μg的微量 ，也可以 被清晰地检测出来。
双酶切
在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行 DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求， 只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子 上，才能在寄主细胞中进行繁殖。 具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载 体（vector）。如：病毒、噬菌体和质粒等小分子 量复制子都可以作为基因导入的载体。
DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问 题； ② 50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交 替问题； ③ 50年代末至60年代，提出了“中心法则”和操 纵子学说，阐明了遗传信息的流动与表达机制。
重组DNA技术史上的主要事件
（GMO转基因生物）