杆状病毒介绍
杆状病毒——昆虫细胞表达系统
实验材料：1. 重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT，已构建成功。
2. 昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。
抗His单克隆抗体购自Oncogene公司，CAT-ELISA试剂盒购自Roche。
实验步骤：一、昆虫细胞转染：1． Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。
2．准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：a. 溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。
b. 转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。
c. 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。
3．重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。
4．取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。
加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。
5．移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。
27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。
二、病毒贮液的制备：1. 病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。
即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。
2. 上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。
长期保存分装冻存于-80℃。
3. 病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量：感染所需病毒贮液量(ml)=[MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)]注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。
4. 扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下：a. 转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。
对虾杆状病毒病
组织损伤
03
病毒导致对虾的肝胰腺、鳃丝等组织损伤，影响其正常生理功
能。
对虾品种的敏感性差异
敏感性差异
不同品种的对虾对杆状病毒的敏感性存在差异 。
高风险品种
部分品种的对虾容易感染杆状病毒，如白对虾 、斑节对虾等。
低风险品种
部分品种的对虾对杆状病毒相对不敏感，如草虾、沼泽对虾等。
04
病毒的检测和诊断
病毒的分类和特征
分类
SBV属于杆状病毒科，是虾类的专性病毒。
特征
SBV的主要特征是其杆状形态，长度约为750纳米，直径约为110纳米。该病毒 具有囊膜，内含有一个大的、线性的、dsDNA基因组。
病毒的基因组和蛋白质
基因组
SBV的基因组为dsDNA，大小约为80kb，编码约20个蛋白 质。基因组被分成两个主要部分，即大端（L）和小端（S） ，它们分别编码病毒的复制和包装相关蛋白。
针对对虾杆状病毒病的威胁，提出了多种可持续发展 的策略，包括改变养殖模式、优化养殖环境、疫苗研 发和应用等，以保障对虾养殖业的可持续发展。
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对虾杆状病毒病
汇报人：
目录
• 病毒概述 • 病毒的流行病学 • 病毒的致病性和症状 • 病毒的检测和诊断 • 病毒的预防和控制 • 研究进展和未来趋势
01
病毒概述
病毒的发现和命名
发现
对虾杆状病毒病是在1998年首次发现于中国对虾上，后来在其他对虾种类上也 发现了该病毒的存在。
命名
该病毒被命名为对虾杆状病毒（Shrimp Banded Virus，SBV），属于杆状病 毒科。
注意药物的使用方法和剂量，确保药 物的安全和有效性，避免药物残留和 对对虾的影响。
杆状病毒介绍
杆状病毒介绍杆状病毒关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型多角体病毒，颗粒体病毒，质型多角体病毒杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 Kb之间。
目前杆状病毒作为高效、安全的无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。
杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。
DNA 复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。
其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。
昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
杆状病毒基因转导的技术和应用
杆状病毒基因转导的技术和应用随着科学技术的不断进步，人类对基因的认识和应用也逐渐深入。
在基因工程领域，杆状病毒基因转导技术是一种十分有前途的技术。
本文将介绍杆状病毒的基本情况、杆状病毒基因转导技术的原理和应用。
一、杆状病毒的基本情况杆状病毒是一种单链RNA病毒，是植物病毒中最重要的一种。
它可以侵入植物细胞内部，通过自身的基因组合成一种非常具有活力的蛋白质，然后传递给其他细胞。
由于其生物学特性，许多疾病和社会问题一直没有得到很好的解决。
因此，了解杆状病毒的基本情况是基因转导技术研究的重要前提。
二、杆状病毒基因转导技术的原理杆状病毒基因转导技术是将外源DNA引入植物细胞中的一种方法。
一般来说，它是通过将带有目的基因的载体构建成病毒载体，然后通过感染植物细胞来实现目标基因的转录和翻译的。
在这个过程中，载体的构建是很关键的。
一般来说，载体需要包括一个病毒颗粒功能区、一个基因组合成的目标DNA功能区和一个表达基因的启动子区。
通过这三个功能区的合成，我们就可以得到病毒颗粒，进而实现基因转导。
三、杆状病毒基因转导技术的应用杆状病毒基因转导技术的应用非常广泛，在基因工程、生物学研究和生产过程中都有非常重要的作用。
以下是几个常见的应用领域：1. 植物基因研究杆状病毒基因转导技术可以用于植物基因的研究和功能分析。
通过这种方法，可以快速有效地将外源基因引入植物细胞，研究它们的表达和功能等方面的问题。
这能够提高我们的基因研究的精度和效率，也可以为我们了解植物的种类和特性提供有用的信息。
2. 植物基因工程杆状病毒基因转导技术还可以用于植物的基因工程领域。
通过这种方法，我们可以有效地转化作物和一些经济植物，从而对其进行基因编辑和优化。
这有助于我们提高作物产量、提高经济效益、改善植物的品质，为人们生活和经济发展做出贡献。
3. 疫苗生产杆状病毒基因转导技术也可以用于疫苗的生产。
一些病原体所带有的代谢基因、毒力基因等，可以被杆状病毒转导载体所调控，然后被表达出来。
杆状病毒资料
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杆状病毒：基本概念与深入研究
01
杆状病毒的基本概念及其特征
杆状病毒的分类与分布
杆状病毒属于病毒科
• 包含多个属，如昆虫杆状病毒属、哺乳动物杆状病毒属等 • 病毒分布广泛，包括昆虫、哺乳动物、鸟类等
昆虫杆状病毒属
• 主要感染昆虫，如果蝇、蚊子、蝴蝶等 • 具有宿主特异性，不同病毒针对不同的昆虫宿主
杆状病毒与宿主免疫系统具有相互影响的关系
• 病毒可通过抑制宿主免疫反应，逃避宿主免疫清除 • 宿主免疫系统可通过识别和清除病毒，抑制病毒复制和扩散
04
杆状病毒的应用与研究进展
杆状病毒在基因治疗中的应用
• 杆状病毒可作为基因载体，将目的基因导入宿主细胞 • 病毒具有宿主范围广、基因容量大等优点，适用于多种基因治 疗策略 • 通过基因编辑技术，改造病毒载体，提高基因导入效率和安全 性
哺乳动物杆状病毒属
• 主要感染哺乳动物，如猴子、松鼠、蝙蝠等 • 部分病毒可引起人类疾病，如出血热、脑炎等
杆状病毒的形态与结 构
• 杆状病毒呈长棒状形态，直径约20-30纳米，长度可达几百纳 米
• 病毒核衣壳由核壳蛋白组成，具有螺旋对称结构 • 病毒基因组为单链DNA或双链RNA，线性或环状 • 病毒基因组两端具有反向重复序列（ITR），有助于病毒复制和 组装 • 杆状病毒具有包膜结构，包膜上含有病毒蛋白，有助于病毒感染 宿主细胞
杆状病毒通过吸附、内吞和解包等过程感染宿主细胞
• 病毒吸附在宿主细胞表面，通过受体结合进入细胞 • 病毒通过内吞作用进入细胞，形成内质网或溶酶体内的病毒颗粒 • 病毒在细胞内解包，释放基因组，开始病毒复制和表达
杆状病毒表达系统医学PPT课件
12
同源重组：先将外源基因克隆到转移载体上，然后与线 性化Bacmid上共转染转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒：
13
• “转座”和“同源重组”目前都在使用中。
• “转座”方式的代表是ThermoFisher的Bac-to-Bac系统。
• 采用“同源重组”方式的有Clontech的BacPAK系统、OET 的FlashBac系统，以及Bacmid Ltd.的qBac系统。 • 这两种方式与外源基因的表达量无关。
6
• G. E. Smith将AcMNPV的EcoRI-I片段（包含多角体蛋白基 因）克隆到pUC8质粒上，然后把人β-干扰素基因克隆到 BamHI位点。 • 用重组的质粒和野生型的AcMNPV共同感染Sf细胞。 • 得到的病毒通过空斑筛选(0.5%)，得到重组病毒。 • 用重组病毒感染Sf细胞，得到β-干扰素。
杆状病毒表达系统
1
杆状病毒简介
• 杆状病毒是一类专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒 粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋 形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 Kb之间。 模式种是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）. • 核型多角体病毒有两种形式：一种为芽生病毒(budded virus, BV) ，另一种则为包涵体病毒(occluded virus, OV)。
S.A. Kaba et al. / Journal of Virological Methods 122 (2004) 113–118
17
敲除p26,p10,p74极大地提高了外源基因的产量：
Cell Biol Toxicol (2010) 26:57–68
18
糖基化改造 把昆虫细胞中缺少的糖基化酶克隆到Bacmid上，使蛋白 的糖基化更像哺乳动物细胞：
杆状病毒-课件
杆状病毒杀虫剂的研究
杆状病毒杀虫剂作为农作物、森林害虫防治 的新型安全的生物农药，已经得到了人们的重视。 与传统的化学农药相比，杆状病毒对宿主昆虫具 有高度的病原性，对非靶生物十分安全，能够在 环境中长期存活，对人、畜及其他脊椎动物无害， 不污染环境，能和其他化学农药混合使用，同时 具有防效时间长、使用方便等优点，所以早在 1973年就已被联合国粮农组织和世界卫生组织推 荐作为化学农药的理想替代品。
除了和复制相关的基因以外, 在AcMNPV基因组
中共鉴定出10个基因与晚期基因的转录有关,它们是lef4, lef-5, lef-6, lef-8, lef-9, lef-10, lef-11, lef-12, 39K和p47等 基因。其中4个保守基因( lef-4, lef-8, lef-9和p47)的产物
病毒基因表达
早期基因的表达 早期时相向晚期基因表达的过渡 晚期基因的表达
早期基因的表达
早期基因的转录是由宿主RNA聚合酶Ⅱ 介导的。早期基因迅速表达以满足病毒复制 周期所需条件：
控制宿主细胞的代谢机器 为病毒DNA复制提供必需条件 突破或阻断宿主细胞防御机制 提供下一时相病毒基因表达所需基因产物
HaSNPV ）
杆状病毒的分类
Baculoviridae 杆状病毒科
NPV Nucleopholyhedrovirus 核型多角体病毒属
GV Granulovirus 颗粒体病毒属
MNPV SNPV
Baculoviridae
NPV GV
组I 组 II
AcMNPV OpMNPV BmMNPV
LdMNPV SeMNPV HaSNPV
杆状病毒表达系统简介-9页精选文档
体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。
原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。
真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。
昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。
1、杆状病毒的生物学特性杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。
DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。
其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m 的包含体病毒，呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。
昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra— phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
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目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNＰV）ｂ］、家蚕核多角体病毒(BmＮPV) 、黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒(OpMNPＶ)、舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒（ＬdＭNＰV) 、甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒（SｅMＮPV)、棉铃虫核型多角体病毒(ＨａNPV),以及斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpｈMＮPＶ)。 目前ＡcMNPV基因组的研究最为深入,它是双链超螺旋大分子环状ＤＮA，其大小为９０~160kb，约编码１５4个基因。ＡｃMNＰV基因组的基因组织（genｅ orgaｎｉzation）较为复杂,基因组的不同区域具有功能分化,基因的分布尚无规律可循，但AcＭNＰＶ基因组含有８个同源区，每区含有不等的重复或倒置重复序列,这些重复序列由位于中间的不完整回文序列及其两侧各约2０bp的序列构成。同源区是杆状病毒基因组普通存在的功能域结构,对于基因表达的调节具有增强作用，同时也是 ＤNA复制的原点。
杆状病毒介绍
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杆状病毒
关键词:昆虫病毒，杆状病毒,核型多角体病毒，颗粒体病毒,质型多角体病毒
杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状,基因组为双链环状ＤNA分子,DＮＡ以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 Kb之间。目前杆状病毒作为高效、安全的无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。 杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现６０0多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到2０种。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子,大小为8０~160 kｂ，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DＮA复制后组装在杆状病毒的核衣内,后者具有较大的柔韧性,可容纳较大片段的外源ＤＮＡ插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。其中,用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒（ｎuｃleaｒ ｐolyｈｅdrｏｓis ｖiruｓ，NPV)。该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1～5 m的包含体病毒，呈多角体形状。核型多角体病毒有两种形式：
ＡcNＰＶ的基因表达分为４个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。前两个阶段的基因表达早于ＤＮA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中,有两种高效表达的蛋白,它们是多角体蛋白和P1０蛋白:多角体蛋白是形成包含体的主要成分,感染后期在细胞中的积累可高达30%~50% ，是病毒复制非必需成分,但对病毒粒子却有保护作用,可使之保持稳定和感染能力另一类高效表达的极晚期蛋白为P1０蛋白,也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因和P1０基因现在都已被定位和克隆这两个基因的启动子具有较强的启动能力,因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。
2．杆状病毒载体表达系统的特点
AcNPV病毒用作外源基因的表达载体,通常是通过体内同源重组的方法,用外源基因替代多角体蛋白基因而构建重组病毒。由于多角体基因启动子在感染后18~2４h开始转录和翻译，一直持续到７０ h。外源基因置换掉多角体基因后,并不影响后代病毒的感染与复制，意味着重组病毒不需要辅助病毒的功能。 杆状病毒表达系统自从第一次用来表达干扰素以后在许多重组蛋白的表达中得到广泛应用,例如用于表达白介素（IL)一2，３、BMＰ及多种病毒蛋白等。相对其他表达系统它具有以下几个方面的特点：
1．杆状病毒基因组的结构和功能研究
杆状病毒基因组为双链环状 DNA分子。DNＡ以超螺旋方式被压缩包装在杆状核衣壳(rod.ｓhaped nｕeleocａｐsiｄ）内,核衣壳包被脂质蛋白囊膜（eｎｖeloｐe)后形成病毒粒子。核衣壳包括衣壳(ｃapsid)蛋白和髓核(COlｅ)。其中衣壳蛋白是杆状病毒粒子的主要结构蛋白；髓核由病毒DNＡ分子和与其密切相关的碱性蛋白构成。碱性蛋白同ＤNA紧密结合以维持其复杂有序的超螺旋结构。
一种为包含体病毒(ocｃluded ｖｉrus，OＶ),
另一种则为细胞外芽生病毒(buｄded vｉrus,BＶ)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式,昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体,即为29 0０0的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用:①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。②保证病毒颗粒在适当的位置释放,引起感染。昆虫中肠上皮局部的强碱性环境（pＨ=1０．5),可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV,进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞直接在临近细胞内感染。 近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速,其中研究最深入的是ｍùｘu苜蓿银蚊夜蛾(auｔogrａ—phacaliforｎica)多核型多角体病毒（multｉple nuｃｌｅar polyｈedro-sis viｒuｓ，MNPV）,简称ＡcMNPV或AｃNPV。该病毒是杆状病毒科 Ｂａｃuloviridae的原型，是一种大的、带外壳 的双链DNA病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体的杆状病毒，主要是来自家蚕的NP～（bｏmｂyx ｍｏil，BｍNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白,且成本低，显示出良好的应用前景。本文主要介绍 AｃNPＶ病毒,BmNPV在许多方面与其具有共同的特征。