常用的分子生物学基本技术

外进行特定的DNA片断高效扩增的技术，可检出微量靶序列（甚至少到 1个拷贝）。在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依 赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。仅需用极少量模板，在一对引物介导 下，在数小时 内可扩增至100万-200万份拷贝。PCR反应分三步：变 性、退火及延伸。以上三步为一循环，每一循环的产物作为下一个的模 板，这样经过九小时的循环，每一循环的产物作为下一个循环的模板， 这样经过数上时的循环后，可得到大量复制的特异性DNA片段。反应条 件一般为94℃变性30秒，55℃退火30秒，70-72℃延伸30-60秒，共进 行30次循环左右，最后再延伸72℃5分钟，4℃冷却终止反应。 1.逆转录PCR(RT-PCR)用来扩增RNA的方法。 2.竞争逆转录PCR(competitive reverse transcription-polymerase chain rection C-RT-PCR)低丰度RNA定量的好方法。 3.多重PCR（multiples PCR）在同一PCR体系中加入多对引物可用于基 天长度很长，发生多处缺失的觳狻＠┰鐾荒０宓募父銮颉?br> 4.多种PCR可同时加入多套以生物素标记的引物起进手PCR反应。 5.反向PCR（iverse polymerase chain reaction）对一个已知的DNA片段 两侧的未知序列进行扩增和研究。 6.不对称PCR在扩增循环中引入不同引物浓度，以得到单链DNA并进行 列测定，以了解目的基因的序列。 7.锚定PCR（anchored polymerase chain reaction）帮助克服序列未知 或序列未全知带来的障碍。在未知序列未端添加同聚物尾序，将互补的 引物连接于一段带限制性内切酶位点的锚上，在锚引物和基因另一侧特 异性引物的作用下，将未知序列扩增出来。 8.着色互补试验或荧光PCR（color complementation assay or fluorescent PCR）原理是用不同荧光染粒，分别标记于不同寡核苷酸引 物上，同时扩增多个DNA片段，反应完毕后，利用分子筛选去多余的引 物。用紫外线照射扩增产物，就能显示某一DNA区带荧光染料颜色的组区带缺 失，则会缺乏相应的颜色。
制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。 主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子 完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的 DN一种是cDNA库。 载体 所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工 具。 细菌质粒 是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为120kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。质粒载体 是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。最常用的质粒是pBR322。 噬菌体（phaeg） 噬菌体是感染细菌的病毒，按其生活周期分为溶菌型 及溶原型两型。用野生型λ噬菌体改造和构建的噬菌体载体是线性双链 DNA，基因组约为50kb，最常用的哓菌体为λDNA及其衍生系列。 黏性质粒（cosmid） 杂种DNA。 是由质粒与噬菌体λDNA组成的一种4-6kb的环状
常用的分子生物学基本技术 核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生 物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的 制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是 具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子 强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针 （probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的 基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他 活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或 RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷 酸探针、RNA探针等。 固相杂交 固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质 （硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印 迹杂交。 斑步杂交（dot hybridization） 是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好 的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性 内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样 品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法 的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定 比例的假阳性。 印迹杂交（blotting hybridization） Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶 上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相 支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反 应，用放射性自显影或酶反应显色，检测特定大小分子的含量。可进行 克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分
表达型载体 将上述细菌质粒载体或噬菌体载体接上启动基因及多聚核 糖体的基因序列组成了表达型载体。 基因库的建造 含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光 趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等 方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进 一步的 研。其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制 备；（3）DNA片段与载体DNA的连接；（4）包装和接种。 cDNA库的建造 是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。cDN单链与放射笥核素标记的已知的酸单链（探针）在 溶液中保温，使之形成杂交复合物。反应结束后，用羟磷灰石法或酶解 法将未被杂交的单链和杂交双链分开，然后结膈后在杂妆分子中的探针 量，就可推算出被测的核酸量。 递减杂交（subtractive hybridizatio） 是利用两种来源一致而功能不同的组织细胞提取mRNA（或逆转录成的 cDNA）,在一定的条件下以过量的驱动mRNA或cDNA与测试的单链 cDNA或mRNA进行液相杂交，通过羟基磷灰石柱层析筛选除去两者间同 源的杂交体。经多轮杂交策选、除去两者之间相同的基因成分，保留特 异表达的序列。 核酸原位杂交 用特定标记的已知顺序核酸作为探针与细胞级或组织切片中核酸进行复 性杂交并对其实行检测的方法，称为核酸原位杂交（nucleic acid hybridization in situ）。用来检测DNA在细胞核或染色休上的分布，与 细胞内RNA进行杂交以研究该组织细胞中特定基因表达水闰；还用于细 胞、组织中有无特异性菌、病毒检测的研究。 该法的优点是特异性高，可精确定位；能在成分复杂的组织中进行单一 细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响；不需要从组织中提取核 酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性；并可完整地保持组 织与细胞的形态。因此被广泛应用于医学生物学的研究，如基因定位、 基因制失，基因易位、特异基因整合部物色检测等研究。近年来由定性 发展到定量，方法更为完善。 DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术） 在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的 过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步骤包括：制备目的基因→ 将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿 主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。载体（vecors）在细胞内自我复
特异基因的筛选 常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测 其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异 抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。 核酸序列测定 DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析 （测序， sequencing）是分子生物学重要的基本技术。无论从基因库中筛选的癌 基因或经PCR法扩增的基因，最终均需进行核酸序列分析，可藉以了解 基因的精细结构，获得其限制性内切酶图谱，分析基因的突变及对功能 的影响，帮助人工俣成基因、设计引物，以及研究肿瘤的分子发病机制 等。测序是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来 的。目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化学降解少和Sanger的双脱 氧法等，近年来已有DNA序列自动测定仪问世。化学降解法是在DNA的 片段的5`端标记核素，然后用专一性化学试剂将DNA特异地降解，在电 泳和自显影后，可得到从标记端延伸的片段供测读序列和进行比较。一 般能读出200-250个核苷酸序列。双脱氧法是采用核苷酸链终止剂， 如：2`，3`-双脱氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和 ddCTP中的一种)掺入到DNA链中以终止链的延长，与掺入4种正常的 dNTP的混合物分成四组进行反应，这样可得到一组结尾长衙不一、不 同专一性核苷酸链终止剂结尾的DNA片段，经凝胶电泳分离和放射自显 影，可读出合成的DNA核苷酸序列，根据碱基互补原则，可推算出模板 DNA分子的序列。 化学降解法只需一化学试剂，重复性好，容易掌握；而双脱氧法需单链 模板、特异的寡核苷酸引物及高质量的DNA聚合酶，便随着M13噬菌体 载体的发明和运用，合成的引物容易获得，测序技术不断改进，故此法 已被广泛应用。基脱氧法的自动激光荧光测序仪，使测工作更快速和简 便，而且保证高度重复性。至于RNA测序现大多采用将mRNA逆转录成 cDNA后同测序，然后反推RNA序列 聚合酶链反应技术 聚合酶链反应技术简称PCR技术，是一种利用DNA变性和复性原理在体
析及限制性长度多态性分析（RELP）等。 Northern印迹杂交:由Southerm印杂交法演变而来，其被测样品是 RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后，转移到固相支持物上，进 行杂交反应，以鉴定基中特定mRNA分子的量与大小。该法是研究基因 表达常用的方法，可推臬出癌基因的表达程度。 差异杂交（differential 用两种混合 的不同cDNA探针（如：转移性和非转移性癌组织的mRNA逆转录后的 cDNA）分别与滤膜上的DNA杂交，分析两张滤膜上对应位置杂交信息 以分离差异表达的基因。适用于基因组不太复杂的真核生物（如酵母） 表达基因的比较，假阳性率较低。但对基因组非常复杂的盐酸核生物 （如人），则因工作量太大，表达的序列所占百分比较低（仅5％左 右），价值不大。 cDNA微点隈杂交（cDNA microarray hybridization） 是指将cDNA克隆或cDNA的PCR产物以高度的列阵形式排布并结合于固 相支持物上（如：尼龙膜或活化的载玻片）以微点阵，然后用混合的不 同DNA探针与微点阵上的DNA进行杂交。再利用荧光、化学发光、共聚 焦显微镜等技术扫描微点阵上的杂交信息。它比差异杂交技术的效率 高、速度快、成本低，适用于大规模的分析。已成商品问世。其缺点是 无法克服保守的同源序列及重序对杂交信息的干扰。 寡核苷酸微点隈杂交（oligonucleotide microarray hybridization） 是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使它共价结合于支持物表 面，与平均长度为20-50nt的混合RNA或cDNA探针进行杂交，以提高杂 交的特异性和灵敏度。应用共聚焦显微镜可检测跨越三个数量级的杂交 信息。适用于低丰度mRNA的检测，以区分基因家族不同成员的差异表 达特征，或鉴定同一转录在不同组织和细胞中的选择性剪接。但有工作 量较大、成本较高、速度较慢等弱点。 液相杂交（solution hbridization）