常用分子生物学技术
常用分子生物学技术的原理及其应用
分子生物学技术是生物学领域中的重要工具，广泛应用于基础研究、医学诊断、药物研发等领域。
以下是常用的分子生物学技术及其原理和应用：1. PCR技术：PCR（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的方法，基本原理是通过DNA聚合酶酶在体外模拟DNA的复制过程，从而快速扩增目标DNA片段。
PCR技术在基因克隆、基因检测、DNA指纹分析等领域有着广泛的应用。
2. 基因克隆技术：基因克隆是将感兴趣的DNA片段插入到载体DNA 中，构建重组DNA分子的过程。
通过基因克隆技术可以获得大量目的基因的DNA序列，用于研究基因功能、表达调控等方面。
3. 蛋白质表达与纯化技术：蛋白质表达技术是将外源基因导入宿主细胞中，使其表达目的蛋白质的过程。
通过蛋白质表达与纯化技术，可以获得大量纯净的蛋白质样品，用于研究蛋白质结构、功能等。
4. 基因编辑技术：基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALENs和ZFNs等，可以实现对基因组特定区域的精准编辑。
基因编辑技术在疾病治疗、植物育种等领域有着巨大的潜力。
5. RNA干扰技术：RNA干扰是一种通过RNA介导的基因沉默机制，可使目标基因的mRNA水平下降，从而抑制基因表达。
RNA干扰技术在基因功能研究、疾病治疗等方面具有重要应用价值。
6. 蛋白质亲和纯化技术：蛋白质亲和纯化技术利用蛋白质与其结合物质之间的特异性相互作用，实现对目标蛋白质的选择性富集和纯化。
该技术在药物筛选、蛋白质相互作用研究等领域有着广泛应用。
7. 基因芯片技术：基因芯片是一种高通量的生物芯片技术，可同时检测上千个基因的表达水平。
基因芯片技术广泛应用于基因表达谱分析、疾病诊断、药物研发等领域。
8. 蛋白质组学技术：蛋白质组学技术主要包括蛋白质质谱分析、蛋白质组芯片等，用于研究蛋白质在生物体内的表达水平、翻译后修饰等。
蛋白质组学技术在疾病诊断、药物靶点鉴定等方面有着重要应用。
以上是常用的分子生物学技术及其原理和应用。
2024版分子生物学常用技术共35张
电泳法
在电场作用下，利用蛋白质带电 性质和分子大小的差异进行分离， 如SDS-PAGE、双向电泳等。
亲和层析法
利用生物分子间的特异性相互作 用进行分离纯化，如免疫亲和层 析、金属螯合亲和层析等。
蛋白质鉴定和定量分析手段Fra bibliotek质谱法
通过测量蛋白质分子的质 量和碎裂模式进行鉴定和 定量分析，如MALDI-TOF MS、LC-MS/MS等。
信号传导途径涉及多种分子，包括受体、配体、信号转导蛋白和效应器等。
信号传导途径的异常与多种疾病的发生和发展密切相关，如癌症、神经退 行性疾病等。
受体介导信号传导途径研究方法
01
受体结合实验
利用放射性标记的配体或抗体， 检测受体与配体的结合情况，确 定受体的类型和数量。
02
信号转导蛋白活性 检测
通过检测信号转导蛋白的磷酸化、 去磷酸化等修饰状态，评估其活 性。
发展历程
自20世纪50年代以来，随着DNA双螺旋结构的发现、遗传密码 的破译、基因工程技术的建立等一系列重大突破，分子生物学 迅速崛起并渗透到生物学的各个领域，推动了整个生物科学的 飞速发展。
分子生物学研究内容
基因与基因组研究 包括基因的结构、功能、表达调控以 及基因组的结构、功能与进化等。
DNA复制、转录与翻译
工具使用
BLAST、Bowtie、BWA等软件进行序列比对；CAP3、Velvet、 SPAdes等软件进行序列拼接。
基因结构和功能预测方法
基因结构预测
通过识别编码区、非编码区、启动子、终止子等 元素，预测基因的结构和组成。
基因功能预测
利用基因表达谱、蛋白质互作网络、代谢通路等 信息，预测基因的功能和调控机制。
分子生物学中的重要技术方法
分子生物学中的重要技术方法分子生物学是研究生命分子机制的分支学科，是研究生命最小单位--分子的学科。
随着科技的不断发展，分子生物学中的技术不断更新，成为该领域研究不可缺少的工具。
本文将介绍分子生物学中的一些重要技术方法。
一、PCR技术PCR技术（Polymerase chain reaction）是一种通过体外扩增DNA序列的技术，是分子生物学领域中最重要的技术之一。
PCR 技术通过使用DNA聚合酶复制DNA片段，从而以指数级别扩增DNA，可以为后续的实验提供大量的DNA材料。
PCR技术的应用范围很广，包括基因定位、基因分型、基因克隆、基因转染等方面。
二、Western blotting技术Western blotting技术是一种常用的蛋白质检测方法。
它通过电泳将目标蛋白质从蛋白质混合物中分离出来，然后使用抗体检测目标蛋白质。
Western blotting技术可以检测蛋白质的表达水平以及定性，可以在研究蛋白质功能、蛋白质信号传导、蛋白质相互作用等方面发挥重要作用。
三、DNA测序技术DNA测序技术是一种检测DNA序列的技术。
DNA测序技术可以快速高效地对DNA进行测序，帮助研究者快速确定DNA序列，对基因组学、遗传学等领域的研究起到了至关重要的作用。
目前，主要的DNA测序技术有Sanger测序技术和下一代测序技术两种。
四、RNAi技术RNAi技术（RNA interference）是通过寡核苷酸干扰RNA打断特定的信使RNA从而靶向沉默目标基因的技术。
RNAi技术通过设计和合成RNA小分子干扰RNA（siRNA），可以沉默目标基因、进行基因功能验证、研究基因调控等方面发挥重要作用。
五、CRISPR-Cas9基因编辑技术CRISPR-Cas9是一种新型的基因编辑技术，通过指导RNA与Cas9蛋白共同识别和切割DNA，实现特定基因的切除、插入、修饰等操作。
CRISPR-Cas9技术是一种高效、简便、精准的基因编辑技术，可以用于植物学、动物学、微生物学等领域的研究，也是治疗基因遗传性疾病的有力工具。
分子生物学基本技术
分子生物学基本技术包括核酸的纯化，体外合成、分子杂交、基因克隆、基因表达研究技术等第一节DNA的体外合成一、DNA的化学合成（无要求）一亚磷酸三酯法DNA的化学合成广泛用于合成寡核苷酸探针和引物，有时也用于人工合成基因和反义寡核苷酸。
目前寡核苷酸均是用DNA合成仪合成的，大多数DNA合成仪是以固相亚磷酸三酯法为基础设计制造的合成的原理：核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载体上，然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序逐一接长。
每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作，由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上，所以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗涤的方法除去。
合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割下来并脱去各种保护基，再经纯化即可得到最终产物。
（末端核苷酸的3’-OH与固相载体成共价键，5’-OH被二甲氧基三苯甲基（DMT）保护，下一个核苷酸的5’-OH亦被DMT保护3’-OH上的磷酸基上氨基亚磷酸化合物活化碱基上的氨基用苯甲酸保护。
每延伸一个核苷酸需四步化学反应（1）脱DMT游离出5’-OH。
⑵缩合（偶联反应）：新生成的5’-OH与下一个核苷活化的3’单体缩合成亚磷酸三酯使链增长（3）盖帽（封端反应）：有少量（小于0.5%）未缩合的5’-OH要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。
（4）氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷（磷酸三酯）。
上述步骤循环一次，核苷酸链向5’方向延伸一个核苷酸二、聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）是一种体外特定核酸序列扩增技术。
一）PCR的基本原理双链DNA热变性成两条单链，降温使反应体系中的两个引物分别与两条DNA单链两侧的序列特异性复性，在合适的条件下，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，利用反应体系中的4种dNTP合成其互补链（延伸），在适宜的条件下,这种变性一复性一延伸的循环重复1次DNA的量可以增加1倍，30次循环后，DNA的量增加230倍。
分子生物学常用技术
切除所有结合与不 结合蛋白质的DNA 带，并用六氢吡啶 切割甲基化的G残 基
缺失的DNA带表 结合带 非结合带 明相应G残基的重 要意义，它得到 结合蛋白质的保 护
甲基化干扰实验
4、体内足迹实验
完整的细胞 × G G
DMS
裸露的DNA G G
× G
me
G
分离DNA并用 六氢吡啶切割
Me Me
G
G
PCR扩增 凝胶分析
1× 29× 1×
*This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any “unfinished” product from previous amplification to achieve its full length
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引 物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反 应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃ 延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增 产物的数量满足实验需求为止。
Reaction Condition for a Typical PCR Assay
2、诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）
1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝 胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行 核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交 技术十分类似，所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）。 而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后 同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技 术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Western blotting）。
分子生物学技术
分子生物学技术
分子生物学技术：
1、核酸技术
核酸技术是一种分子生物学手段，用于检测、分析及操纵生物分子，其中主要有聚合酶链式反应（PCR）、克隆、序列测定、探针和杂交以及核糖体克隆等过程，能够分析及操纵基因表达、调控等生物学现象。
采用核酸技术可有效检测和分析遗传突变体、重组基因、病毒感染和肿瘤等，包括许多关键步骤，如克隆、DNA提取、核苷酸序列测定、生物信息分析、蛋白质结构测定等，是生物科学领域最重要和基础的技术之一。
2、生物材料技术
生物材料技术是一种新兴的生物学技术，利用有机或无机天然材料制备的生物小体系以及各种生物标记和测试物质，用以揭示生物事件及其机制。
此技术不仅可以检测活性蛋白、核酸分子等物质，而且可用于替代人体实验和动物模型，具有更快捷、更小开成本等优势，可以快速进行基础研究、病原检测及定点药物的研发等多种应用。
3、单细胞膜免疫印迹
单细胞膜免疫印迹（sMFI）技术是一种准确而又灵敏的技术，可高效检测和分析单个细胞的内外分子环境，比如细胞表面CD4 / CD8受体的种类、状态和浓度变化。
这种先进技术不仅可以获得大量具有单细胞精确度的样本，而且可以快速界定病原体在犹太人细胞内的毒性等特征，为疾病诊断与治疗提供科学依据。
4、蛋白质组学技术
蛋白质组学技术是一种建立在分子生物学、生物化学等基础技术之上的新技术，也称蛋白质质谱技术。
它可以用于研究特定生物体内不同组织和细胞中的蛋白质表达，从而分析生物体关键细胞组成部分及它们之间的关系。
其主要步骤包括组织提取、蛋白组分离、蛋白鉴定和蛋白质序列鉴定等。
利用蛋白质组学技术，可以揭示和分析不同疾病状态下特异蛋白的表达、结合和变化，为研究和治疗疾病提供重要依据。
分子生物学常用技术
分子生物学常用技术一．琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取的。
当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质，其密度是由琼脂糖的浓度决定的。
经过化学修饰的低熔点（LMP）的琼脂糖，在结构上比较脆弱，因此在较低的温度下便会熔化，可用于DNA片段的制备电泳。
凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关（见表）。
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2～50kb之间；而要分辨较小分子量的DNA片段，则要用聚丙烯酞胺凝胶，其分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间。
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小。
浓度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越强，反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱，例如，20％的聚丙烯酰胺凝胶的分辨力可达1～6 bpDNA小片段，而要分离1000bp的DNA片段，则要用3％的聚丙烯酚胺的凝胶。
再如，2％的琼脂糖凝胶可分辨小到300bp的双链DNA分子，而对于较大片段的DNA，则要用低浓度（0.3％～1.0％）的琼脂糖凝胶。
琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力凝胶类型及浓度分离DNA片段的大小范围(bp)0.3％琼脂糖 50 000 ～1 0000.7％琼脂糖 20 000 ～1 0001.4％琼脂糖 6000 ～ 3004.0%聚丙烯酰胺 1 000 ～ 10010.0%聚丙烯酰胺 500 ～ 2520.0%聚丙烯酰胺 50 ～ 1凝胶电泳既是一种分析的手段，也可以用来制备和纯化特定的DNA片段。
有两种不同类型的琼脂糖凝胶，一种是常熔点的，另一种是低熔点的，而后者的价格却相当昂贵。
它们都是琼脂的衍生物，具有很高的聚合强度和很低的电内渗，因此都是良好的电泳支持介质。
LMP琼脂糖是一种熔点为62～65℃的琼脂衍生物，它一旦熔解，便可在37℃下持续保持液体状态达数小时之久，而在25℃下也可持续保持液体状态的10分钟， LMP琼脂糖可以不经电洗脱或破碎凝胶，即可用来回收ＤＮＡ分子。
分子生物学常用实验技术概述
分子生物学常用实验技术概述分子生物学是研究生物大分子（如DNA、RNA和蛋白质等）组成、结构和功能的科学领域。
在分子生物学的研究中，常用各种实验技术来解析生物大分子的结构和功能，为科学研究和应用提供依据。
下面将概述一些常用的分子生物学实验技术。
1.PCR（聚合酶链式反应）：PCR是一种能在体外快速扩增DNA序列的技术，可以从一个DNA模板扩增出百万倍的DNA片段。
PCR包括三个步骤：变性、退火和延伸。
通过PCR，可以在短时间内扩增大量特定的DNA 片段，并常应用于基因分析、疾病诊断以及基因工程等领域。
2.转基因技术：转基因技术是将外源基因导入到目标生物体细胞中，使其表达外源蛋白或产生新的表型。
转基因技术通常包括四个步骤：基因分离、基因克隆、基因传递和基因表达。
转基因技术在农业、医学和生物科学研究中具有广泛的应用。
3.蛋白质电泳：蛋白质电泳是根据蛋白质的电荷和大小差异将其分离的一种方法。
常用的蛋白质电泳方法包括SDS-和二维电泳。
蛋白质电泳可用于纯化蛋白质、分析蛋白质组成以及检测蛋白质的修饰。
4.蛋白质质谱：蛋白质质谱是一种分析蛋白质的结构和功能的方法。
常用的蛋白质质谱技术包括MALDI-TOF质谱和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）。
蛋白质质谱可用于鉴定未知蛋白质、确定蛋白质的氨基酸序列以及检测蛋白质的修饰等。
5.分子克隆：分子克隆是将外源DNA或RNA序列插入到载体DNA中，并通过细胞转染等方法将其导入到目标细胞中进行表达的过程。
分子克隆常用的方法包括限制性内切酶切割、连接反应、质粒构建和转染等步骤。
分子克隆技术可用于分析、表达和研究目标基因。
6. Northern blotting：Northern blotting是一种检测RNA的方法，常用于检测特定的mRNA分子。
在Northern blotting中，通过RNA的电泳分离、转移、固定以及杂交等步骤，可以检测目标RNA的存在和表达水平。
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（四）其他杂交技术
2. Western印迹（Western blot） 又称蛋白质印迹，是用于目的蛋白质定位检测
的实验方法。 其过程与Southern印迹相似： 将电泳分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜或尼
龙膜上，再以免疫反应或亲和反应检测经电泳分离 的样品中能与免疫反应或亲和反应的标记配体特异 性结合的蛋白质区带。
针
回收含已知基因的 的
DNA片段，并标记 制
基因探针
备
检测 样品 核酸 序列 检测
杂 交 (待测样品与探针的复性) 洗 膜( 除去多余未杂交探针 )
放射自显影
核酸杂交技术的基本过程
分离
转膜
杂交
自显影
（四）其他杂交技术
1. Northern印迹（northern blot） 应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术。
1. 在个体识别中的应用
S 嫌疑人DNA E 现场DNA证据 V 受害人DNA （V右侧是另一嫌疑人）
（六）核酸杂交技术的应用
（2）在产前诊断中的应用
子代
父亲 缺陷基因 正常基因
缺陷基因 正常基因
母亲
等位基因全缺陷 为患病胎儿 应终止妊娠
带一缺陷基因 可继续妊娠
带一缺陷基因 可继续妊娠
基因正常 可继续妊娠
是否存在某段核酸特征序列而人工设计的、能够与 靶分子核酸按碱基互补原则特异性相互作用的一段 已知序列的寡核苷酸或核酸。
（二）核酸探针
2. 核酸探针的标记 核酸探针的标记是指探针以共价键形式结合能
够产生强烈信号的基团、原子或能够与一些产生强 烈信号分子特异性结合的配体。
核酸探针标记的目的 利用探针的标记物特定性质来跟踪检查探针， 从而确定是否存在核酸靶序列或者确定核酸靶分子 所在位置。
该方法在1975年由Southern首先创建，故该 方法又称为Southern印迹（Southern blot）。
待检测核酸样品的制备
标记探针的制备
检测样品中是否存在目标序列
（三）DNA杂交技术
1. 样品的制备 ① 核酸样品的提取分离 ② 酶切、电泳分离、核酸变性等 ③ 样品核酸转移到硝酸纤维膜或尼龙膜 ④ 预杂交：封闭硝酸纤维膜或尼龙膜上核酸结 合位点，防止探针直接与膜结合
依据待检测样品的性质，生物芯片又分为基因 芯片（DNA芯片）、蛋白质芯片、细胞芯片、组织 芯片等。
基因芯片
又称为DNA芯片，是将DNA以大规模阵列的形 式排列，形成了可与目的分子相互作用的固相表面。 基因芯片与目的分子作用后激发出不同波长荧光， 通过计算机分析结果。
基因芯片检测原理
蛋白质芯片及其应用
第六章 常用分子生物学技术
Common Molecular Biology Technique
陈耕夫 生物化学与分子生物学系 基础学院 广东药学院
主要内容 一、分子杂交技术 二、目的基因制备技术 三、遗传修饰动物模型的建立 四、RNA干扰技术 五、蛋白组学研究常用技术
一、分子杂交技术
（一）什么是核酸杂交？ （二）核酸探针 （三）DNA杂交技术 （四）其他杂交技术 （五）生物芯片 （六）核酸杂交技术的应用
主要内容 一、分子杂交技术 二、目的基因制备技术 三、遗传修饰动物模型的建立 四、RNA干扰技术 五、蛋白组学研究常用技术
二、目的基因制备技术
（一）什么是目的基因 （二）聚合酶链反应 （三）基因组DNA （四）cDNA （五）化学合成
二、目的基因制备技术
（一）什么是目的基因（target gene） 目的基因即是我们需要进行研究的基因。在构
（一）什么是核酸杂交？
核酸杂交（nucleic acid hybridization）是指 碱基序列互补但来源不同的单链DNA和DNA、DNA 和RNA、RNA和RNA，根据碱基配对原则，借助氢 键相连而形成的双链杂交分子的过程。
核酸的变性与复性
核酸杂交
（二）核酸探针
1. 什么是核酸探针？ 核酸探针（pห้องสมุดไป่ตู้obe）是指为了检测核酸样品中
From the following article:Protein analysis on a proteomic scale, Eric Phizicky, et al.,Nature 422, 208-215(13 March 2003)
（六）核酸杂交技术的应用
1. 在个体识别中的应用
（六）核酸杂交技术的应用
Western Blot
（四）其他杂交技术
3. 原位杂交（in-situ hybridization） 在组织或细胞水平，使用标记探针与细胞内
DNA或RNA杂交的方法。
原位杂交
人类端粒DNA荧光原位杂交相片
（五）生物芯片
生物芯片（biochip）是将核酸、多肽、蛋白 质分子、组织切片和细胞等制成探针，以预先设计 的方式有序地、高密度地排列在玻片或硅片等载体 上，构成二维分子阵列，然后与待测生物样品靶分 子杂交，通过检测杂交信号实现快速、高效、高通 量样品检测。
非同位素标记核酸探针检测原理
（二）核酸探针
3. 核酸探针标记的常用方法 放射性同位素标记法 如3H、32P、35S、125I等 非放射性标记法
半抗原：生物素、地高辛 荧光素：异硫氰酸荧光素和罗丹明 配体：生物素 光密度或电子密度标记物： 金、银
（三）DNA杂交技术
DNA杂交技术是一种以DNA的特异序列（探针） 检测目标DNA样品中是否存在能与探针碱基配对的 核酸杂交技术。
建重组体时，目的基因又称为插入基因或靶基因。 对于原核生物或病毒，其基因组较小，可以直
接从细胞中提取目的基因。 但对于人类基因组，由于有23对染色体组成，
直接从染色体中提取基因的效率极低，故往往是首 先采用适当的方法使目的基因扩增后才进行目的基 因的提取。
（二）聚合酶链反应
聚合酶链反应技术的发明者Dr Kary Banks Mullis，获1993年化学诺贝尔奖。
2. 探针的制备
3. 待测样品核酸序列的检测 ① 杂交——待测样品与探针的复性 ② 洗膜——除去多余未杂交探针 ③ 检测——依据探针特点检测探针信号
杂
组织或细胞
交 基因组DNA
样 限制性内切酶降解
品 及电泳分离、变性
的 转移到硝酸纤维膜
制
或尼龙膜
备
预杂交
含已知的重组
标
质粒菌落
记
提取质粒DNA
探
限制性内切酶降解 及电泳分离