双报告基因测试技术
双荧光素酶报告基因和单荧光素酶报告基因
双荧光素酶报告基因和单荧光素酶报告基因双荧光素酶报告基因是一种利用荧光技术对两种不同样本进行同时检测的技术。
这种技术通常用于检测基因表达水平差异或者鉴定基因变异。
双荧光素酶报告基因由两个不同的荧光报告基因组成，一个称为“参考荧光基因”，另一个称为“检测荧光基因”。
这两个基因都被置于同一个位点，通过一条多外显子基因互补的RNA链来实现对同一片DNA的双重检测。
参考荧光基因包括一个模板序列和一个感兴趣的序列，模板序列由参考荧光基因敲入DNA中，能够准确地定位感兴趣序列，这就是所谓的“特征序列”。
如果特征序列存在与基因片段中，那么参考荧光报告基因就会被激活，产生一定数量的荧光蛋白质，从而将荧光信号传递到另一端，即检测荧光基因。
检测荧光基因同样具有特征序列，以及一组检测序列，检测序列中包含与参考荧光基因“特征序列”配对的特征序列。
如果参考荧光基因产生的荧光信号与检测荧光基因的检测序列匹配，那么检测荧光基因也会被激活，产生荧光信号传递到检测荧光信号探测器。
这时，两个荧光报告基因产生的信号就会被比较，从而实现双荧光素酶报告基因的功能。
单荧光素酶报告基因是一种利用荧光技术监测基因活性的技术。
其基本原理是，在一个多外显子基因的载体上，编码一个荧光报告基因，将其茧入指定的基因片段，使其发挥不同的功能，例如检测基因表达水平、检测基因变异等。
单荧光素酶报告基因由一个荧光报告基因组成，其中包括一个特定的模板序列和一个感兴趣序列。
模板序列由单荧光素酶报告基因敲入DNA 中，能够准确地定位感兴趣序列，使其与检测序列特征相匹配，从而实现特定的功能。
当荧光报告基因成功敲入到DNA序列中时，它将引发激活，从而产生荧光蛋白质，从而向检测器传递荧光信号，从而实现单荧光素酶报告基因的功能。
此外，双荧光素酶报告基因和单荧光素酶报告基因都有其自身的优点和缺点。
双荧光素酶报告基因可以同时监测两个样本的变化情况，它的灵敏度更高，而且可以检测更广泛的基因表达情况，但是它也受受到一些偏差的影响，如果参考荧光基因和检测荧光基因的敏感度不同，就可能产生误差。
双报告
双荧光素酶报告基因测试在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时，通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。
但传统的共报告基因（比如CAT，β-Gal，GUS）不够便利。
因为各自的测试化学，处理要求，检测特点存在差异。
Promega提供一种先进的双报告基因技术，结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。
双荧光素酶报告基因测试系统，结合pRL载体系统，表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶，在单管中进行双荧光素酶报告基因测试，快速，灵敏，简便。
系统还提供PLB裂解液，用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞，不需操作单个样品。
对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。
双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。
介绍双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测，通常一个报告基因作为内对照，使另一个报告基因的检测均一化。
检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。
通常实验报告基因偶联到调控的启动子，研究调控基因的结构和生理基础。
报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照，使测试不被实验条件变化所干扰。
通过这种方法，可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性，比如，培养细胞的数目和活力的差别，细胞转染和裂解的效率。
使用萤火虫荧光素酶，结合氯霉素乙酰转移酶（CAT），β-半乳糖苷酶（β-Gal），或葡萄醛酸糖苷酶（GUS）的双报告基因，近几年已普遍使用。
但这些双报告基因组合削弱了荧光素酶操作的优势, 比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行，但CAT，β-Gal和GUS测试法，则在定量前需要长时间的保温。
另外，这些报告基因受限于它们的灵敏度和线性应答范围，必须注意不要超过这些范围，内源性细胞活力也会干扰这类报告基因的使用。
许多类型的细胞有内源β-Gal或GUS表达，不利于准确定量报告基因表达，胞内去乙酰酶活力干扰CAT活力测试。
双荧光报告实验步骤
双荧光报告实验步骤1. 实验目的本实验旨在使用双荧光报告基因体系，通过改变操作步骤，观察荧光信号的变化，从而了解该基因体系在实验条件下的表达情况。
2. 实验材料•双荧光报告基因体系•细胞培养基（适合目标细胞的培养基）•细胞培养器具（细胞培养箱、培养皿、离心管等）•显微镜和荧光显微镜•实验操作工具（离心机、移液器等）3. 实验步骤步骤一：细胞培养1.选取适合目标细胞的培养基，并按照相关规定配制培养基。
2.将培养基分装至培养皿中，保持无菌状态。
3.用吸管将目标细胞悬浮液加入培养皿，使细胞均匀附着在培养皿底部。
4.将培养皿置于细胞培养箱中，控制好温度、湿度和二氧化碳浓度。
5.在适当的时间点观察细胞的生长情况。
步骤二：转染双荧光报告基因体系1.将待转染的细胞收集至离心管中，进行离心。
去除上清液，保留沉淀。
2.使用合适的转染试剂将双荧光报告基因体系导入细胞。
3.转染后，将细胞培养于适合其生长的培养基中，并继续培养。
步骤三：观察荧光信号1.在一定时间后，取出培养皿，观察转染细胞的形态。
2.使用显微镜观察细胞的荧光信号。
3.如果需要，可以使用荧光显微镜进行进一步观察。
步骤四：数据分析1.根据观察到的荧光信号，记录下各组细胞的荧光强度等数据。
2.对数据进行统计学分析，比较不同实验组之间的差异性。
3.对结果进行解读，得出实验结论。
4. 注意事项1.实验过程中需保持实验环境的无菌状态，避免细菌和其他微生物的污染。
2.实验材料和工具的选择要合适，确保实验顺利进行。
3.实验步骤中的时间、温度和湿度等参数要严格控制，以保证实验结果的可靠性。
4.实验结束后，要对实验设备和实验区域进行清理和消毒，避免交叉污染。
总结通过以上实验步骤，我们可以使用双荧光报告基因体系来观察荧光信号的变化情况。
这个实验体系可以广泛应用于生物学、医学等领域的研究中，帮助人们了解细胞的表达情况和功能特性。
在实验中，要注意保持实验环境的无菌状态，严格控制实验参数，以获得可靠的实验结果。
双荧光素酶报告基因检测实验步骤
双荧光素酶报告基因检测实验步骤引言：双荧光素酶报告基因检测是一种常用的实验方法，它利用双荧光素酶（Dual-Luciferase）系统来研究基因表达的调控机制。
本文将详细介绍双荧光素酶报告基因检测的实验步骤，以及实验中需要注意的事项。
一、材料准备1. 双荧光素酶报告基因载体：包含荧光素酶基因和Renilla荧光素酶基因。
2. 细胞培养基：适用于所研究细胞的培养基。
3. 转染试剂：常用的转染试剂有聚乙烯醇（Polyethylenimine，PEI）、脂质体等。
4. 荧光素酶底物：如荧光素、Renilla荧光素等。
5. 其他实验所需试剂：如维生素C、PBS缓冲液等。
二、细胞处理1. 细胞培养：将所研究的细胞株接种在含有适当浓度的培养基中，培养至适当的细胞密度。
2. 细胞分组：根据实验设计，将细胞分为实验组和对照组。
3. 细胞转染：将双荧光素酶报告基因载体转染至细胞中，可以使用PEI等转染试剂进行转染。
三、荧光素酶检测1. 收集细胞：根据实验设计，收集转染后的细胞。
2. 细胞裂解：使用细胞裂解缓冲液裂解细胞，释放内部的荧光素酶和Renilla荧光素酶。
3. 荧光素酶检测：将细胞裂解液与荧光素酶底物混合，测定荧光素酶活性。
4. Renilla荧光素酶检测：将细胞裂解液与Renilla荧光素酶底物混合，测定Renilla荧光素酶活性。
四、数据处理与分析1. 荧光素酶活性计算：根据荧光素酶底物降解产生的荧光信号强度，计算荧光素酶活性。
2. Renilla荧光素酶活性计算：根据Renilla荧光素酶底物降解产生的荧光信号强度，计算Renilla荧光素酶活性。
3. 相对荧光素酶活性计算：将荧光素酶活性除以Renilla荧光素酶活性，得到相对荧光素酶活性。
4. 统计分析：使用适当的统计方法，如t检验、方差分析等，对实验数据进行统计分析。
五、注意事项1. 实验条件统一：实验过程中，保持细胞培养条件的统一，如培养基组成、温度、湿度等。
双荧光素酶报告基因检测实验过程
双荧光素酶报告基因检测实验过程在生物实验室里，双荧光素酶报告基因检测可真是一门有趣的技术。
听起来复杂，其实也不难，咱们就来聊聊这其中的酸甜苦辣吧。
双荧光素酶就像两个好朋友，默契配合，帮助我们探测基因的活动。
想象一下，一对小伙伴儿，打着灯笼，帮你照亮那条神秘的基因小路。
你看看，这灯光一亮，哎呀，所有的秘密都暴露无遗了！咱们实验的第一步就是准备样品。
这个过程呢，就像做一顿美味的家常菜，得有好食材。
我们需要选择适合的细胞或者组织，像是挑选新鲜的蔬菜水果一样，小心翼翼。
然后把这些样品处理得干干净净，保证它们能发出耀眼的荧光。
你瞧，这准备工作就像打好基础，只有基础打牢，后面的实验才会顺顺利利。
就这点小细节，可别大意了哦。
就是要把我们的双荧光素酶基因转染到细胞里。
转染的过程其实挺像是给细胞植入一个小秘密，嘿嘿，细胞可不知道它们要接收什么新鲜玩意儿。
一旦转染成功，细胞就开始疯狂表达这两个荧光素酶，像是开了趴一样热闹。
不久后，这些小家伙儿就会开始发光，灯火通明。
这时候，你可能会想，“哇，真的发光了？”没错，这就是科学的魅力，真是让人惊叹不已啊。
然后，我们就得用荧光显微镜来观察这些细胞。
看着这些发光的小家伙，就像看星星一样，特别美妙。
这里的关键在于调节显微镜的参数，光亮得刚刚好，不多不少。
太亮了可能看不清，太暗了就显得有些无趣。
就像调味料，得掌握好分寸。
这个过程有点像是在做一场灯光秀，要把每一个细节都调到最佳，才能让你眼前一亮。
然后呢，咱们得定量分析一下这些荧光的强度。
说白了，就是要算一算，哪些基因在欢欢喜喜地工作，哪些可能在“打瞌睡”。
这可不是简单的算术题，而是一场数据的盛宴。
把所有的荧光强度都记录下来，汇总成一个漂亮的数据表。
看到那些图表的时候，你会觉得，哎，自己的努力真是没有白费。
每一个数字都像是一颗颗璀璨的宝石，闪闪发光。
哦，对了，实验过程中还得小心翼翼，不要让外部因素影响到结果。
就像在厨房里，锅得掌握好温度，火候过了就糟糕了。
双荧光素酶报告基因检测
双荧光素酶报告基因检测双荧光素酶报告基因检测是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术。
它利用双荧光素酶作为报告基因，通过检测其表达水平来研究目标基因的调控机制、信号转导通路以及疾病发生发展的相关机制。
本文将介绍双荧光素酶报告基因检测的原理、应用及其在科研和临床中的意义。
双荧光素酶报告基因检测的原理是利用双荧光素酶基因（Luciferase）和绿色荧光蛋白基因（GFP）等作为报告基因，将其与目标基因的启动子或调控元件相连，构建成表达载体，转染到细胞中。
当目标基因的启动子或调控元件被激活时，报告基因也会被激活，从而产生荧光素酶或绿色荧光蛋白，可以通过荧光素酶活性检测或荧光显微镜观察来检测目标基因的表达水平和细胞定位。
双荧光素酶报告基因检测在生物学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于研究基因的调控机制。
通过构建不同长度或突变的启动子或调控元件，可以研究基因的启动子活性、转录因子结合位点以及信号通路的调控机制。
其次，它可以用于筛选药物或研究药物的作用机制。
通过将报告基因与目标基因共转染到细胞中，可以研究药物对目标基因表达的影响，从而筛选出具有特定生物学活性的化合物。
此外，双荧光素酶报告基因检测还可以用于研究基因的表达模式、细胞信号转导通路以及疾病发生发展的相关机制。
在临床诊断中，双荧光素酶报告基因检测也有着重要的意义。
例如，在肿瘤诊断中，可以利用双荧光素酶报告基因检测来研究肿瘤相关基因的表达水平，从而为肿瘤的分子诊断和靶向治疗提供依据。
此外，双荧光素酶报告基因检测还可以用于检测病毒感染、细胞凋亡、细胞增殖等生物学过程，为临床诊断和治疗提供重要参考。
总之，双荧光素酶报告基因检测作为一种重要的生物学检测技术，在科研和临床中有着广泛的应用前景。
它不仅可以帮助科研人员深入研究基因调控机制和疾病发生发展的相关机制，还可以为临床诊断和治疗提供重要的实验依据。
相信随着技术的不断进步和完善，双荧光素酶报告基因检测将在生物学研究和临床诊断中发挥越来越重要的作用。
双荧光素酶报告基因实验步骤
双荧光素酶报告基因实验步骤双荧光素酶报告基因实验是一种常用的生物学实验方法，用于研究基因表达、蛋白质相互作用等生物学过程。
下面将介绍双荧光素酶报告基因实验的详细步骤，希望能对您的实验工作有所帮助。
1. 质粒构建。
首先，需要将双荧光素酶报告基因构建到适当的表达载体中。
一般来说，可以选择pGL3基因表达载体，将双荧光素酶报告基因插入到该载体的多克隆位点中。
构建好的质粒可以用于转染细胞进行后续的实验操作。
2. 细胞培养。
接下来，需要选择适当的细胞系进行实验。
常用的细胞系有HEK293、HeLa等。
将选定的细胞系进行培养，直至细胞密度达到要求，可以进行后续的转染实验。
3. DNA转染。
将构建好的双荧光素酶报告基因质粒转染至培养好的细胞中。
可以选择合适的转染试剂，按照试剂说明书的操作步骤进行转染。
转染后，将细胞培养在含有适当抗性筛选剂的培养基中，以筛选转染成功的细胞。
4. 荧光素酶活性检测。
转染后的细胞需要进行荧光素酶活性检测。
首先将培养基抽取，然后加入荧光素底物，测定细胞中荧光素酶的活性。
可以使用荧光素酶检测试剂盒进行操作，按照说明书进行操作。
5. 双荧光素酶报告基因实验结果分析。
最后，根据实验结果进行数据分析。
可以通过比较不同组的荧光素酶活性来研究基因的表达水平，或者研究蛋白质的相互作用等生物学过程。
通过实验结果，可以得出相应的结论并进行讨论。
以上就是双荧光素酶报告基因实验的详细步骤。
希望对进行该实验的科研工作者有所帮助，也希望大家能够在实验中取得理想的结果。
祝实验顺利！。
双荧光素酶报告基因检测原理
双荧光素酶报告基因检测原理双荧光素酶报告基因检测，这个听起来像科幻电影里的术语，其实在生物医学研究中可是个大热门。
想象一下，在实验室里，科学家们像侦探一样，利用这些小小的荧光素酶，追踪细胞里的各种动态，简直就像在进行一场神秘的探险！那么，今天我们就来聊聊这个有趣的原理，保证让你听了后对科学有新的认识，甚至还会有点儿“小惊喜”哦。
1. 什么是双荧光素酶报告基因？首先，我们得搞清楚“双荧光素酶报告基因”到底是个什么玩意儿。
简而言之，这是一种检测工具，用来观察细胞内部的某些过程，比如基因表达、信号传导等。
就像一个聪明的“小侦探”，它能告诉我们细胞里发生了什么事情。
这种方法利用了荧光素酶的特性，简单地说，就是当有特定的反应发生时，它就会发出光亮，像烟花一样闪烁。
哇，想想都觉得酷炫！1.1 荧光素酶的角色那荧光素酶究竟是啥呢？其实，它是一种酶，可以催化某些反应，产生荧光。
在我们的实验中，科学家们常用的就是萤火虫里的荧光素酶和海洋生物中的荧光素酶。
这两者都有各自的特点，前者发出的光亮比较稳定，后者的光亮则更为强烈。
听起来是不是有点像在选择超级英雄？不同的“能力”，用得好的话，就能让实验如虎添翼！1.2 双荧光素酶的优势双荧光素酶的厉害之处在于，咱们可以同时监测两个不同的信号。
这就好比是把两个侦探派去同一案件，分别观察不同的线索。
比如，一个探员监测基因A的表达，另一个则关注基因B的情况。
这种方法的好处是，能够提供更全面的信息，减少误差，毕竟有多个“眼睛”看总比一个好嘛！2. 检测原理接下来，让我们深入到这个神奇的检测原理。
其实，双荧光素酶报告基因的工作流程，就像是烹饪一道美食，步骤分明，缺一不可。
2.1 基因构建首先，科学家们要把荧光素酶的基因放进细胞中，这就像是在给细胞注入了一剂“特效药”。
在实验室里，这个过程可以通过转染技术来实现，就是把荧光素酶基因和其他相关基因一起放进去，让细胞开始表达这些荧光素酶。
2.2 信号检测然后，一旦细胞开始工作，荧光素酶就会被激活。
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双荧光素酶报告基因测试：结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时，通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。
但传统的共报告基因（比如CAT,B -Gal,GUS）不够便利，因为各自的测试化学，处理要求,检测特点存在差异。
Promega提供一种先进的双报告基因技术，结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。
双荧光素酶报告基因测试系统，结合pRL 载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶，在单管中进行双荧光素酶报告基因测试，快速，灵敏，简便。
系统还提供PLB裂解液，用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞，不需操作单个样品。
对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。
双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。
介绍双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测，通常一个报告基因作为内对照，使另一个报告基因的检测均一化。
检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。
通常实验报告基因偶联到调控的启动子，研究调控基因的结构和生理基础。
报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照，使测试不被实验条件变化所干扰。
通过这种方法，可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性，比如，培养细胞的数目和活力的差别，细胞转染和裂解的效率。
使用萤火虫荧光素酶，结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), B -半乳糖苷酶(B -Gal),或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因，近几年已普遍使用。
但这些双报告基因组合削弱了荧光素酶操作的优势，比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行，但CAT, B -Gal和GUS测试法，则在定量前需要长时间的保温。
另外，这些报告基因受限于它们的灵敏度和线性应答范围，必须注意不要超过这些范围，内源性细胞活力也会干扰这类报告基因的使用。
许多类型的细胞有内源B -Gal 或GUS表达，不利于准确定量报告基因表达，胞内去乙酰酶活力干扰CAT活力测试。
尽管在高温下预处理细胞裂解液(1,2),会降低内源性B -Gal和CAT测试的干扰，但这些处理也会快速失活荧光素酶。
因此,在此类双报告基因检测中，必须以不同的步骤分别处理共转染的细胞裂解液。
理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶所具有的速度,灵敏和线性范围对同一样品中的两个报告基因同时测定。
这在传统的报告基因，如CAT, B -Gal和GUS是不可能的，由于它们测试化学，处理要求所固有的局限。
相反，结合萤火虫(Photinus pyralis )和海洋腔肠(Ren ilia reni formis )双荧光素酶，Promega的双荧光素酶报告基因测试（DLR）系统可满足这些要求，在单管中完成这些测试。
双荧光素酶报告基因测试化学荧火虫和海洋腔肠荧光素酶都具有生物发光报告基因的卓越的测试特点，但它们在进化上的起源不同，因此，具有不同的酶学结构和底物要求。
这些差别用来发展了DLR测试化学，选择性地区别这两种发光报告基因的活力。
萤火虫荧光素酶是一个61kDa单亚基蛋白质，酶活力不需翻译后修饰（3,4）, 在翻译后即可作为遗传报告基因。
在ATP,Mg 2+和0 2存在下，通过甲虫荧光素的氧化反应发光（图1）。
在常规反应条件下，荧光素的氧化发生时，以荧光素-AMP 作为中间体，转换非常缓慢。
结果，在底物和酶混合后，测试化学产生"闪烁"的光，并迅速衰减。
专利化的测试试剂，定量萤火虫荧光素酶活力，掺入了辅酶A（CoA）,增强快速酶转换来提高反应动力学（5）,导致持续的"闪烁"发光信号（图2）。
图1由萤火虫和Ren ilia荧光素酶催化的生物发光海洋腔肠荧光素酶，一个36 kDa 单亚基蛋白质，纯化自天然来源的Renilla reniformis （6），含有3%的碳水化合物，但是和萤火虫荧光素酶一样，酶活力不需翻译后修饰，在翻译后即可作为遗传报告基因。
海洋腔肠荧光素酶所催化的发光反应，利用O 2 和海样腔肠荧光素（coelenterazine）（图1）。
当用DLR测试化学作实验时，海洋腔肠荧光素酶反应的动力学产生闪烁型发光信号，在检测过程中缓慢地衰减（图2）。
在DLR测试系统中，用单个裂解液分步测定萤火虫和海洋腔肠荧光素酶活力。
在完成萤火虫荧光素酶活力（" 实验"报告基因）的测定后，萤火虫发光被快速湮灭，并同时激活海洋腔肠荧光素酶的发光反应（" 对照"报告基因）。
因此，DLR测试系统整合了两个测试化学，对共表达的两个报告基因作快速地定量，酶来自转染细胞裂解液，或无细胞转录/ 翻译反应。
萤火虫荧光素酶测试的线性范围延伸达酶浓度的8 个数量级，可测定w 1fg （大约10 -20摩尔）的实验报告基因酶（图3A）。
用双荧光素酶报告基因测试系统，海洋腔肠荧光素酶的线性范围达酶浓度的7个数量级，较低的底限是w 10fg （大约3X 10 -19摩尔）的对照报告基因酶（图3B），并且这两个酶的特异活力相似。
KU图2用双荧光素酶报告基因测试由萤火虫和Reni Ila荧光素酶产生的发光。
CHO细胞（1 X 10 6 /60mm培养板）共转染pGL3Control和pRLSV40载体DNA细胞用PBS洗涤后，加入400卩I PLB 制成裂解液。
将20卩l小量细胞裂解液和100卩l荧光素酶测试试剂ll （LARII）混合，萤火虫荧光素酶的活力立即用荧光照度仪检测（细线示踪）。
100卩l Stop &Glo TM 试剂加入到荧光照度仪管中，湮灭萤火虫荧光素酶反应，同时激活Renilla荧光素酶反应，并立即检测Ren ilia 荧光素酶的活力（粗线示踪）。
Turner Desig ns 型号20/20荧光照度仪配有计算机用来示踪荧光发射，12秒内完成两次测试。
双荧光素酶报告基因测试系统的方式定量两个报告基因荧光素酶的发光信号，可在制备裂解液后立刻进行，不需将样品分成小组分或作额外的处理。
因海洋腔肠和萤火虫荧光素酶均呈现闪烁型反应动力学，作双荧光素酶报告基因测试不需要有试剂注射器的荧光照度仪。
通常DLR测试，大约需要30秒钟完成，如图4所说明。
起始萤火虫荧光素酶报告基因测试时，将一份裂解产物和荧光素酶测试试剂II (LAR II) 混合。
在完成萤火虫荧光素酶测试时，此时萤火虫发光被湮灭，同时激活海洋腔肠荧光素酶的发光，加入Stop & Gio TM试剂到样品管。
在1秒钟内，Stop & Gio TM试剂湮灭大于10 5滴度萤火虫反应的发光信号(图5)，并同时激活海洋腔肠荧光素酶。
ma* w 百屯•WW igp qQl图3萤火虫荧光素酶和Reni Ila荧光素酶发光反应的线性范围。
纯化的萤火虫和Renilla荧光素酶连续地用含1mg/ml BSA的1x PLB稀释，配有计算机的Turner Desig ns荧光照度仪用来检测10秒钟的总荧光，在最初2秒的预读延迟后。
直接检测高浓度的两种荧光素酶的发光反应时，在荧光照度仪的样品室中加入中性密度滤光片。
在含10fg和1OOfg的Renilla荧光素酶反应中测试发光，需减去来自海洋腔肠荧光素自发光的背景信号。
两种荧光素酶的发光活力对各自的测试变化浓度作图图4用手工荧光照度仪或配有试剂加样器的荧光照度仪的双荧光素 酶测试方式。
如荧光照度仪配有两个加样器，将裂解液预先分装到荧 光照度仪的管子中，随后按序自动加入Luciferase Assay Reage nt II (LAR II) , Stop & GloTM 试剂。
PLB 裂解液PLB 裂解液(Passive Lysis Buffer) ，经特别设计可有效裂解培养的哺乳细胞，而不必刮下贴壁细胞或作冻融循环。
尽管PLB 设计应用 于被动裂解过程中，但它可靠的裂解效果同样有益于使用常规处理方 法制作的裂解液。
无论使用何种裂解方法，对培养的哺乳细胞而言，释放到PLB 裂解液中的萤火虫和海洋腔肠荧光素酶报告基因酶是定 量和可靠的（图6）。
被动裂解液的一个明显优点，是可以抑制低水 平的非酶促发光（自发光），这是海洋腔肠荧光素在水溶液中的固有 特点。
通常用来制备细胞裂解液的试剂可增强海洋腔肠荧光素自发 光，包括Triton? X-100, Promega 的细胞培养裂解试？（CCLR ）和报 告基因裂解试剂（RLB ），这些试剂还会显著抑制海洋腔肠荧光素酶的 发光反应。
PLB 经特别设计用来最大地增强荧光素酶活力，使自发光减弱到最低，IOC idStop&g"试髀 I 茁n 左宣恳* (RMawxaH}可提供最优的测试灵敏度，定量很低水平的海洋腔肠荧光素酶。
另外，PLB抑制发泡，非常适合高通量应用，可用于自动化系统中将培养在多孔板中的细胞组制备成裂解液并测试。
1000000si n?100.000MB10.000)000 1100 ]10、1 i 010 :£“爪力rpi棍力潇力图5双荧光素酶报告基因测试系统湮灭萤火虫荧光素酶发光和激活Ren ilia荧光素酶发光。
CHC细胞裂解液有共转染pGL3 -Co ntrol和pRL SV40载体DNA按图2描述的方法制备。
萤火虫荧光素酶（报告基因1）和Ren ilia荧光素酶（报告基因2）活力检测在10秒内完成，最初有2秒的预读延迟。
为了显示Stop & Gio TM 试剂湮灭报告基因1的高效率，加入等体积的Stop & Gio TM 试剂（缺少海洋腔肠荧光素无法激活Renilla荧光素酶反应），萤火虫荧光素酶发光被湮灭而又不激活Ren ilia荧光素酶发光。
在这一实验中，湮灭萤火虫荧光素酶反应的残留发光，小于未湮灭反应值的0.0004%■ l-gtr■績型知!*■ M肿图6用PLB裂解哺乳细胞的高效率和被动或主动裂解方法。
用pGL3-Control和pRL-SV40载体DNA共转染图示的培养哺乳细胞，制备裂解液时，向贴壁细胞加入PLB温和摇动培养液达15分钟（被动细胞裂解），或从培养板中刮下贴壁细胞，在-80C进行1次冻/融循环（主动细胞裂解）。
萤火虫和Ren ilia荧光素酶活力用DLR方法确定，如图4所示。
为了便于比较，报告基因活力用主动裂解方法对每种细胞进行归一化。
图A:萤火虫荧光素酶报告基因活力。
图B: Ren ilia荧光素酶报告基因活力。
海洋腔肠荧光素酶对照载体pRL系列设计的pRL载体系列可在哺乳动物细胞中，组成型地表达海洋腔肠荧光素酶。