大肠杆菌的鉴定方法
单胞菌、大肠杆菌、乳酸杆菌及梭状芽孢杆菌的鉴别方法
单胞菌、大肠杆菌、乳酸杆菌及梭状芽孢杆菌的鉴别方法单胞菌、大肠杆菌、乳酸杆菌和梭状芽孢杆菌都是常见的微生物，但它们在形态、生理和生化特性上有明显的差异。
以下是一些常用的鉴别方法：一、形态学特征：1.单胞菌：一般呈圆形或卵圆形，直径在1微米左右，无芽孢，无鞭毛。
革兰氏染色呈阳性。
2.大肠杆菌：杆状，两端钝圆，通常周生鞭毛。
革兰氏染色呈阴性。
3.乳酸杆菌：杆状或球状，通常无鞭毛，少数有鞭毛。
革兰氏染色呈阳性。
4.梭状芽孢杆菌：杆状，两端膨大，有鞭毛。
革兰氏染色呈阳性。
二、培养特性：1.单胞菌：需氧或兼性厌氧，可在普通培养基上生长，有些种类可以产生色素。
2.大肠杆菌：需氧或兼性厌氧，在伊红美蓝培养基上形成黑色菌落。
3.乳酸杆菌：厌氧或兼性厌氧，在乳酸培养基上生长良好，可发酵多种糖类产生乳酸。
4.梭状芽孢杆菌：厌氧或兼性厌氧，在缺氧条件下可形成芽孢。
在葡萄糖肉汤培养基中可形成双层溶血环。
三、生化特性：1.单胞菌：通常不发酵糖类，少数种类可发酵葡萄糖。
不产气，过氧化氢酶通常阳性。
2.大肠杆菌：发酵葡萄糖产酸产气，甲基红和V-P试验均呈阳性；乳糖发酵试验通常为阴性（病原性大肠杆菌除外）。
3.乳酸杆菌：发酵葡萄糖产酸产气，甲基红试验阳性，V-P试验阴性。
4.梭状芽孢杆菌：可发酵葡萄糖，产酸产气；过氧化氢酶阳性；有些种类可产生外毒素。
四、抗原和血清学鉴定：通过细菌的抗原检测和血清学鉴定是鉴别细菌种类的最准确的方法。
例如通过抗O抗原和荚膜抗原的检测可以确定链球菌的种类；通过鞭毛抗原的检测可以确定大肠杆菌的血清型等。
综上所述，通过对形态学特征、培养特性、生化特性和抗原血清学鉴定等方法综合应用可以对单胞菌、大肠杆菌、乳酸杆菌及梭状芽孢杆菌进行准确的鉴别。
大肠杆菌分离鉴定及药敏实验方案
鸡致病性大肠杆菌的分离培养及药敏实验实验基本步骤：样品→肝、脾触片革兰氏染色镜检→普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板分离培养→革兰氏染色镜检、生化实验鉴定→普通肉汤培养基增殖培养→药敏实验。
1 病料采集1.1 准备材料：试管、载玻片、手术刀、手术剪、结扎绳、记号笔、冰块、泡沫箱、口罩、手套（该灭菌的都进行高压蒸汽灭菌）、冰箱。
1.2 取材部位：血液、肝脏、脾脏、肠内容物，若有鸡胚感染则去鸡胚及卵黄物。
1.3 操作方法：将病死鸡浸泡在消毒剂溶液中，打开腹腔，无菌采集肝脏、脾脏放于事先准备好的灭菌试管内，将带有肠内容物的肠管两端结扎放于灭菌是试管内。
将有明显病变的脏器入肝、脾进行触片，做好标记。
都贴上标签，标示采集样品，来源地，采集时间，采集人。
将装有病料的试管放在放有冰袋的泡沫箱中，及时返回实验室，置于4℃冰箱待检。
2 菌的分离培养及鉴定2.1 准备材料：光学显微镜、革兰氏染色液、载玻片、手术刀、接种环、平皿、恒温箱、高压锅、摇床、酒精灯、葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖等微量生化发酵管，蛋白胨水（蛋白胨(或胰蛋白胨)20g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL pH7.4），葡萄糖蛋白胨水溶液（每100 mL蛋白胨水中加入葡萄糖1g）、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、VP指示剂、超净台。
培养基：A. 普通琼脂培养基（牛肉粉 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、琼脂 20g、蒸馏水1000ml，ph7.3±0.1），B. 麦康凯琼脂培养基（蛋白胨20g、牛胆盐5g、氯化钠5g、琼脂15g，乳糖10g、结晶紫0.001g、中性红0.025g，ph7.2±0.2。
），C. 营养肉汤培养基（牛肉粉 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、蒸馏水1000ml，ph7.2±0.2）。
2．2 样品触片镜检涂片镜检：取触片,进行革兰氏染色镜检。
2.2.1在玻片上滴加草酸铵结晶紫染色液，作用1min，水洗。
2.2.2 加革兰氏碘液于玻片上媒染，作用1min，水洗。
大肠杆菌生化实验报告
一、实验目的1. 了解大肠杆菌的生化特性，掌握大肠杆菌的鉴定方法。
2. 掌握微生物生化实验的基本操作技术，提高实验技能。
3. 通过实验，加深对微生物生化反应原理的理解。
二、实验原理大肠杆菌是一种革兰氏阴性细菌，属于肠杆菌科。
在微生物学中，生化实验是鉴定细菌的重要手段之一。
通过观察细菌对特定底物的代谢能力，可以判断细菌的种类和特性。
本实验主要采用糖发酵实验、吲哚试验、甲基红试验等方法对大肠杆菌进行鉴定。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌菌种、葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、吲哚试剂、甲基红试剂、卢戈氏碘液、乙醚、蒸馏水等。
2. 实验仪器：酒精灯、接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、德汉氏小管、电子天平、纱布、脱脂棉、灭菌锅、PH计或PH试纸、电炉、石棉网、铁架台、100ml量筒、橡皮手套、超净台等。
四、实验步骤1. 糖发酵实验（1）将大肠杆菌接种于葡萄糖发酵培养基中，37℃培养24小时。
（2）观察培养基中是否产生气泡，若有气泡产生，则说明大肠杆菌能够利用葡萄糖。
2. 吲哚试验（1）将大肠杆菌接种于蛋白胨水培养基中，37℃培养24小时。
（2）取少量培养液加入吲哚试剂，观察是否产生红色沉淀。
3. 甲基红试验（1）将大肠杆菌接种于乳糖发酵培养基中，37℃培养24小时。
（2）加入甲基红试剂，观察培养基颜色变化。
五、实验结果与分析1. 糖发酵实验：大肠杆菌在葡萄糖发酵培养基中产生气泡，说明其能够利用葡萄糖。
2. 吲哚试验：大肠杆菌在蛋白胨水培养基中产生红色沉淀，说明其具有吲哚酶活性。
3. 甲基红试验：大肠杆菌在乳糖发酵培养基中不产生红色沉淀，说明其不能发酵乳糖。
根据实验结果，可以判断该菌株为大肠杆菌。
六、实验总结通过本次实验，我们掌握了微生物生化实验的基本操作技术，加深了对微生物生化反应原理的理解。
在实验过程中，我们学会了如何观察细菌对特定底物的代谢能力，从而对大肠杆菌进行鉴定。
肠杆菌科鉴定
菌1
样品1、样品2的黑色菌落纯化培养后均呈现“A/A” （上下层呈现黄色），可初步确定为大肠杆菌。 样品1中的接种三支红色菌落的双糖铁培养基中出现黑 色物质，初步确定为乙型副伤寒杆菌。样品2中的接种的 三支红色呈现“K/A”，推断是痢疾或伤寒杆菌。
生化反应鉴定
推断：根据样品 1、样品2的黑色 菌落的糖发酵试 验和动力学反应 情况，进一步确 定了黑色菌落属 大肠杆菌 根据糖发酵试验 和动力学反应， 也进一步确定样 品1的红1、2、3 都是乙型副伤寒 杆菌，样品2红1 红2是伤寒杆菌或 痢疾杆菌。
注：R1-1表示菌1红色1管
药敏试验：
根据药敏试验现象可见，痢疾杆菌和伤寒杆菌对一些 药物具有耐受性，而一些药物也能抑制其生长。
• 第五小组的鉴定实验结论：
• 从上的一系列实验鉴定出样品1、样品2的 黑色菌落是大肠杆菌，样品1的单一红色菌 落均为乙型副伤寒杆菌，样品2的红1和红2 为痢疾杆菌。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
+
+ -
-
-
生化反应鉴定（观察现象）：
血清学鉴定
观察结果： 在血清学鉴定中可见样品1的R1-1、 R1-2、R1-3四张滴加了伤寒杆菌 血清的玻片出现凝集现象，同时我 们发现在一张滴加了痢疾血清的玻 片也出现了R2-2，R2-1的凝集现 象，从而否定了上面生化反应鉴定 的R2-1、R2-2可能为伤寒杆菌的 推断，所以R2-1、R2-2为痢疾杆 菌。
肠杆菌科细菌鉴定
临医13（2）班第八小组
组员：张艺 1304505212 古仲嘉 1304505214
植瑞恩
1304505215
游裕婷
1304505216
EMB
1、初步推测平板上的黑色 （带金属感）菌落为大肠杆 菌，红色的单个菌落为痢疾 或伤寒杆菌
大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案
实验原理：1、大肠杆菌的性质:大肠杆菌是G无芽抱直杆菌，在大多数培养基上表现出不同的特性。
在麦康凯琼脂平板上是凸起光滑湿润的粉红菌落，革兰氏染色镜检为红色短杆菌。
三糖铁琼脂上的反应为斜面和底部都变黄，产气，不产生硫化氢。
生化特性为发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖，不发酵蔗糖。
MR试验，口引噪试验为阳性，VP试验为阴性，不产生H2S,不能利用xx酸盐。
半固体中沿穿刺线向四周生长。
2、沙门氏杆菌的性质：-沙门氏杆菌是G直杆菌。
在麦康凯平板上为细小半透明、圆形、无色小菌落，三糖铁斜面下层变黄色，上层仍为红色，穿刺处为变黑产生H2S。
能发酵葡萄糖产酸产气，能利用枸椽酸盐，不发酵乳糖不利用蔗糖肌醇，MR阳性，VP阴性，不产呵噪，不分解尿素。
实验材料：含有大肠杆菌和沙门氏菌的猪肝脏、培养基（琼脂平板培养基、三糖铁琼脂斜面培养基、麦康凯琼脂、生化培养基、SQ、器械（剪刀、记号笔、接种环、酒精灯、显微镜、试管、玻片、培养皿）、药品（消毒酒精、结晶紫、碘液、酸酒精、品红、松柏油）实验内容及操作程序：一、培养基制备：制备普通琼脂培养基、麦康凯平板、SC增菌培养基、生化培养基，制备方法见附1.二、标本制备：(1) 取新鲜猪肝脏一小块，火焰表面消毒。
(2) 用浸过消毒液的剪刀剪开一个小口于消过毒的猪肝脏。
(3) 用接种环在剪开的肝脏小口沾取肝脏液，分别画线于麦康凯培养基和接种于SC中，37 C恒温培养24小时。
三、细菌分离培养：(1) 取出培养了24小时的麦康凯平板。
挑选麦康凯平板上的凸起光滑湿润的粉红菌落染色镜检，看是否为红色短杆菌，若是，即疑似为大肠杆菌，则取其接种于另一麦康凯平板，37 C恒温培养24小时。
(2) 取出培养了24小时的SC增菌培养基，染色镜检，看是否有疑似沙门氏菌，有则取其中细菌画线接种于麦康凯平板上，37 C恒温培养24小时。
四、细菌的鉴定纯化：(1) 检查疑似大肠杆菌的培养基是否长满了粉红色菌落，染色镜检。
大肠杆菌的鉴定方法
大肠杆菌的鉴定方法
大肠杆菌的鉴定方法主要有以下几种：
1.形态学鉴定：通过显微镜观察大肠杆菌的形态、大小、颜色等，来确定其种属。
2. 生理生化鉴定：通过大肠杆菌的代谢特征，如糖代谢、氧化酶、蛋白质降解、生长要求等来进行鉴定，常见用于此类鉴定的试剂有
Triple Sugar Iron Agar（三糖铁素琼脂）、Lysine Iron Agar（赖氨酸铁素琼脂），并且在不同的温度下观察细菌的生长状况，进行鉴定。
3.分子生物学鉴定：通过基因测序、PCR等技术，将大肠杆菌的DNA 进行鉴定，如16SrRNA测序，单核苷酸多态性（SNP）分析等。
4.免疫学鉴定：通过免疫学反应进行鉴定，如ELISA、免疫电泳等。
大肠杆菌的分离鉴定
斜面和深层均为红色
斜面为红色；深层为黄色； 若产生H2S，为黑色
分离鉴定---麦康凯培养基
原理：在培养基中含有胆盐，可抑制大部分革兰氏阳 性菌的生长，培养基含乳糖，大肠杆菌能分离乳糖， 使pH下降（中性指示剂5.5--7.5，红--黄）形成红色 菌落，而沙门氏菌和志贺氏菌，不能分解乳糖，菌落 小且为无色
点
击
此 验大
处 及肠
添 生杆
加 化菌
副 实的
标 验分
题
离
鉴
定
、
药
敏
实
202X
目的要求
熟悉鉴别培养基的原理 了解大肠杆菌的主要生理生化特性
一、鉴别培养
菌种 培养基类别
麦康凯培养基
大肠杆菌
红色菌落
沙门氏杆菌
无色或浅黄色菌落
SS琼脂培养基
红色菌落
浅黄色菌落
伊红美兰琼脂培养基
三塘铁培养基
紫红色或紫黑色并带有金 粉红色菌落 属光泽菌落
结果判定
鲜桃红色或微红色， 菌落中心呈深桃红色
圆形，扁平，边缘整 齐，表面光滑，湿润
二、药敏试验
方法：取一菌种，用灭菌的 接种环致密划线于琼脂表面 （可重复来回划线），用无 菌镊子，将各种抗菌药物圆 纸片，分别贴于培养基表面。 各片距离相等，370C，24h后， 观察结果。
药敏结果判定
抑菌直径（mm） 敏 感 性
>20
极敏感
15-20
高敏感
10-14
中敏感
<ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ0
低敏感
0
不敏感
三、生化实验
1糖发酵试验
• 原理：各种细菌具有不同的酶，有的细菌能分解某些 糖类而产酸产气，有的细菌虽能分解某种糖类，但只 产酸不产气，有的细菌则不能分解。从而鉴别细菌。
大肠杆菌表达方法
大肠杆菌表达方法一．表达鉴定1、将鉴定好的质粒转化DE3(BL21),涂卡那板。
1、挑取含重组质粒的菌体单斑3-5个克隆至2ml LB（含kana50μg/ml）中37℃过夜培养，保存甘油菌。
500ul菌加500ul 40%甘油。
2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将100ul菌加入到含5mlLB（含kana50μg/ml）培养基的培养管中，37℃震荡培养至OD600 ≌0.6-0.8（大约需3hr）。
3、取1ml液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM作为实验组，两组继续37℃震荡培养5hr。
4、取菌体，离心12000g×2min收获沉淀，加100ul Bugbuster protein extraction reagent 重悬后在振荡器上振荡20min。
5、4度12000rpm 离心20min，弃上清，沉淀加100ul 1×SDS-Loading buffer，电泳鉴定。
二．小规模蛋白表达、纯化、复性1、取鉴定好的甘油菌10ul接种至2ml LB（含kana50μg/ml）中37℃过夜培养2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将2ml菌加入到含200ml LB（含kana50μg/ml）培养基的培养管中，37℃震荡培养至OD600 ≌0.6-0.8（大约需3hr）。
3、取1ml液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM作为实验组，两组继续37℃震荡培养5hr。
4、取菌体，离心12000g×2min收获沉淀，加5ml Bugbuster protein extraction reagent 重悬后在振荡器上振荡20min。
5、4度12000rpm 离心20min，弃上清，沉淀加10ml 包涵体洗涤液(10×：200 mM Tris-HCl, pH7.5, 100 mM EDTA, 10% Triton X-100)，涡旋1min 充分重悬，12000rpm 离心15min，弃上清。
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大肠杆菌的鉴定方法
大肠杆菌（Escherichiacoli）是一种常见的肠道细菌，广泛存
在于自然环境中，同时也是人和动物肠道中的重要微生物。
尽管大肠杆菌在人体和动物肠道中具有重要的生理功能，但在食品和饮用水中的污染却会给人们的健康带来威胁。
因此，准确地鉴定大肠杆菌的方法对于食品和饮用水的安全至关重要。
一、鉴定大肠杆菌的生理特性
大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，可以通过其生理特性进行鉴定。
大肠杆菌是一种好氧菌，需要氧气才能生长，同时也可以进行厌氧呼吸。
大肠杆菌在温度为37℃时生长最快，此时生长周期为20分钟左右。
大肠杆菌可以利用葡萄糖和其他简单糖类作为碳源，同时也能够分解蛋白质和脂肪酸等有机物。
此外，大肠杆菌可以产生酸和气体，这是鉴定大肠杆菌的重要特征之一。
二、鉴定大肠杆菌的培养基
鉴定大肠杆菌的第一步是选择合适的培养基。
常用的培养基有MacConkey培养基、EC培养基、EMB培养基等。
MacConkey培养基是
一种选择性培养基，其中含有普通细菌无法利用的普通糖类和有机酸，同时还含有一种选择性抑制剂，可以抑制大多数革兰氏阳性菌和一些革兰氏阴性菌的生长，而大肠杆菌则可以在此培养基上生长并产生红色颜色。
EC培养基和EMB培养基也是常用的选择性培养基，可以选
择性地培养大肠杆菌。
三、鉴定大肠杆菌的生化反应
在培养出可疑的菌落后，可以进行一系列的生化反应来确认大肠杆菌的存在。
常用的生化反应包括半乳糖发酵试验、气体产生试验、尿素水解试验、亚硝酸盐还原试验等。
半乳糖发酵试验是通过观察菌落的气泡产生来判断大肠杆菌是否存在。
气体产生试验则是通过观察菌落周围的气体产生情况来判断大肠杆菌是否存在。
尿素水解试验则是通过观察菌落周围是否有碱性产生来判断大肠杆菌是否存在。
亚硝酸盐还原试验则是通过观察菌落周围是否有红色颜色的产生来判断
大肠杆菌是否存在。
四、鉴定大肠杆菌的分子生物学方法
随着分子生物学技术的发展，越来越多的分子生物学方法被应用于鉴定大肠杆菌。
其中最常用的方法是PCR（聚合酶链式反应）技术。
PCR技术可以扩增大肠杆菌的特异性基因，如rpoB、16S rRNA等，
通过检测PCR产物的存在来确认大肠杆菌的存在。
另外，还可以通过基因测序等分子生物学方法对大肠杆菌进行鉴定。
总之，鉴定大肠杆菌的方法包括生理特性、培养基、生化反应和分子生物学方法等多种方法。
这些方法各有优缺点，可以根据不同的需求选择合适的方法进行鉴定。
在食品和饮用水中，鉴定大肠杆菌的准确性非常重要，只有通过准确的鉴定方法才能保障人们的健康安全。