常用分子生物学技术的原理及其应用
常用分子生物学技术的原理及其应用
分子生物学技术是生物学领域中的重要工具，广泛应用于基础研究、医学诊断、药物研发等领域。
以下是常用的分子生物学技术及其原理和应用：1. PCR技术：PCR（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的方法，基本原理是通过DNA聚合酶酶在体外模拟DNA的复制过程，从而快速扩增目标DNA片段。
PCR技术在基因克隆、基因检测、DNA指纹分析等领域有着广泛的应用。
2. 基因克隆技术：基因克隆是将感兴趣的DNA片段插入到载体DNA 中，构建重组DNA分子的过程。
通过基因克隆技术可以获得大量目的基因的DNA序列，用于研究基因功能、表达调控等方面。
3. 蛋白质表达与纯化技术：蛋白质表达技术是将外源基因导入宿主细胞中，使其表达目的蛋白质的过程。
通过蛋白质表达与纯化技术，可以获得大量纯净的蛋白质样品，用于研究蛋白质结构、功能等。
4. 基因编辑技术：基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALENs和ZFNs等，可以实现对基因组特定区域的精准编辑。
基因编辑技术在疾病治疗、植物育种等领域有着巨大的潜力。
5. RNA干扰技术：RNA干扰是一种通过RNA介导的基因沉默机制，可使目标基因的mRNA水平下降，从而抑制基因表达。
RNA干扰技术在基因功能研究、疾病治疗等方面具有重要应用价值。
6. 蛋白质亲和纯化技术：蛋白质亲和纯化技术利用蛋白质与其结合物质之间的特异性相互作用，实现对目标蛋白质的选择性富集和纯化。
该技术在药物筛选、蛋白质相互作用研究等领域有着广泛应用。
7. 基因芯片技术：基因芯片是一种高通量的生物芯片技术，可同时检测上千个基因的表达水平。
基因芯片技术广泛应用于基因表达谱分析、疾病诊断、药物研发等领域。
8. 蛋白质组学技术：蛋白质组学技术主要包括蛋白质质谱分析、蛋白质组芯片等，用于研究蛋白质在生物体内的表达水平、翻译后修饰等。
蛋白质组学技术在疾病诊断、药物靶点鉴定等方面有着重要应用。
以上是常用的分子生物学技术及其原理和应用。
分子生物学中的PCR技术及其应用实例
分子生物学中的PCR技术及其应用实例PCR（聚合酶链反应）技术是一种重要的分子生物学技术，被广泛应用于基因分析、DNA测序、病因检测等领域。
本文将就PCR技术原理、扩增机制、优化技巧及其应用实例进行探讨。
一、PCR技术原理PCR技术是一种体外的DNA扩增技术，通过特定的引物和聚合酶的作用，在体外模拟DNA自然复制的过程，从而在短时间内扩增目标DNA片段。
该技术根据DNA双链分子在高温下变性再回复到原状态的特点，将DNA的变性、退火、延伸等过程结合在一起，实现DNA序列的指数级扩增。
二、PCR技术扩增机制PCR技术的扩增过程包括三个阶段：变性、退火与延伸。
1.变性阶段：将反应体系中DNA分子加热至90~95℃，使其双链分子变性为单链。
2.退火阶段：将反应体系中的温度降至50~65℃，使引物结合至目标DNA上，并通过引物特异性与目标DNA碱基互补，形成DNA单链结构。
3.延伸阶段：将反应体系中温度升至72℃，聚合酶结合引物上，开始向目标DNA上的方向进行DNA链延伸。
延伸的长度取决于引物长度和反应时间，延伸后生成新的DNA双链复合物，反复进行三个阶段的循环操作，最终可扩增数百万份目标DNA的分子。
三、PCR技术的优化技巧PCR技术使用方便，特异性好，扩增速度快，但仍然有一些问题需要注意：1.引物的设计：引物的设计是PCR技术的一个重要环节。
应选择特异性好、长度适当、与目标DNA序列互补性强的引物。
2.缩短扩增时间：PCR反应时间一般需要数小时，较大地限制了其应用范围。
在加大酶的浓度、优化反应体系中缩短PCR反应时间，可提高反应效率。
3.增加扩增产物数量：一般来说，反应体系中DNA数量的下限约为0.1ng。
可以通过调整引物浓度、酶浓度、反应体系条件，提高扩增产物数量。
四、PCR技术应用实例PCR技术在基因分析、DNA测序、病因检测等领域中被广泛应用。
以下分别介绍其应用实例：1.基因分析：PCR技术可用于DNA聚集的检测、DNA变异检测等基因分析中。
常用分子生物学技术的原理及其应用
常用分子生物学技术的原理及其应用概述分子生物学技术是现代生物学研究中应用广泛的一系列技术方法。
这些技术能够帮助科学家从分子水平上理解生物学系统的结构和功能，并促进相关研究的进展。
本文将介绍几种常用的分子生物学技术，并详细探讨它们的原理和应用。
1. 聚合酶链式反应（PCR）•原理：聚合酶链式反应（PCR）是一种体外合成DNA的方法，通过循环性反应使DNA的数量迅速扩增。
该技术主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA双链被加热使其解旋成两条单链。
在退火步骤中，引物与模板DNA序列互补碱基配对。
在延伸步骤中，热稳定DNA聚合酶将新的DNA链延伸。
•应用：PCR技术在生物学研究和临床诊断中有着广泛的应用。
它可以用于基因克隆、基因突变分析、DNA测序、DNA指纹鉴定等。
此外，PCR还常用于检测病原体、肿瘤标记物以及遗传性疾病的诊断。
2. 凝胶电泳•原理：凝胶电泳是一种分离DNA和蛋白质的常见方法。
该技术基于物质在电场中的迁移速度不同，利用电势差将分子分离开来。
DNA片段在凝胶中迁移速度与其大小有关，大片段迁移较慢，小片段迁移较快。
•应用：凝胶电泳广泛应用于DNA分析、蛋白质分析以及核酸杂交等实验中。
在分子生物学研究中，凝胶电泳可用于确认PCR扩增产物的大小，并进行DNA片段的分离和纯化。
此外，它还可以检测基因突变、遗传关系等。
3. 蛋白质电泳•原理：蛋白质电泳是一种分离和分析蛋白质的技术。
该技术基于蛋白质的大小、电荷和形状差异，利用电势差将蛋白质分离开来。
在电泳过程中，蛋白质样品被加载到聚丙烯酰胺凝胶中，并通过电场迁移。
•应用：蛋白质电泳在生物学研究和临床诊断中具有重要作用。
它可以用于鉴定蛋白质在细胞中的表达水平、研究蛋白质结构和功能以及检测特定蛋白质的存在与否。
此外，蛋白质电泳还用于分离和纯化重组蛋白质。
4. 核酸杂交•原理：核酸杂交是一种通过互补碱基配对而发生的分子相互作用。
通过标记的探针DNA或RNA与靶序列相互结合形成稳定的双链或三链结构，从而可进行检测和定位。
常用分子生物学技术的原理及其应用
酵母双杂交系统的应用 分析已知蛋白之间的相互作用 对蛋白质功能域的分析 分析未知蛋白相互作用 绘制蛋白质相互作用系统图 在药物设计中的应用
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三 种 印 迹 技 术 的 比 较
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实时PCR技术原理 实时PCR技术原理 PCR
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(略 )
第六节 遗传修饰动物模型的建立及应用 The establishment and application of heredityhereditymodified animal model
一. 转基因技术
采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎 干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。 干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。
医本<生物化学> 医本<生物化学>周爱儒 第六版
第二十二章 常用分子生物学技术的原理 及其应用
The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application
第一节
分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization and Blotting 库
是指一个包含了 某一生物体全部DNA 某一生物体全部 序列的克相关基因的克隆与鉴定 Cloning and identification of disease relative gene
分子杂交(nucleic acid hybridization) 一. 分子杂交
不同来源的单链核酸经退火形成双链结构的过程。 不同来源的单链核酸经退火形成双链结构的过程。
DNA DNA DNA RNA
基础：核酸的变性与退火 基础：
常用分子生物学技术的原理及应用
常用分子生物学技术的原理及应用一、PCR技术1.PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种常用的分子生物学技术，主要用于扩增DNA片段。
2.PCR技术的原理是通过添加DNA模板、引物和DNA聚合酶，以及一系列特定的温度循环，迅速扩增目标DNA序列。
3.PCR技术的应用广泛，如基因克隆、基因突变分析、疾病诊断等。
二、蛋白质电泳技术1.蛋白质电泳技术是用于分离和定量蛋白质的常用方法。
2.蛋白质电泳技术包括SDS-PAGE和蛋白质西方印迹等。
3.SDS-PAGE是一种蛋白质分子量分析方法，通过凝胶电泳分离蛋白质。
4.蛋白质西方印迹则用于检测特定蛋白质的表达，并通过特异性抗体与该蛋白质结合，产生特定的信号。
三、原位杂交技术1.原位杂交技术是研究基因表达和基因组结构的重要工具。
2.原位杂交技术通过结合特异性探针和标记物，用于检测目标序列在组织或细胞中的分布。
3.原位杂交技术有多种类型，如荧光原位杂交（FISH）和非放射性原位杂交等。
4.原位杂交技术在遗传学研究、疾病诊断和生物学研究中得到广泛应用。
四、基因克隆技术1.基因克隆技术是将特定DNA片段插入到载体DNA中的技术。
2.基因克隆技术的关键步骤包括：DNA片段的切割、载体DNA的选择和连接、转化等。
3.基因克隆技术在基因工程、重组蛋白质的表达以及基因功能研究等方面具有重要应用。
五、DNA测序技术1.DNA测序技术是用于确定DNA序列的方法。
2.DNA测序技术包括Sanger测序和高通量测序等。
3.Sanger测序是一种经典的测序方法，逐个位置确定DNA序列。
4.高通量测序技术通过并行测序大量的DNA片段，实现快速高效的DNA测序，并被广泛应用于基因组学研究、药物研发等领域。
六、蛋白质质谱技术1.蛋白质质谱技术是分析蛋白质结构和功能的重要方法。
2.蛋白质质谱技术包括质谱仪的使用和蛋白质样品的制备等。
3.蛋白质质谱技术能够快速鉴定蛋白质样品中的蛋白质组分，并定量分析特定蛋白质的表达水平。
分子生物学技术及其应用
分子生物学技术及其应用随着科技的不断发展，分子生物学技术已经逐渐成为了生物学前沿研究中的重要工具之一。
从最早的基因克隆技术，到现在的基因编辑和重编程技术，分子生物学技术已经广泛应用于药物研发、生物治疗、基因诊断等多个领域。
本文将着重介绍分子生物学技术的基本原理、主要应用及对未来科技发展的影响。
一、分子生物学技术的基本原理分子生物学技术是一种借助于分子生物学理论，利用各种化学和物理手段对生物大分子进行操作和研究的技术。
其基本原理在于利用生物大分子的物理性质和化学性质来进行分离、纯化和分析。
其中，分子生物学技术的核心是DNA分子的操作和研究。
DNA分子作为生物体内的遗传物质，其结构和功能的研究对于理解生物现象和生命本质有着重要作用。
因此，在分子生物学技术中，对于DNA的操作和研究显得尤为重要。
二、分子生物学技术的主要应用1. 基因克隆技术基因克隆技术是指将DNA分子从源生物体中剪切并插入到另一个宿主生物体中的技术。
其应用广泛，例如在基因疗法、基因工程、药物研发和农业生产等领域中都有重要的作用。
2. 基因编辑技术基因编辑技术是利用CRISPR-Cas9系统定点修改基因序列的技术。
其应用广泛，可用于基因治疗、基因诊断及疾病预防等领域。
3. DNA测序技术DNA测序技术是指通过对DNA分子的测序来分析DNA序列信息的技术。
其应用广泛，可用于遗传病诊断、药物研发、生态环境研究等领域。
4. 基因表达分析技术基因表达分析技术是指通过各种分析手段对基因表达水平进行分析的技术。
其应用广泛，可用于疾病诊断、药物研发、基因工程等领域。
5. 基因组编辑技术基因组编辑技术是指将基因组中的特定部位进行编辑的技术。
其应用广泛，可用于基因治疗、药物研发等领域。
三、分子生物学技术对未来科技发展的影响随着分子生物学技术的不断发展，其在生物医学、农业、环境保护、食品安全等领域中的应用越来越广泛。
分子生物学技术的出现和发展带来了许多新的机遇和挑战。
分子生物学 常用分子生物学技术的原理及应用
（三）基因突变
利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的 基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。
T G C
（四）DNA序列测定
将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工 作大为简化，也提高了测序的速度；
待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进 行序列测定，也可直接测定。
（五）基因突变分析
PCR与其他技术的结合可以大大提高基 因突变检测的敏感性 。
▪ 分子杂交： 不同来源的单链核苷酸链根据碱基互补原则形成
杂种双链的过程。
▪ 分子杂交的目的： 检测DNA和RNA
▪ 探针： 分子杂交中和待测核苷酸链碱基互补的被标记的
核苷酸链。
待测DNA或RNA
探针
碱基对间氢键
增色效应： DNA变性伴随260nm吸收值增高
减色效应： DNA复性伴随260nm吸收值降低
Taq
5’
Taq
5’
R
R
R Taq
R
Taq
R
l
R
3’
Extension Step
1. Strand Displacement
3’
5’
2. Cleavage
3’
5’ 3. Polymerization
3’
Complete
4. Detection
5’ 3’
PCR衍生技术
▪ 反向PCR ▪ 逆转录PCR ▪ 原位PCR ▪ 重组PCR ▪ 不对称PCR ▪ 多重PCR
酵母双杂交系统的建立基于对真核生物转录激 活因子结构与功能的认识
真核生物转录激活因子
DNA结合结构域 转录激活结构域
BD
AD
组件式：结构可互相分开 功能互相独立 空间较近时表现活性 中间序列对活性无影响
分子生物学常用技术(简化版)
Northern blot
类似于 Southern 印迹杂交的方法，用于 RNA 检测
in situ hybridization
原位杂交：特定 mRNA 的组织细胞分布
FISH Fluorescence in situ hybridization (FISH)：特定基因的染色体定位
反 Northern 杂交与 DNA 芯片
DNA解旋解链
DNA的体内复制
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
5’
3’
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
GGAUCG
5’
AUCGCG
5’
引物酶
引物酶
RNA引物
RNA引物
DNA解旋解链
引物合成
DNA的体内复制
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
核酸：测序、印迹、杂交、体外扩增技术 蛋白质：电泳与印迹、组学技术、相互作用
基本技术：
基因工程技术 转基因生物与基因敲除技术
综合技术：
基因诊断 基因治疗
应用技术：
第一节：核酸分子杂交
Molecular hybridization: 利用已知核酸序列 (探针/probe) 检测与其互补的未知核酸序列 用途： 确认核酸序列间同源性 对特定核酸序列进行定量 自核酸混合体中辨认特定核酸序列
1.什么是耐热 DNA 聚合酶
早期 PCR 曾使用 DNA 聚合酶 I
在高温时发生变性，每一循环都需要重新添加酶 延伸反应温度为 37℃，非特异性太多
目前常用 Taq DNA 聚合酶
纯化自嗜热水生菌 (Thermus aquaticus) 可耐受 95℃ 高温，最适反应温度为 72℃ 左右
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是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排
列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧
光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等 对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的 荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出 定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列
(DNA microarray)。
目录
基因芯片工作流程示意图
目录
二、蛋白质芯片
蛋白质芯片(protein
chip)
是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点 阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反
应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统
对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。
蛋白质芯片作用原理
蛋白质分子间的亲和反应
目录
第五节 生物大分子相互作用研究技术
The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study
术也被用于研究 RNA 结合蛋白和特定 RNA 序列间
的相互作用。
目录
凝胶迁移实验结果示意图
未标记探针 核蛋白提取物 标记探针
10X
1X
1X
10X 1X
10X 1X
1X
结合有蛋白的探针
放 射 自 显 影
未结合探针
目录
（二）染色质免疫沉淀法
染 色 质 免 疫 沉 淀 技 术 (chromatin
目录
Cycle 3
5 5 5 5 5 5 5 5
5 5
5 5
5 5
5
5
25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
目录
PCR技术原理示意图
目录
PCR的基本反应步骤 变性 95˚C
延伸 72˚C
退火 Tm-5˚C
目录
PCR体系基本组成成分
目录
（二）基因突变
利用 PCR 技术可以随意设计引物在体 外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突 变等改造。
（三）DNA和RNA的微量分析
PCR 技术高度敏感，对模板 DNA 的 量要求很低，是 DNA 和 RNA 微量分析的
最好方法。
目录
（四）DNA序列测定
将 PCR 技术引入 DNA 序列测定，使测序 工作大为简化，也提高了测序的速度； 待测 DNA 片段既可克隆到特定的载体后 进行序列测定，也可直接测定。
探针类
目录
图20-3 TaqMan探针法实时PCR原理示意目录基因(genelibrary)
是指一个包含了某一生物体全部D
一、蛋白质相互作用研究技术
常用蛋白质相互作用的研究技术
• 酵母双杂交 • 各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）
• 荧光共振能量转换效应分析
• 噬菌体显示系统筛选
目录
（一）标签蛋白沉淀
标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱
原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。 标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋 白分子是否存在直接物理结合、分析两一定条 件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的 cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形 式贮存着该组织细胞的基因表达信息。
目录
第四节
生物芯片技术
Biological Chip Technique
目录
一、基因芯片
基因芯片(gene
chip)
目录
一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交
(nucleic acid hybridization)
在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链
分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一
起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定
的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形
成杂化双链(heteroduplex) 。
immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可
以研究体内 DNA 与蛋白质相互作用的 主要方法。
目录
染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图
目录
目录
其他：
斑点印迹 (dot blotting)
原位杂交 (in situ hybridization)
DNA点阵 (DNA array)
DNA芯片技术 (DNA chip)
目录
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
目录
②
①
③
分子杂交实验
放 射 自 显 影 照 片
目录
DNA芯片 技术
目录
第二节
（五）基因突变分析
PCR与其他技术的结合可以大大提高基 因突变检测的敏感性 。
目录
三、几种重要的PCR衍生技术
（一）逆转录PCR技术
• 逆转录PCR(reverse transcription PCR，RTPCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合 应用的一种技术。 • RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因 以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分 析的最有效方法。
• 将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成 为“诱饵”表达质粒，录
二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术
（一）电泳迁移率变动测定
电泳迁移率变动测定 (electrophoretic mobility
shift assay ， EMSA) 或 称 凝 胶 迁 移 变 动 实 验 (gel shift assay) 最 初 用 于 研 究 DNA 结 合 蛋 白 与 相 应 DNA 序列间的相互作用，可用于定性和定量分析， 已经成为转录因子研究的经典方法。目前这DNA的 信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA
片段形。目录基因组和cDNA的构建和筛选目录
基因组筛选结果举例第一轮筛选第二轮筛选
第三轮筛选
目录
（二）原位PCR技术
• 原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片
上的单个细胞内进行的 PCR 反应，然后用特异
性 探 针 进 行 原 位 杂 交 ， 即 可 检 出 待 测 DNA 或
RNA是否在该组织或细胞中存在。 • 原位 PCR 方法弥补了 PCR 技术和原位杂交技术 的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的 一种最佳方法。
目录
（三）实时PCR技术
实时PCR(real-time PCR)技术通过动态 监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积 对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。
目录
实时PCR技术原理
荧光标记引物
3'
R
Q
5'
上游 引物
5'
下游 3' 引物
R
3' 5'
Q
5' 3'
目录
实时PCR分类：
非探针类 实时PRC 1. TaqMan探针法 2. 分子信标探针法 3. FRET探针法
生物化学与分子生物学
目录
第二十章
常用分子生物学技术的 原理及应用
The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology
目录
第一节 分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization and Blotting Technique
目录
二、印迹技术的类别及应用
（一）DNA印迹 (Southern blotting)
用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。
（二）RNA印迹 (Northern blotting)
用于RNA的定性定量分析。
（三）蛋白质的印迹 (Western blotting)
用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
目录
复性
RNA
D理方法使电泳胶中的生物大分子 转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。 这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因 此称之为“blotting”，译为印迹技术。
目录
（二）探针技术
用放射性核素、生物素或荧光染料标记其 末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为 “探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷 酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。
合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结
合的未知分子。
目录
标签融合 蛋白沉淀 实验流程 示意图
目录
（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途
目录
酵母双杂交系统的应用
• 证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用
的生物信息学推测。
• 分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的
相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。
PCR技术的原理与应用
The Principle and Application of
PCR Technology
目录
一、PCR技术的工作原理
Template DNA
5
5
5
Primer 1 5 Primer 2
Cycle 1
5 5
5
5
Cycle 2
5
5
5 5
5 5
5
5
• 模板DNA
• 特异性引物
• 耐热DNA聚合酶
• dNTPs
• Mg2+
目录
二、PCR技术的主要用途
（一）目的基因的克隆
• 利用特异性引物以 cDNA 或基因组 DNA 为模板获
得已知目的基因片段, 或与逆转录反应相结合，直
接以组织和细胞的mRNA为模板获得目