抗核抗体测定——免疫印迹法
实验报告三--免疫印迹
实验三：免疫印迹1 原理免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。
不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。
该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。
目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。
免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。
蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。
本试验采用湿法转移。
免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。
大多数应用前者。
本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。
转移结束后，蛋白质的检测可分成三个步骤进行：首先，将膜同特异性抗体孵育数小时或过夜，然后将膜同可特异性识别上述抗体（一抗）的第二抗体（二抗）孵育，通常二抗连接有如辣根过氧化物酶等标记物。
目的蛋白可由该酶催化的显色反应在膜上形成有色产物加以检测。
本实验用的是酶标抗IgG，故不加一抗。
2 试剂与仪器2.1 试剂（所有试剂均供两组用）2.1.1 转移缓冲液Tris 3.025g甘氨酸14.413g甲醇20mL加蒸馏水约800mL，调pH至8.3，定容1000mL2.1.2 Tris缓冲盐溶液(TBS)Tris 2.42gNaCl 27.750g加蒸馏水约800mL，调pH至7.5，定容1000mL2.1.3 TTBSTBS 800mLTween-20 400μl2.1.4 封闭液及抗体稀释液脱脂奶粉0.3gTBS 100mL2.1.5 底物溶液二氨基联苯胺（DAB） 5.0mgTBS 18mLH2O220μl 临用前配2.1.6 丽春红总蛋白质染色液丽春红1g4%乙酸100mL2.1.7 5%小牛血清生理盐水小牛血清7.5mL0.85%生理盐水定容至150mL2.1.8 酶标抗IgG（1：1500）酶标抗IgG 0.1mL5%小牛血清生理盐水定容至150mL2.2 仪器夹心式电泳槽，电泳仪，硝酸纤维素膜，直径9cm培养皿，剪刀，镊子，刀片，微量移液枪，普通滤纸3 试验步骤3.1 SDS-PAGE电泳分离所需试剂、仪器以及分离步骤完全与实验六相同，故此处从略。
抗核抗体的检测方法及原理
抗核抗体的检测方法主要包括间接免疫荧光法、放射免疫法、ELISA测定法和免疫印迹测定法。
以下是这些方法的简要介绍和原理：
1.间接免疫荧光法：此方法是检测抗核抗体的常用方法之一。
原理是将待测标本与细胞底物片（如HEp-2细胞）的相应抗原进行反应，然后加入
荧光素标记的抗人免疫球蛋白抗体（通常为抗IgG抗体），形成抗原-抗体-荧光二抗的复合物。
通过荧光显微镜观察，可以判断待测标本中是否存在针对细胞相关抗原的自身抗体。
2.放射免疫法：此方法常用于检测抗DNA抗体。
原理是用同位素标记DNA，与被检血清中的抗DNA抗体结合，然后通过沉淀和对比沉淀物与上
清液中的放射活性，得到DNA的结合活性。
结合率高于一定值（通常为20%）则判断为阳性。
3.ELISA测定法：即酶联免疫吸附法，是一种常用的固相酶免疫测定方法。
原理是将抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在
固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗去，最后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。
4.免疫印迹测定法：此方法是将混合的抗原作为凝胶电泳分离，然后转印到硝酸纤维素的薄膜上，再用标记抗体进行检测和分析。
以上各种方法都有其特点和适用范围，可以根据实验需求和条件选择合适的方法进行检测。
抗核抗体的检测方法
抗核抗体的检测方法
1. 酶联免疫吸附试验（ELISA），就像侦探在寻找线索一样，能精准地检测出抗核抗体是否存在呢。
比如说，在检查血液的时候，它能火眼金睛般地把抗核抗体给揪出来！
2. 免疫荧光法呀，如同一个神奇的魔法镜，可以让抗核抗体现形哟！就好比如你在黑暗中寻找东西，它一下子就把光打在了目标上，厉害吧！比如医生用这个方法能清楚地看到抗核抗体的情况呢。
3. 免疫印迹法可牛了，它仿佛是个智能识别器，对抗核抗体的辨别那叫一个准！你想想看，这不就像是在一堆东西里一下子挑出你想要的那个，是不是很神奇呀！像诊断一些疾病的时候就经常用到它呢。
4. 胶体金法呀，就像是个小巧玲珑的指南针，能快速指引出抗核抗体的方向哦！比如说在一些快速检测中，它就发挥大作用啦！
5. 化学发光法，那简直就是夜空中最亮的星呀，一下子就能把抗核抗体照亮呢！举个例子，在检测的关键时刻，它能给出最闪亮的答案！
6. 间接免疫荧光法，相当于一个精准的瞄准器，能准确无误地锁定抗核抗体呢！就像射击比赛中瞄准靶心一样厉害哟！比如在复杂的情况中它也能发挥威力。
7. 斑点酶免疫技术，如同一个细心的卫士，能牢牢地守住检测抗核抗体的关卡呀！想想看，是不是很有安全感呢！比如在特定的检测情境下它可重要啦。
8. 流式细胞术，哇塞，这可是个高科技的玩意儿呀，能高效地检测抗核抗体呢！这就好比有一双特别的眼睛，能瞬间捕捉到关键信息，厉害吧！像一些精确的分析中就少不了它。
9. 放射免疫法，那可是个厉害的角色呢，对检测抗核抗体有着独特的本领哦！就好像拥有超级力量一样，能准确找到目标呢！比如在一些专业的检测领域就有它的用武之地啦。
我觉得这些抗核抗体的检测方法都各有特点和优势，在医学诊断中都起着至关重要的作用呢！。
免疫印迹法检测抗核抗体谱比对分析
免疫印迹法检测抗核抗体谱比对分析蒋跃根;应葳;王峰来;蔡秀玲;李安生【期刊名称】《国际检验医学杂志》【年(卷),期】2014(035)001【摘要】目的比较抗核抗体谱-12S检测(antinuclear antibody profile,ANA-12S)试剂盒和抗核抗体谱线性免疫分析法检测(antinuclear antibody spectrum linear immunoassay,IMTEC-ANA-LIA)试剂盒对血清抗核抗体谱(antinuclear antibody spectrum, ANAs)检测结果的一致性,从而验证ANA-12S检测ANAs的有效性.方法收集于该院就诊的间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence,IIF)检测抗核抗体(ANA)阳性患者标本144例,其中男21例,女123例;ANA阴性患者标本10例,其中男2例,女8例.用IMTEC-ANA-LIA和ANA-12S分别进行ANAs检测.比较和分析两种方法所得的检测结果.结果 ANA 阳性标本中两者检测阳性率均为100％,其中ANA-12S法检测阳性项目占28.8％(497/1 728),IMTEC-ANA-LIA法检测阳性项目占27.7％(479/1 728),差异无统计学意义(x2=0.46,P＞0.05),ANA-12S法与IMTEC-ANA-LIA法检测结果总符合率为97.1％,Kappa值为0.929;ANA阴性标本中两者检测的阴性率均为70％(7/10),其中3例系统性红斑狼疮(SLE)疑似患者抗SmD1阳性,阴性项目占97.5％(117/120),总符合率100％,Kappa值为1.结论 ANA-12S与IMTEC-ANA-LIA的检测结果具有较高符合率和准确性;ANA-12S试剂盒可以作为快速、简便、经济的检测方法应用于自身抗体的检测.【总页数】3页(P39-41)【作者】蒋跃根;应葳;王峰来;蔡秀玲;李安生【作者单位】中国医学科学院皮肤病医院检验科,江苏南京210042;中国医学科学院皮肤病医院检验科,江苏南京210042;中国医学科学院皮肤病医院检验科,江苏南京210042;中国医学科学院皮肤病医院检验科,江苏南京210042;中国医学科学院皮肤病医院检验科,江苏南京210042【正文语种】中文【相关文献】1.间接免疫荧光法检测抗核抗体与免疫印迹法检测抗核抗体谱结果分析 [J], 田巧2.间接免疫荧光法检测抗核抗体与免疫印迹法检测抗核抗体谱结果的分析比较 [J], 李琦;彭旭娇;郭慧娟;高洁;陈丽丽;刘文娟;李雪;尚晓泓;3.间接免疫荧光法检测抗核抗体与免疫印迹法检测抗核抗体谱结果不一致的临床意义分析 [J], 莫伟平;张泳仪4.间接免疫荧光法检测抗核抗体与免疫印迹法检测抗核抗体谱结果分析 [J], 田巧;5.间接免疫荧光法检测抗核抗体与免疫印迹法检测抗核抗体谱结果的分析比较 [J], 李琦;彭旭娇;郭慧娟;高洁;陈丽丽;刘文娟;李雪;尚晓泓因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
实验一 免疫印迹
实验一、免疫印迹免疫印迹又常称Western blot，是一综合性的免疫学检测技术。
它利用SDS-PAGE技术将生物样品中的蛋白质分子按分子量的大小在凝胶上分离开，然后用电转移的方法将蛋白转移到固相膜上（NC、尼龙或PVDF膜），最后进行免疫学检测。
由于免疫学检测敏感性高，并且通过SDS-PAGE样品中的待检蛋白得到了浓缩，因此，Western blot的灵敏度特别高，可达到放射免疫的分析水平。
而使用一般的免疫学检测技术（如ELISA、放射免疫沉淀）检测时，由于要求被检测蛋白可溶、要求抗体效价高、亲和力高和特异性强，往往并不容易达到目的。
而Western blot却没有这些缺点。
因此，Western blot广泛应用于生物样品中是否存在某一蛋白质（抗原）的检测。
也可用于粗略测定抗原蛋白的相对含量和抗原多肽链的相对分子量。
一、原理是SDS-PAGE电泳与免疫检测相结合的一种蛋白质检测方法。
强阴离子去污剂SDS与还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）时，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
然后将蛋白质转移到膜上，继而用抗体进行检测。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
二、实验材料诱导与未诱导的带有口蹄疫病毒保护性抗原VP1与LTB融合蛋白基因的工程菌。
三、仪器、耗材与试剂（一）仪器、耗材DYY－6C电泳仪、DYCZ－24D垂直板电泳槽、封口机、DYCP－40C半干式转移电泳槽、5ml、1ml、200μl、50μl、10μl移液器及相应的Tip、50ml烧杯。
免疫印迹技术(Immunoblotting technique)
免疫印迹技术(Immunoblotting technique)免疫印迹技术又称蛋白质印迹(Western blotting)是一种借助抗原鉴定特异性抗体的有效方法，该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
本实验以检测可提取性核抗原(ENA)抗体为例。
【实验原理】先将ENA混合抗原经SDS-PAGE电泳，使各种抗原成分根据分子量不同区分开来，再通过电转印将各种抗原成分转印到硝酸纤维素薄膜上，血清中抗ENA抗体与硝酸纤维素薄膜上的ENA抗原成分结合，再与碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体结合，形成抗原抗体酶标抗体复合物，洗涤后加入底物显色，根据有无显色带的出现判断抗ENA抗体的有无，显色带的位置判断抗ENA抗体的类型。
【主要试剂与器材】1.ENA多肽抗体谱检测试剂盒包括印有ENA的硝酸纤维素薄膜、碱性磷酸酶记标的抗人IgG抗体、显色液(BCIP/NBT)、浓缩洗涤液和样品缓冲液、终止液、ENA多肽抗体标准带图谱等，有商品供应。
2.待检血清和阳性质控血清3.小型摇床、恒温箱、反应槽、吸管、微量移液器、滤纸等。
【操作方法】1.将浓缩洗涤液、样品稀释液按说明书用蒸馏水进行稀释。
2.抗原条放入反应槽中，每个槽内加入样品稀释液1.5ml浸泡5min后，弃去槽内液体。
3.用样品稀释液将血清1∶10稀释，吸取1.5ml稀释血清加入槽内，置小型摇床上孵育30min。
4.弃去槽内液体，每个槽内加入1∶10稀释的洗涤液 1.5ml浸泡5min后，弃去槽内液体，用吸水纸吸干。
5.吸取1.5ml用样品稀释液1∶10稀释AP标记的抗人 IgG，加入槽内，置小型摇床上孵育30min。
6. 同4洗涤。
7.每个槽内加入底物液1.5ml，置小型摇床上孵育 20min后，弃去槽内液体，用自来水洗净，加入终止液。
8.与标准显色带比较，判断结果。
【结果判断】将印迹膜上出现的显色区带与标准图谱比较，可判断哪种ENA抗体阳性。
临床医学检验基础知识讲解：抗核抗体检测方法
ANA的检测方法由于ANA的复杂性及多样性，故测定方法繁多。
目前ANA常用的方法有免疫荧光法、放射免疫法、ELISA、免疫双扩散、对流免疫电泳及免疫印迹技术等。
1.免疫荧光法检测血清总ANA最常用的方法是荧光免疫组化法。
多用小鼠肝切片或印片作为细胞核基质，结果比较稳定可靠，在荧光显微镜下见到的细胞核有荧光着色为阳性反应。
如将患者血清先进行不同比例的稀释，可以做大致的定量试验，在1：80稀释仍然虽阳性时，对SLE的诊断有较大的参考价值。
在油镜下观察结果，可以将ANA阳性的荧光现象分成4种主要的荧光核型，核型的确定对临床诊断有进一步的参考价值。
①周边型表示抗DNA抗体存在；②均质型表示有抗DNP抗体；③斑点（颗粒）型多为抗ENA抗体；④核仁型多为抗核小体抗体。
SLE患者常出现周边型、匀质型或混合型，斑点型多见于混合结缔组织病，而硬皮病多为核仁型；周边型对SLE有较高的特异性。
近年有人用锥虫或血鞭毛虫（例如绿蝇短膜虫试验）作基质测定抗dsDNA抗体，因为这些血寄生虫的动基体内含大量的纯dsNDA，无其他抗原干扰；在阳性结果时，可见鞭毛一端的动基体显示清晰的荧光。
因此该试验用于测定抗dsDNA抗体具有特异性强和敏感性高的优点。
另外，短膜虫对人畜无害，可以人工养殖，来源方便，值得推广。
2.放射免疫法常用检测抗DNA抗体，有Farr法及过滤法。
①Farr法的原理为用同位素标记DNA，被标记的DNA和被检血清的抗DNA抗体结合，经50%硫酸铵饱和液沉淀，然后比较沉淀物和上清液中的放射活性，从而得出DNA结合活性，一般结合率大于20%为阳性。
②过滤法是在分离结合物时用纤维素酯薄膜滤器（孔径为0.45μm）进行过滤，游离的DNA被滤去而与抗体结合的复合物被阻留在滤膜上。
3.ELISA临床上主要是应用间接ELISA检测抗dsDNA抗体，其重复性及敏感性均较对流免疫电泳及双扩散为高。
目前已有试剂盒供应。
4.免疫印迹（immunoblotting）先将混合抗原作凝胶电泳，分离开不同的区带，然后将这些带转印到硝酸纤维素膜上，最后用酸标抗体或放射性同位素标记抗体进行检测和分析（方法见第十五章）。
抗核抗体检测方法
抗核抗体检测方法抗核抗体检测是一种检测人体免疫系统中是否产生抗核抗体的检测方法。
抗核抗体是人体免疫系统对自身细胞核成分产生的自身抗体，它的产生可能与某些自身免疫性疾病有关，如系统性红斑狼疮、结缔组织病等。
抗核抗体检测是诊断这些疾病的重要方法之一。
目前，常见的抗核抗体检测方法主要有免疫荧光法（IFA）和酶联免疫吸附法（ELISA），其中IFA是目前广泛应用的技术。
以下是这两种检测方法的详细介绍：免疫荧光法（IFA）：免疫荧光法是通过抗体与标记有荧光物质的抗人免疫球蛋白结合，实现对抗体的检测。
该方法的具体步骤如下：步骤一：制备标本。
可以使用血清、脑脊液、淋巴细胞等标本，其中血清是最为常用的标本类型。
血清标本采血后离心分离血清即可。
步骤二：制备抗原。
可以用抗人免疫球蛋白（免疫球蛋白基因可以人工合成并表达），或者天然来源的细胞核抗原作为实验抗原。
抗原可以通过固相免疫部署在载玻片上，称为荧光抗核。
步骤三：加荧光抗体。
将标本加入荧光抗核预处理的载玻片上，通过抗体和荧光物质的结合，发出特定波长的荧光。
观察荧光显微镜下标本是否有抗核抗体与荧光抗核结合，并发出荧光信号。
酶联免疫吸附法（ELISA）：酶联免疫吸附法是采用抗原-抗体的特异性结合反应，利用酶标记反应物在固定载体上清晰可见的特性，将免疫反应产生信号转化成可见光信号。
该方法的具体步骤如下：步骤一：制备抗原。
与免疫荧光法相同，抗原可以用抗人免疫球蛋白或天然来源的细胞核抗原，固相免疫后称之为ELISA 片。
步骤二：制备酶标记抗体。
将具有高特异性的单克隆或多克隆抗体标记酶，如HRP、AP等，完成酶标记抗体的制备。
步骤三：获取样本。
样本的获取方法与免疫荧光法相同。
步骤四：洗涤。
将标本加入固定好的载体上，在空鼓内进行反应，然后通过流速控制洗涤液将未结合抗体和载体间的干扰物和废弃物全面清除。
步骤五：加入酶标记抗体。
将上述洗涤过的载体加入酶标记抗体，形成“反应物-酶标记抗体-待测样本抗体”复合物。
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抗核抗体测定——免疫印迹法
【申请单】请完成申请单所要求项目
XXX 市人民医院检验申请单
姓名
性别年龄
门诊号住院号
诊断或症状
检验标本
检验目的
送检科室医师
送检日期年月日
【方法选择】
表抗核抗体测定方法
方法 RIA 法免疫印迹法间接免疫荧光法本次检查选择√
【材料准备】
1.试验膜条：包被dsDNA、Sm、SS-A和SS-B抗原的硝酸纤维膜，为商品化试剂。
2.稀释缓冲液：直接使用
3.洗涤缓冲液：20倍浓缩，用前稀释。
4.结合物液：抗人IgG结合物，直接使用。
5.底物液：3,3‘，5,5’-四甲基联苯胺（1.2mmol/L），过氧化氢（2.4mmol/L）.
6.终止液：硫酸溶液（0.1mol/L），直接使用。
7.标本：待检血清、阴性和阳性对照血清。
8.仪器和材料：染色缸、吸管、滴管、孵育盘、培养箱等。
【操作方法】
1.样本准备：取10ul血清加入至1ml稀释缓冲液中混匀备用。
2.将试验膜条放入孵育盘，有色标面朝上，用洗涤缓冲液润湿反应膜，室温反应1分钟，
去除洗涤缓冲液。
3.加入稀释后的样本，室温孵育30分钟，清除液体，加入洗涤缓冲液孵育，同时轻微振荡，5分钟后去除液体，反复洗涤三次。
4.加入结合物液，室温孵育30分钟，按前述方法洗涤3次。
5.加入底物液，室温孵育10分钟，去除底物液。