第4节显色反应及条件选择
吸光度absorbance
吸光度吸光度是物理学和化学的一个名词。
中文名吸光度外文名absorbance 影响因素溶剂、浓度、温度等等数学表达式A=abc1定义吸光度（absorbance）：是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的以10为底的对数（即lg(I0/I1)），其中I0为入射光强，I1为透射光强，影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等。
2原理相关吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关，只要光的波长被固定下来，同一种物质，吸光系数就不变。
当一束光通过一个吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。
吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。
吸光度用A表示。
A=abc，其中a吸光系数，单位L/(g·cm),b为光在样本中经过的距离（通常为比色皿的厚度），单位cm ， c为溶液浓度，单位g/LA=Ecl影响吸光度的因数是b和c。
a是与溶质有关的一个常量。
此外，温度通过影响c，而影响A。
符号A，表示物质对光的吸收程度。
97801 式中I0是通过均匀的液体介质的一束平行光的入射光的强度；It是透射光强度；T是透射比。
A值越大，表示物质对光的吸收越大。
根据比尔定律，吸光度与吸光物质的量浓度c成正比，以A对c作图，可得到光度分析的校准曲线。
在多组分体系中，如果各组分的吸光质点彼此不发生作用，那么吸光度便等于各组分吸光度之和，这一规律称吸光度的加和性。
据此可以进行多组分同时测定及某些化学反应平衡常数的测定。
在吸光度测定中，为抵消吸收池对入射光的吸收、反射以及溶剂、试剂等对入射光的吸收、散射等因素，可选用双光束分光光度计，并选光学性质相同、厚度相等的吸收池分别盛待测溶液和参比溶液。
在同一波长下,吸光度与溶液浓度有何关系A=aCL,A：吸光度a：吸收系数C：浓度L：光在介质中通过的距离,也就是比色皿的宽度听过公式可以得知,L不会改变,a是待测物质的固有性质,不会随外界环境改变而改变,故A和C成正比例关系,已知吸光度怎样计算溶液浓度用朗伯比尔定律：吸光度A＝εcd,其中ε为吸光系数,c为浓度,d为光程第一节概述分光光度法是基于物质分子对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。
执业中药师基础精讲班：专业知识一06-第3章-第4节-醌类化合物
中药学专业知识（一）国家执业药师资格考试主讲老师：姜雅基础精讲班第四节醌类化合物1A+1B+1C=3醌类化合物的分类分类和基本结构★★★醌类化合物的理化性质醌类化合物的性状、升华性、溶解性和酸碱性★★★★醌类化合物的显色反应及其应用★★含醌类化合物的常用中药大黄、虎杖、何首乌、芦荟、决明子、丹参和紫草中醌类化合物的化学结构类型及质量控制成分★★★★★第四节醌类化合物1A+1B+1C=3特点：醌类化合物基本上具有α β一α’β’ 不饱和酮的结构OαβOO第四节醌类化合物1A+1B+1C=3一、结构与分类苯醌、萘醌、菲醌、蒽醌等四类记忆方法：一苯二萘三是蒽，苯上长角是苯醌，蒽上长角是蒽醌OOOOOOR 2OHOH O OR 1OOO12345678910O萘醌萘醌苯醌菲醌第四节醌类化合物1A+1B+1C=3（一）苯醌类对苯醌，天然存在多空间位阻OOOO对苯醌邻苯醌第四节醌类化合物1A+1B+1C=3代表化合物：中药软紫草：arnebinol 、rnebinone 。
对前列腺素PGE2生物合成有抑制作用的活性物质OHOOOH 3CO H 3COarnebinolarnebinone第四节醌类化合物1A+1B+1C=3（二）萘醌类可以有α (1，4)，β (1，2)及amphi (2，6)三种类型。
自然分到的几乎均为α－萘醌类OOOOOOα(1,4)β(1,2)amphi(2,6)第四节醌类化合物1A+1B+1C=3代表化合物：中药紫草及软紫草中分得的一系列紫草素及异紫草素衍生物，具有止血、抗炎、抗菌、抗病毒及抗癌作用OH OH OOR紫紫紫 R=紫紫紫紫 R=OH OH第四节醌类化合物1A+1B+1C=3（三）菲醌类：邻醌及对醌OOO12345678910O邻菲醌对菲醌第四节醌类化合物1A+1B+1C=3邻醌类：丹参醌Ⅰ、丹参醌ⅡA、丹参醌ⅡB、隐丹参醌对醌类：丹参新醌甲、丹参新醌乙、丹参新醌丙OOR 2R 1OOHOOR紫紫紫ⅡA R 1=CH 3R 2=H 紫紫紫ⅡB R 1=CH 2OHR 2=H紫紫紫紫紫ⅡA R 1=CH 3R 2=OH紫紫紫紫紫R 1=COOCH 3R 2=H紫紫紫紫紫R 1=CH(CH 3)CH 2OH紫紫紫紫紫R 1=CH(CH 3)2紫紫紫紫紫R 1=CH3第四节醌类化合物1A+1B+1C=3（四）蒽醌类包括蒽酮及其不同还原程度的产物按母核可分为单蒽核及双蒽核R 2OH OH O O R 1OH OH O OCH 3OH OHO OH 3C第四节醌类化合物1A+1B+1C=3按氧化程度又可分为氧化蒽酚、蒽酮、蒽酚及蒽酮的二聚物。
分光光度计与分光光度法
2.2.1 分光光度计的 光谱范围
包括波长范围为400~760 nm的可见光区和波长范围 为200～400 nm的紫外光区。不同的光源都有其特有的 发射光谱，因此可采用不同的发光体作为仪器的光源。
钨灯的发射光谱：钨灯光源所发出的400～760nm 波长的光谱，光连续色谱；该色谱可作为可 见光分光光度计的光源。
3. 以7200可见光分光度计为例，讲解可见光分光度 计的正确使用方法
4. 以UV-754型紫外-可见分光光度计为例，讲解紫 外光光度计的正确使用方法
1. 分光光度法定义 与应用
1.1 定义: 分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴 别物质或测定其含量的分析检测技术。
1.2 特点: 灵敏、精确、快速和简便，在复杂组分系统 中，不需要分离，即能检测出其中所含的极少量物质。
氢灯的发射光谱：氢灯能发出185～400 nm波长的 光谱，可作为紫外光光度计的光源。
谱（1）
如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，此 时在屏上所显示的光谱已不再是光源的光谱，它出现 了几条暗线，即光源发射光谱中某些波长的光因溶液 吸收而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的 吸收光谱。
不同物质的吸收光谱是不同的。因此根据吸收光 谱，可以鉴别溶液中所含的物质。
4、有色物稳定性高 其它离子干扰才小。如三
磺基水杨 酸铁的Kf =1042 , F- 、H3PO4 对它无干 扰。
5、显色过程易于控制 而且有色化合物与显
色剂之间的颜色差别应尽可能大。
| m MaRx m Rax | 60nm
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二、 显色反应条件的选择
1、显色剂用量 ，适当过量。
2、溶液酸度 既要防止被测离子生成沉淀，又需
紫外可见分光光度法
●同一物质不同浓度，其吸收曲线形状相似,λmax相同。（定量） ●不同物质相同浓度，其吸收曲线形状,λmax不同。（定性）
吸收光谱 特征值：
λmax λmin λsh
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19 19
五、偏离光的吸收定律原因
朗伯-比尔定律：A=k C L
1 T
I0 = -lgT = lg It
A=-lgT , T=10-A
③T与A关系： A∝1/T，T=0，A=∞ ，T=100%，A=0 例2：P157
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15 15
二、光的吸收定律
朗伯(Lambert)和比尔(Beer)分别于1760年和1852年研究吸光度 Ａ与溶液厚度Ｌ和其浓度Ｃ的定量关系：
尤其浓度过高(>0.01mol/L)会使C与A关系偏离定律： ①粒子相互作用加强，吸光能力改变。 ②溶液对光的折射率显著改变。
（二）光学因 素1．非单色光的影响：入射光为单色光是应用该定律的重要前提：
2．杂散光的影响：仪器本身缺陷；光学元件污染造成。
3．反射和散色光的影响：散射和反射使T↓，A↑，吸收光谱变形。 通常可用空白对比校正消除。
长
(0.1cm~1000m)
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（二）原子光谱与分子光谱
1、原子光谱：气态原子或离子外层电子在不同能级间跃迁而产生 的光谱。包括：原子吸收、原子放射、原子荧光光谱等。
原子吸收辐射能条件：
E
E2
E1
h
h
c
h
c E
分析化学吸光光度法二
故T e 1 0.368, 即吸光度A 0.434时， 浓度测量的相对误差最小。
（二）测量条件的选择
选择适当的测量条件，是获得准确测定结 果的重要途径。择适合的测量条件，可从下列 几个方面考虑。 1.测量波长的选择 由于有色物质对光有选择性吸收，为了使 测定结果有较高的灵镀度和准确度，必须选择 溶液最大吸收波长的入射光。如果有干扰时， 则选用灵敏度较低但能避免干扰的入射光，就 能获得满意的酸度对被测物质存在状态的影响 大部分高价金属离子都容易水解，当溶液的酸度 降低时，最终将导致沉淀的生成。显然，金属离子的 水解，对于显色反应的进行是不利的，故溶液的酸度 不能太低。
(2) 酸度对显色剂浓度和颜色的影响 光度分析中所用的大部分显色剂都是有 机弱酸。 M + HR＝MR + H+ 从反应式可以看出，溶液的酸度影响着 显色剂的离解,并影响着显色反应的完全程 度。
3.时间和温度 显色反应的速度有快有慢。实验方法是配制一份显色溶 液，从加入显色剂计算时间、每隔几分钟测定一次吸光度， 绘制A-t曲线，根据曲线来确定适宜的时间。 不同的显色反应需要不同的温度，一般显色反应可在室温 下完成。但是有些显色反应需要加热至一定的温度才能完成； 也有些有色络合物在较高温度下容易分解。因此，应根据不 同的情况选择适当的温度进行显色。温度对光的吸收及颜色 的深浅也有一定的影响，故标样和试样的显色温度应保持一 样。合适显色温度也必须通过实验确定 ,做A-C曲线即可求出。
(3)对络合物组成和颜色的影响 对于某些逐级形成络合物的显色反应、在不 同的酸度时，生成不同络合比的络合物。例如铁 与水杨酸的络合反应，当 pH＜4 [Fe3+(C7H4O3)2-]+ 紫色 4＜pH＜9 [Fe3+(C7H4O3)22-]- 红色 pH＞9 [Fe3+(C7H4O3)32-]3- 黄色 在这种情况下，必须控制合适的酸度，才可 获得好的分析结果。 合适酸度也必须通过实验确定,做A-pH曲线即可 求出
天然药物化学 第三章 生物碱4-5节
CHCl3层 （中强碱）
CHCl3层 （弱碱）
（二）生物碱单体的分离
1、利用生物碱碱性差异进行分离 总碱
酸水
酸水液（盐）
NaHCO3碱化， 三氯甲烷萃取
水层（莨菪碱）
三氯甲烷层 （东莨菪碱）
练习
• 1．在酸水溶液中可直接被氯仿萃取出来的生物 碱是
A．强碱 B．中强碱
C．弱碱 D．酚性碱 E．季铵碱
• 2．在生物碱酸水提取液中，加碱调pH由低到高， 每调一次用氯仿萃取一次，首先得到
A．强碱性生物碱 B．弱碱性生物碱 C．季铵碱 D．中等碱性生物碱 E．水溶性生物碱
2、利用游离生物碱在有机溶剂中的溶 解度不同进行分离
氧化苦参碱和苦参碱混合物
少量CHCl3溶解 CHCl3 液
加入10倍量的乙醚
沉淀↓ （氧化苦参碱）
三、亲脂性有机溶剂提取法
原理：利用游离生物碱易溶于亲脂 性有机溶剂的性质进行提取。
提取前先用碱水（石灰乳或氨水） 湿润，使生物碱游离。再用氯仿、 苯等亲脂性有机溶剂提取。
方法 ：回流或连续回流法。
三、亲脂性有机溶剂提取法
药材（须碱化）
亲脂性有机溶剂提取 （三氯甲烷 /苯）冷浸/ 回流
有机溶剂提取液（游离）
方法：浸渍、渗漉和回流法 继续纯化采用酸溶碱沉法。
二、乙醇溶剂提取法
药材
60%~95%乙醇渗漉/ 浸渍 /回流 乙醇提取液（盐、游离、脂溶性杂质）
减压回收乙醇
浓缩液（盐、游离、脂溶性杂质）
加稀酸放置，滤过
酸水溶液（盐）
碱化
沉淀（脂溶性杂质）
总生物碱（游离）↓（可
碱水液（水溶性生物
过滤Байду номын сангаас去也可用氯仿萃取 ） 碱或杂质）
显色反应及显色条件的选择
第三节显色反应及显色条件的选择将待测组分变成有色络合物的反应－显色反应。
与待测组分形成有色络合物的试剂－显色剂一、显色反应的选择：（ 1 ）灵敏度高：ε大是显色反应灵敏度的重要标志。
图6-5 吸光度与显色剂浓度的关系曲线4 ．显色温度：升温加快显色，但温度偏高，有色物质分解，由实验来确定。
总之：通过实验，分别作出A ～[R]，pH ，t ，T 曲线，找出合适的[R] ，pH，t，T ，即找出平坦区。
5 ．副反应的影响6 ．溶剂的影响7 ．共存离子的影响。
消除共存离子干扰的方法：（(5) 选用适当的分离方法。
三、显色剂(R)1 ．无机显色剂：无机显色剂在光度分析中应用不多，这主要是因为生成的络合物不够稳定，其灵敏度与选择度也不够高，目前，有价值的仅有硫氰酸盐、钼酸铵、H2O2等。
2 ．有机显色剂：R大多数有机显色剂R 与金属离子生成稳定的螯合物，显色反应的选择性和灵敏度都较高。
在吸光光度法中应用广泛。
①生色团：可吸收光子而产生跃迁的原子基因。
它一般是分子中含有一个或多个某些不饱和基因( 共轭体系) 的有机化合物。
②助色团：含有孤对电子的基因，显然本身没有颜色，当它与某生色团相联时，( 与其不饱和键相互作用) ，能使该生色团的吸收波长位置向长波方向移动( 即红移) ，且光谱强度有所增大。
如：胺基：—NH2 R—NH—R2N—羟基：—OH—OR—SH—CL 等。
③常用的有机显色剂：有机显色剂的类型、品种都非常多。
A ：偶氮类显色剂：含有偶氮基—N=N —凡含有偶氮结构的有机化合物，都是带色的。
偶氮类显色剂：性质稳定，显色反应灵敏度高，选择性好，对比度较大。
如：偶氮胂Ⅲ：③选择性高( 比二元体系)一种配体常可与多种金属离子产生类似的络合反应，而当形成三元络合物时，就减少了形成类似络合物的可能性。
如：铌、钽都可与邻苯三酚生成二元络合物，但在草酸介质中只有钽－邻苯三酚－草酸。
一、显色反应和显色剂1、显色反应在无机分析中，很少利用金属水合离子本身的颜色进行光度分析，因为它们的吸光系数值都很小。
《分光光度分析》第四章 分光光度法的灵敏度和选择性
当 使 用 的 滤 光 片 波 带 窄 ( 即 单 色 光 纯 度 高 ) 如 2~’2 进行测定，则物质的吸光度在A2~A之间波动， 在2~小范围较 A达最高，达最大。
高处波动，灵敏度增大(即 平均水平增高)，当在 max 处测定时， 因此选用波带宽度愈窄的单色器，灵敏度愈高
分析方法的灵敏度(包括光度反应灵敏度条件外，还取
决于样品的制备条件，干扰的影响等)。
其中最常用的是摩尔吸光系数，此方法是衡量灵
敏度的重要指标。
二. 提高分光光度法灵敏度的途径
1. 寻求高灵敏度试剂
目前大多数光度法分析法灵敏度在104数量级，因
此，还有大量的工作需要我们取寻求高灵敏度的试剂，
以提高光度分析法的灵敏度，以其达到较高的灵敏度。
b). 取代基影响有机试剂的酸性 如：C2H5OH是中性，
OH
是弱酸。
试剂的酸碱性会影响其与金属离子的反应性能。 c). 取代基可影响有机化合物的颜色 d). 取代基的空间位阻效应可提高反应的选择性 由于取代基的存在，有时会强烈干扰其他原子间的结合， 使得试剂的选择性提高了，这就是空间位阻影响。
2. 利用多元配合物选择性反应
值在(2～6)×104属于中等灵敏的分光光度法， 值在(6～10)×104属于高灵敏的分光光度法， 值大于105属于超高灵敏的分光光度法，
现在已有少数达到约106。
(2) 吸光系数 a
物理意义：相当于浓度为1g/L的待测物质溶液，在
1cm的吸收池中测得的吸光度。
A＝abc
A a bc '
5.1×104， 其中，Ag phen BPR＝2 4 1。
(2) 加入表面活性剂 在金属离子与显色剂的二元体系中加入一种表面 活性剂以形成三元络合物(三组分)提高光度分析法的 灵敏度，此法目前研究报道较多。
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3.选择合适的参比溶液
• 为什么需要使用参比溶液？ 测得的的吸光度真正反映待测溶液吸光强度。 • 参比溶液的选择一般遵循以下原则： ⑴ 若仅待测组分与显色剂反应产物在测定波长处有吸收， 其它所加试剂均无吸收，用纯溶剂（水)作参比溶液； ⑵ 若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收，而试
液本身无吸收，用“试剂空白”(不加试样溶液)作参比溶液
2.选择适当的显色反应条件
3.分离干扰离子
第4节.测定条件的选择
1.选择适当的入射波长
一般应该选择λ max为入射光波长。 如果λ max处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度 稍低但能避免干扰的入射光波长。
2.控制适宜的吸光度（读数范围）
不同的透光度读数，产生的误差大小不同： －lgT=εbc 微分：－dlgT＝－0.434dlnT = - 0.434T -1 dT =εb dc 两式相除得： dc/c = （ 0.434 / TlgT ）dT 以有限值表示可得： Δc/c =（0.434/TlgT）ΔT 浓度测量值的相对误差（Δc/c）不仅与仪器的透光度误 差ΔT 有关，而且与其透光度读数T 的值也有关。 是否存在最佳读数范围？何值时误差最小？
2.配位显色反应
当金属离子与有机显色剂形成配合物时，通常会发生 电荷转移跃迁，产生很强的紫外—可见吸收光谱。
3.氧化还原显色反应
某些元素的氧化态，如Mn（Ⅶ）、Cr（Ⅵ）在紫外或 可见光区能强烈吸收，可利用氧化还原反应对待测离子进行 显色后测定。 例如：钢中微量锰的测定，Mn2＋不能直接进行光度测定
；
参比溶液的选择一般遵循的原则：
•
⑶ 若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂
等无吸收，则可用“试样空白”(不加显色剂)作参
比溶液；
⑷ 若显色剂、试液中其它组分在测量波长处有
吸收，则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩
蔽后再加显色剂，作为参比溶液。
4.提高光度测定灵敏度和选择性的途径
(1).合成新的高灵敏度有机显色剂 (2).采用分离富集和测定相结合 (3).采用三元(多元)配合物显色体系
最佳读数范围与最佳值
设：ΔT =1%，则可绘出溶液浓度 相对误差Δc/c与其透光度T 的关系曲线 。如图所示： 当：ΔT =1%，T 在20%～65%之
间时，浓度相对误差较小，最佳读数
范围。 用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在T %=20～65% (
吸光度 A =0.70～0.20)。
可求出浓度相对误差最小时的透光度Tmin为： Tmin＝36.8%, Amin＝0.434
2 Mn2＋ ＋5 S2O82-＋8 H2O =2 MnO4＋ + 10 SO42-＋ 16H+
将Mn2＋ 氧化成紫红色的MnO4＋后，在525 nm处进行测 定。
4.显色剂
无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等几种。 有机显色剂：种类繁多 偶氮类显色剂：本身是有色物质，生成配合物后，颜 色发生明显变化；具有性质稳定、显色反应灵敏度高、选 择性好、对比度大等优点，应用最广泛。偶氮胂Ⅲ、PAR等。 三苯甲烷类：铬天青S、二甲酚橙等
二、显色反应条件的选择
1.显色剂用量
吸光度A与显色剂用量CR 的关系会出现如图所示的几种 情况。选择曲线变化平坦处。
2.反应体系的酸度
在相同实验条件下，分别测定不同pH值条件 下显色溶液的吸光度。选择曲线中吸光度较大且 恒定的平坦区所对应的pH范围。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ3.显色时间与温度
实验确定
4.溶剂
一般尽量采用水相测定，
第九章 紫外-可见吸光 光度法
第三节 显色条件的选择 第四节 测量条件的选择
一、显色反应的要求 二、显色反应条件的选择 第4节.测量误差和测量条 件的选择 一、入射光的选择 二、读数范围的选择 三、参比溶液的选择
一、显色反应的要求
1.选择显色反应时，应考虑的因素
灵敏度高、选择性高、生成物稳定、显色剂在测定波 长处无明显吸收，两种有色物最大吸收波长之差：“对比 度”，要求△ > 60nm。
5.共存离子干扰的消除
1.加入掩蔽剂
选择掩蔽剂的原则是：掩蔽剂不与待测组分反应；掩 蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分 的测定。 例：测定Ti4＋，可加入H3PO4掩蔽剂使Fe3+(黄色) 成为Fe(PO４)23-(无色)，消除Fe3+的干扰；又如用铬天菁S 光度法测定Al3+时，加入抗坏血酸作掩蔽剂将Fe3+还原为 Fe2+，消除Fe3+的干扰。
由一个中心金属离子与两种(或两种以上)不同配位体形成的配合
物，称为三元(多元)配合物。
多元配合物显色反应具有很高的灵敏度，一方面是因为多元配合 物比其相应的二元配合物分子截面积更大；另一方面是因为第二或第
三配位体的引入，可能产生配位体之间、配位体与中心金属离子间的
协同作用，使共轭π 电子的流动性和电子跃迁几率增大。 三元配合物主要类型有：三元离子缔合物、三元混配配合物、三 元胶束(增溶)配合物。