抗氧化剂抗氧化活性的测定方法
抗氧化物活性测定方法总结
抗氧化物活性测定方法总结抗氧化物活性测定方法是通过对样品中的抗氧化物质含量和抗氧化活性进行定量分析，评估其对自由基的清除能力和抗氧化能力。
随着抗氧化研究的不断深入，测定方法也逐渐完善。
以下是对常见的抗氧化物活性测定方法的总结。
1. ORAC法（氧化应激反应活性测定法）：该方法通过测定样品清除自由基的能力来评估其抗氧化活性。
实验中，将样品与荧光试剂（如2,2'-azobis(2,4-dimethylvaleronitrile)）共同作用，观察其清除自由基的能力，并通过建立标准曲线计算样品的ORAC值。
2.DPPH法（1,1-二苯基-2-苦味基-苦味酸磷）：该方法是一种常用的快速测定抗氧化活性的方法。
实验中，将样品与DPPH稳定自由基共同作用，通过比色反应观察DPPH自由基被样品清除的程度，从而评估抗氧化活性。
3.ABTS法（2,2'-联氮双5-苯砜酸）：该方法通过ABTS离子自由基的生成和清除反应来测定样品的抗氧化活性。
实验中，ABTS与过氧化氢反应生成ABTS离子自由基，通过观察样品对其的清除能力来评估抗氧化活性。
4.FRAP法（亚铁离子还原能力）：该方法基于样品对人造抗坏血酸（Fe3+）的还原能力，通过测量还原后的Fe2+离子的生成量来评估抗氧化活性。
实验中，将样品与Fe3+离子反应生成Fe2+离子，通过比色反应来测定Fe2+的含量。
5. 碘标法（Iodine value）：该方法用于测定油脂、脂肪等样品的抗氧化活性。
实验中，将已知量的碘与样品中的不饱和化合物反应，在光反应下观察反应终点的颜色变化，并根据标准曲线计算样品的抗氧化活性。
6. 硝酸盐法（Nitrite method）：该方法用于测定样品中亚硝酸盐的含量，从而评估其抗氧化活性。
实验中，样品经过还原反应生成亚硝酸盐，然后与DANO（N-乙基-N-（2-苯基乙基）-对硝基苯胺）反应生成稳定的偶氮染料，通过比色测定反应终点的吸光度来计算样品中亚硝酸盐的含量。
抗氧化物活性测定方法总结
抗氧化物活性测定方法总结抗氧化物活性 (antioxidant activity)描述了化学物质在抑制或减少氧化反应中所起的作用。
抗氧化物是一类具有亲电子的分子，它们容易被氧化，从而中和自由基。
抗氧化物具有重要的生物学和医学意义，因为氧化损害是许多疾病和老化的主要原因。
因此，抗氧化物活性测定方法是目前研究的热点之一，现将抗氧化物活性测定方法进行总结:1. DPPH法：该方法是一种常用的体外抗氧化测定方法。
含有DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）的溶液表现为紫色，DPPH自由基上的氢原子被抗氧化物夺取后，DPPH自由基变成无色，从而可以通过紫外可见光谱测定其吸光度的降低来表示抗氧化物活性。
2. ABTS法：该法通过测定2,2’-联氮双(3-乙基苯并咪唑啉硫酸铵) (ABTS)自由基的消除能力来测定抗氧化活性。
该法也是一种体外抗氧化测定方法，溶液发生颜色变化，从而通过紫外可见光谱测定其吸光度的降低来表示抗氧化物活性。
3. ORAC法：ORAC（氧化还原能力值）法对不同化学物质的体内抗氧化活性进行定量测定，其原理是将抗氧化剂加入与有氧气气氛接触的荧光染料溶液中，由于受到氧自由基的攻击，染料随着时间流逝会逐渐减少。
为了确定不同化学物质的抗氧化活性，十分重要的是应该不断输入氧自由基。
4. FRAP法：铁还原能力 (FRAP) 方法测量样品对Fe3+的还原能力，其原理是将含有Fe3+的试液与抗氧化剂反应后，Fe3+被还原为Fe2+，测试Fe2+的含量即可评估抗氧化剂的抗氧化性能。
5. TBARS法：该方法是用于评估脂质过氧化物含量，从而推断抗氧化剂的能力。
该评估方法是通过测定细胞膜上的脂质过氧化产物（丙二醛）来分析抗氧化剂活性。
6. Total Phenolic Content (TPC)法：该方法最初是用来测定葡萄酒和咖啡中酚类化合物含量的。
后来发现大多数植物成分含有大量的酚类化合物，故也用于测定植物中的酚类含量。
3种抗氧化活性测定方法
3种抗氧化活性测定方法抗氧化活性测定是评估物质抗氧化能力的重要方法，常用于食品、药物和化妆品等领域。
下面将介绍三种常用的抗氧化活性测定方法。
一、DPPH自由基清除法DPPH(2,2-二苯基-1-苦味肼)是一种常用的抗氧化剂，它能采用紫色的自由基形式存在，并且在反应中会转变为无色的稳定形式。
DPPH自由基清除法是一种简单而直观的测定方法。
该方法的基本原理是将待测物添加到预先溶解的DPPH中，反应一段时间后，根据颜色变化程度来评估抗氧化活性。
通过测量样品溶液吸光度的降低来计算其清除率，清除率越高，抗氧化能力越强。
二、FRAP法FRAP(铁还原能力)法是一种评估抗氧化物质电子给予能力的方法。
抗氧化物质能够通过给予电子来中和自由基的电子，从而保护细胞免受氧化损伤。
FRAP法通过反应产生的铁（II）络合物的吸光度变化来评估样品的抗氧化能力。
具体操作中，将待测物加入到铁（III）试剂（通常为铁(III)氯化物）中，待反应一定时间后，读取吸光度。
样品的抗氧化能力可以通过吸光度的变化来计算。
三、TBARS法TBARS(硫代巴比妥酸反应物)法是一种评估脂质过氧化的方法。
脂质过氧化是一种自由基引起的反应，会导致脂质的氧化和脂质分解产生不稳定化合物。
TBARS法主要用于评估食品和药物等样品中脂质过氧化的程度。
该方法通过将待测样品与反应试剂（如硫代巴比妥酸）反应生成稳定的色素产物，然后测量这种产物的吸光度来评估脂质过氧化的程度。
吸光度越高，脂质过氧化程度越高。
综上所述，DPPH自由基清除法、FRAP法和TBARS法是常用的抗氧化活性测定方法。
每种方法都有其独特的原理和应用范围，选择适合的方法可以准确评估样品的抗氧化能力。
在实际应用中，可以根据实验需求选择合适的方法，或结合多种方法综合评估抗氧化活性。
抗氧化物活性测定方法总结
抗氧化物活性测定方法总结引言：抗氧化物活性测定在食品、医药、化妆品以及生命科学等领域具有重要应用。
目前，常用的抗氧化物活性测定方法主要包括化学法、生物法和物理法。
本文将对这几种方法进行总结。
一、化学法1.1.DPPH自由基法该方法是目前应用最广泛的抗氧化活性测定方法之一、通过DPPH自由基与抗氧化物发生反应，使DPPH自由基得以还原为无色溶液，测定溶液的吸光度来评估抗氧化活性。
1.2.ABTS自由基法该方法通过生成具有特定吸光度的ABTS自由基，评估抗氧化物对自由基的清除能力。
与DPPH自由基法相比，ABTS自由基法具有更高的灵敏度和稳定性。
1.3.羟自由基清除法该方法利用特定的化学反应，测定样品对羟自由基的清除能力，评估其抗氧化活性。
该方法适用于抗氧化物活性测定和体外抗氧化活性评价。
1.4.过氧化物清除法该方法测定样品对过氧化物的清除能力，通过测定生成的不稳定的自由基产物的分解速率，评估抗氧化活性。
该方法适用于测定生物样品的抗氧化活性。
二、生物法2.1.脂质过氧化抑制能力测定法该方法通过测定样品对脂质过氧化的抑制能力，评估其抗氧化活性。
常用的指标包括丙二醛生成量、硫代巴比妥酸反应物（TBA）生成量等。
2.2.DNA损伤保护能力测定法该方法通过测定样品对DNA损伤的保护能力，评估其抗氧化活性。
常用的指标包括DNA链断裂率、碱基损伤率等。
2.3.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定法该方法测定样品中SOD的活性，评估其清除超氧自由基的能力。
常用的指标包括抑制率、相对酶活等。
2.4.过氧化氢酶（CAT）活性测定法该方法测定样品中CAT的活性，评估其清除过氧化氢的能力。
常用的指标包括催化剂浓度、酶单位等。
三、物理法3.1.相对电子自旋共振法该方法通过测定样品中的自由基产物的电子自旋共振信号的强度，评估抗氧化物的活性。
常用的指标包括g值、线宽等。
3.2.高温氧化法该方法利用样品在高温条件下的氧化反应，评估其抗氧化活性。
抗氧化剂测定方法的分类
抗氧化剂测定方法的分类抗氧化剂是一类能够延缓或抑制自由基反应的物质，可以有效保护人体免受氧化损伤。
目前，针对抗氧化剂的测定方法主要可以分为化学法、生物学法和物理学法三大类。
下面将对这三类方法进行详细介绍。
一、化学法1.化学分析法：通过化学反应或反应产物的测定来确定抗氧化剂的含量。
常用的化学测定方法包括铁还原能力测定法、嗜氧性猝灭活性测定法、总酚测定法等。
这些方法的基本原理是抗氧化剂与氧化剂发生反应，通过反应后的色变、电流变化或物质的生成来测定抗氧化剂的含量。
2. 高效液相色谱法（HPLC）：是一种利用不同的色谱柱和溶剂系统来分离和测定抗氧化剂的含量的方法。
通常采用紫外-可见光（UV-Vis）检测器进行定量分析，根据抗氧化剂在特定条件下的色谱峰进行定量测定。
3.气相色谱法（GC）：是一种将样品中的抗氧化剂挥发成气态，然后通过气相色谱柱进行分离和测定的方法。
通常需要将样品预处理成蒸馏、萃取或衍生化产物，然后再进行气相色谱分析。
常用的检测器有质谱检测器、火焰离子化检测器等。
二、生物学法1.抗氧化酶活性测定法：通过检测抗氧化酶（如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等）的活性来间接测定抗氧化剂的含量。
这种方法的优势在于能够直接反映生物体内的抗氧化反应，但同时也受到许多因素的干扰，如样品的处理、温度、PH值等。
2.活性氧自由基测定法：通过检测氧自由基的产生或消失来测定抗氧化剂的活性。
常用的方法包括二苯基胺试验法、邻苯二酚试验法等。
这种方法的优势在于可以直接测定抗氧化剂对活性氧自由基的清除能力，但需要较为复杂的实验操作。
三、物理学法1.电化学法：通过利用电流和电势的变化来测定抗氧化剂的含量和活性。
常用的电化学方法包括循环伏安法、计时安培法等。
这种方法的优势在于测定灵敏度高、实时性强，但需要较为复杂的仪器和操作。
2.荧光分析法：通过测定样品中发生的荧光自发射和荧光猝灭现象来测定抗氧化剂的含量和活性。
常用的方法有荧光共振能量转移法、荧光强度比较法等。
抗氧化活性测定方法
抗氧化活性测定方法抗氧化活性测定方法在食品、药物、化妆品以及生物学研究中具有重要的应用价值。
抗氧化活性是指物质对自由基的清除能力，其测定方法可以评估物质的抗氧化性能和保护细胞免受氧化损伤的能力。
本文将介绍一些常用的抗氧化活性测定方法。
一、DPPH自由基清除法DPPH自由基清除法是目前应用最广泛的抗氧化活性测定方法之一、该方法基于DPPH自由基的紫色溶液，在受到氧化损伤时会褪色。
通过测定样品对DPPH自由基的清除能力，可以评估其抗氧化活性。
实验步骤：1.准备0.1mM的DPPH溶液。
2.取一定量的样品，加入适量的溶剂溶解。
3.取不同浓度的样品溶液，加入相同量的DPPH溶液。
4.静置反应一定时间后，通过测量溶液的吸光度变化，计算出样品的抗氧化活性。
二、还原能力测定法还原能力测定法是一种常用的抗氧化活性测定方法。
该方法基于物质对氧化剂的还原能力，通过测定还原剂浓度与吸光度之间的关系，评估样品的抗氧化活性。
实验步骤：1.准备一系列不同浓度的还原剂溶液。
2.取一定量的还原剂溶液，加入适量的氧化剂溶液。
3.静置反应一定时间后，通过测量溶液的吸光度变化，计算出还原剂的浓度与吸光度之间的关系。
4.根据吸光度与还原剂浓度的关系，评估样品的抗氧化活性。
三、总抗氧化能力测定法总抗氧化能力测定法是一种综合评估样品抗氧化活性的方法。
该方法基于样品的抗氧化剂含量和抗氧化活性，通过测定样品对氧自由基的清除能力，评估其总抗氧化能力。
实验步骤：1.准备一定浓度的氧自由基溶液。
2.取一定量的样品，加入适量的溶剂溶解。
3.取不同浓度的样品溶液，加入相同量的氧自由基溶液。
4.静置反应一定时间后，通过测量溶液的吸光度变化，计算出样品的抗氧化活性。
以上是常用的抗氧化活性测定方法，还有其他一些方法如ORAC法、TEAC法等也被广泛应用。
不同的方法适用于不同的样品和测定目的，选择适合的方法进行测定可以更准确地评估样品的抗氧化活性。
3种抗氧化活性测定方法
3种抗氧化活性测定方法抗氧化活性测定方法是评估化合物或材料抗氧化性能的一种重要手段。
随着抗氧化活性的研究日益深入，目前已经发展出很多种测定方法。
以下将介绍三种常用的抗氧化活性测定方法：DPPH自由基清除法、Fe2+/Fe3+还原能力法和ABTS自由基清除法。
1.DPPH自由基清除法：DPPH（2,2-二苯基-1-苦味肼）是一种紫色的自由基，常用于评估化合物或材料的抗氧化活性。
该方法基于DPPH自由基与抗氧化物质发生反应后，颜色由紫色变为淡黄色或无色。
测定方法简单，操作方便。
其原理是待测样品与DPPH混合后，通过电子或氢的转移反应，DPPH自由基将被清除，溶液颜色由紫色转变为淡黄色。
根据吸光度变化可以计算出自由基清除率，进而评估抗氧化活性。
2.Fe2+/Fe3+还原能力法：该方法基于还原能力测定抗氧化物质对Fe3+离子的还原能力。
常用的试剂是FeCl3溶液和TPTZ（2,4,6-三聚吡啶甲酸）、酸性pH缓冲液。
其原理是待测样品能够还原Fe3+离子为Fe2+离子，Fe2+离子与TPTZ反应生成有颜色的络合物，通过分光光度计测定络合物的吸光度变化，进而计算出还原能力。
较高的吸光度变化表示较高的抗氧化活性。
3.ABTS自由基清除法：ABTS（2,2'-联氨基双(3-乙基苯并噻唑啉-6磺酸)）自由基是一种蓝绿色自由基，其浓度在紫外可见光区域有最大吸收。
该方法基于ABTS自由基清除率来评估抗氧化物质的抗氧化活性。
该方法较DPPH法和还原能力法更为灵敏。
其原理是待测样品与ABTS自由基反应后，ABTS自由基将被清除，溶液颜色由蓝绿色变为无色或浅黄色。
通过测定吸光度的变化，可以计算出自由基清除率，进而评估抗氧化活性。
除了上述常用的抗氧化活性测定方法外，还有很多其它方法也被广泛应用于抗氧化活性的评估，如氧化还原测定法、Fenton反应法、还原剂抑制能力法等。
每一种测定方法都有其独特的原理和适用范围，研究人员可以根据具体的研究目的和样品性质选择合适的测定方法。
抗氧化物活性测定方法总结
抗氧化物活性测定方法（倾向于考虑DPPH法和ORAC法）1.FRAP法:铁离子还原抗氧化能力测定法[1]FRAP(ferric ion reducing antioxidant power)方法，在低pH值的溶液中，Fe3+-TPTz(Fe3+-三吡啶三嗪)被抗氧化剂还原成有色的Fe2+-TPTZ。
反应的结果常以Fe2+当量或标准物质的抗氧化能力表示。
该法快速简便、易于操作、重复性好，但FRAP反应属于电子转移(SET)反应，因此FRAP方法不能够测定氢转移反应(HAT)起作用的物质。
而且该法实际测定的是待测生物活性物质将Fe3+还原为Fe2+的能力，因此没有抗氧化能力的生物学相关性。
2.TEAC法(trolox equivalent antioxidant capacity)ABTS(2,2'-amino-di(2-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt,2,2'氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐)与过氧化物酶和氢过氧化物在一起形成ABTS+阳离子自由基。
在抗氧化剂存在时，这种自由基混合物的光吸收值下降，下降程度取决于抗氧化剂的抗氧化能力，测得的结果以TEAC表示，即被测抗氧化剂清除ABTS·+的能力(吸光度大小的变化)与标准抗氧化剂trolox(VE的水溶性类似物)清除ABTS·+的能力的比值。
TEAC法十分简单，适用于大量样品的分析检测。
但是，ABTS·+并非生理自由基，缺乏生理相关性，而且与FRAP方法相似，ABTS·+与不同抗氧化剂问的氧化反应时间不同，因此，只能定性不能定量评价样品的抗氧化能力。
3.DPPH法[2，3](2，2-diphenyt-l-picrylhydrazyl radical scavenging capacity)DPPH·(二苯代苦味肼基自由基)法是较常用的方法之一。
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1.抗氧化剂是指在低浓度下能有效延缓或阻止底物氧化的物质。
被氧化的底物包括蛋白质、脂质、糖和DNA。
2.初始型抗氧化剂(AH)可通过与脂质自由基L.、过氧自由基LOO.或烷氧自由基LO.反应抑制脂质氧化链反应。
L.+ AH--- LH + A.LOO.+ AH--- LOOH + A.LO.+ AH--- LOH + A.抗氧化剂自由基A.也能与过氧自由基、烷氧自由基反应从而终止脂质氧化反应。
LOO.+ A.---LOOALO.+ A.---LOA次级型抗氧化剂可通过各种机理延缓脂质氧化,如螯合过渡金属、给初始型抗氧化剂补充氢、清除氧以及使活性物质失活等。
抗氧化剂的活性分为在生物体外(如食品中)的活性和在生物体内的活性。
本文综述了体外测定抗氧化剂抗氧化活性的方法,不包括在生物体中测定生物活性的方法。
3.评价或表征抗氧化活性的方法为了说明在特定条件下被测物抑制底物氧化的效力或清除自由基的能力实际测定时至少要说明在测试条件下被测物是抗氧化剂还是促氧化剂;在指定浓度下比较不同测试材料(如被测物与标准抗氧化剂或添加有被测物的测试体系与空白体系)对底物的作用。
评价或表征抗氧化活性的方法有:(1)在指定的时间测量氧化产物或官能团的浓度或吸光度值;( 2)测量反应的速率;( 3)测量诱导期(延滞期)或氧化达到一定程度所需的时间;( 4)测量速度的积分(即动力学曲线下的面积) ;( 5)测量被测物产生与标准抗氧化剂相当作用的浓度。
4.参数4.1诱导期( induction period)诱导期tIND(也叫延滞期, lag period)常定义为化学反应的速度。
诱导期是一个相当不确定的值,受检测方法、使用仪器的灵敏性以及一些其他因素的影响。
对于脂质氧化,诱导期通常是指链增长阶段动力学曲线的切线和时间轴的交点。
4.2抑制率( percentag e of inhibition)和IC50抑制率和IC50 (抗氧化剂提供50%抑制作用时的浓度,也可用EC50表示的)常用来表征抗氧化能力。
它们不仅与被测抗氧化剂的反应性能和氧化的底物有关,而且受其他因素的影响,如脂质氧化链反应的长度和抑制速率等。
此外,用IC50表征抗氧化剂的活性与比较活性的时间点有关。
只有在其他参数相同的情况下,在某一研究中测得的抑制率和IC50才可以与另一研究中测得的值进行直接比较。
TEC50是指抗氧化剂提供50%抑制作用所需的时间,也常用来表征抗氧化活性5.对测定方法的要求测定抗氧化剂抗氧化活性的方法应满足如下要求:( 1)能说明测试体系中发生的反应,并能用明确的动力学图解描述;( 2)测试要有再现性;( 3)测试效率要足够高;( 4)方法要相对简单;( 5)能连续检测;( 6)应使用与体内或食品有关的活性自由基;( 7)分析中被测物的浓度在食品中或在生物体内能够得到;( 8)除了适合纯溶液外,还适合复杂生物组织和天然产物的测定;( 9)水溶性的和脂溶性的化合物都适用。
6.测定抗氧化活性的方法大多数方法涉及到直接或间接测量:( 1)底物或标记底物或氧消耗的衰减, ( 2)氧化产物的生成, ( 3)特征自由基的形成或衰减的速度或程度。
在( 1)和( 2)中,抗氧化活性是以对反应物的消耗或生成物的形成的程度或速率来表征抗氧化活性的; ( 3)是假设通过捕获脂质自动氧化中的自由基抑制氧化的,因此集中在检测被测抗氧化剂对自由基的捕获或抑制自由基的形成的能力上,而不是检测实际发生的氧化反应,如ABTS法和DPPH 法。
6.1以抗氧化剂抑制脂质氧化为基础的方法脂质中的不饱和脂肪酸自动氧化,生成不稳定的氢过氧化物,氢过氧化物继续分解形成短碳链的醛、酮、酸等小分子化合物。
抗氧化剂的加入可以延缓氢过氧化物及其分解产物的形成,由此可测得抗氧化活性。
由于氧化的底物、引发或加速氧化的方法以及脂质氧化检测方法的不同,该法又可分为以下几种情况。
6.1.1氧化的底物或使用的体系以抗氧化剂抑制脂质氧化为基础的测量抗氧化活性的方法经常使用。
常使用纯的甘油三酸酯、植物油(红花油、葵花油、大豆油、橄榄油等)、鱼油或猪油作为氧化反应的底物,也使用磷脂或脂蛋白作为底物。
为了得到重复性的结果,选择底物时应优先考虑单一的物质,如亚油酸或亚油酸甲酯底物中含有的抗氧化剂(如植物油中常含有VE)也能参与测试过程,干扰测定。
但是实际测定中常使用植物油等脂质混合物,因为它们是与真实食品有关的脂质成分。
实际操作中应根据具体的测试方法选择合适的底物和测试体系。
6.1.2引发或加速氧化的方法各种加速氧化的方法,如烘箱法、活性氧法、Rancimat 法、OSI 法。
这些方法是通过升温或增加氧浓度加速氧化的。
自由基引发剂加速脂质氧化,常用热不稳定的偶氮化合物作为引发剂,最典型的是水溶性的AAPH和脂溶性的AMVN。
除此之外,还有水溶性的ABAP、ABIP和脂溶性的ADVN、AIBN等,也有用DBHN的上述偶氮化合物在适当的温度下能以需要的速度分解,生成活性自由基。
由于温度容易改变和保持,因此引发速率容易控制。
上述引发剂的优点是自由基的生成速度与引发剂的浓度成比例,与测试体系中的其他成分无关但是,用自由基引发剂加速反应时抗氧化剂的抗氧化能力主要体现在供氢的速度上,没有考虑抗氧化剂自身生成的自由基的作用,而有些抗氧化剂被氧化后的产物也能参与抑制作用,对抗氧化活性有一定影响。
在食品体系和生物体系中还普遍使用过渡金属或过渡金属的氧化还原反应引发氧化,如Fe2+和Cu2+、Fe3+/抗坏血酸等。
但是这些体系中的一些成分(如抗坏血酸)能与自由基反应,干扰测定结果。
而且使用含有过渡金属的体系不能将不同于初始型抗氧化剂的抑制机理(如螯合作用)区别开。
也有用光照或紫外光来加速氧化的,但是光引发脂质氧化可能引起氧化机理的改变,因此这种方法不常用。
6.1.3脂质氧化的检测在化学方法中,过氧化值、碘值、游离脂肪酸的含量(酸值)、TBARS 法、羰基化合物、克雷斯试验和茴香胺值已被广泛采用。
至于物理方法,如粘度、颜色、共轭二烯含量、红外光谱、折光指数、介电常数和气相色谱法、液相色谱法、气相色谱和质谱联用等已用于油脂氧化的测定。
此外,不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比率( C18: 2/C16: 0)、聚合物的含量、极性脂类的含量也可用于检测脂质的氧化程度。
除上述方法外,测量体系中氧的减少造成压力变化的氧压法,测量氧消耗的氧电极法,测量底物中不饱和脂肪酸的减少以及氧化后底物的增重等方法也常用于检测脂质的氧化。
6.1.3.1脂质氧化初期产物的检测( 1)过氧化值( perox ide value, PV )法。
过氧化值是测量脂质氧化最常用的方法,反映了脂质和含脂原料中氢过氧化物和脂质过氧化物的总含量。
测量PV 的方法有很多,但其原理均系碘化氢还原此法是根据脂质氧化生成的氢过氧化物ROOH 和过氧化物ROOR 能将碘离子氧化成碘分子进行测定的,原理如下:ROOH + 2H+ + 2I- ---I2+ ROH + H2OROOR + 2H+ + 2I- ---I2+ 2ROHI2+ 2S2O3 --- S4O62- + 2I2此法灵敏度低,选择性差。
碘化氢易被氧化,还极易与碳碳双键加成,而且生成的碘也能与不饱和双键加成,使测得的结果偏低。
此外,样品的量、溶剂、反应条件(如时间、温度)和滴定速度的不同都会造成误差。
( 2)共轭二烯氢过氧化物法。
共轭二烯作为测量脂质氧化的一种简单的方法和有用的指标已普遍用于样品抗氧化活性的测定。
共轭二烯的量可通过在某一时间的吸光值计算。
此法适合纯脂质体系中脂质氧化的研究。
由于组织样品和生物体液含有许多在紫外光区有强吸收的物质(如血红蛋白、叶绿素、嘌呤和嘧啶等)干扰测定,所以一般不能直接测量其共轭二烯。
这可以通过在分析前用有机溶剂将脂质提取出来加以解决。
脂质中的脂肪酸在紫外区也有吸收,对测定结果也有一定的影响。
此外,共轭二烯不稳定,在生成的同时也会分解,因此共轭二烯的量反映的只是氧化早期阶段脂质氧化的程度。
该法不适合测量饱和脂肪酸含量高的油,如棕榈油。
( 3)硫氰酸铁( ferric thiocyanate method, FTC)法。
此法是根据脂质氧化产生的过氧化物将Fe2+氧化成Fe3+ , Fe3+与硫氰酸铵反应,生成的硫氰酸铁在500 nm处有强吸收,通过500 nm吸光度的变化可测得过氧化物的含量。
6.1.3.2脂质氧化终产物的检测脂质氧化初期产物不稳定,可分解生成醛(如己醛)、酮(如丁酮、戊酮、辛酮)、酸和烃类等小分子物质,这些氧化的终产物也用于脂质氧化的检测,TBARS法是目前使用最普遍的方法。
但是脂质氧化形成的丙二醛并不多,绝大多数与TBA 结合的丙二醛是在酸性条件加热时由过氧化物分解生成的。
而且TBA还可以和氧化的蛋白质,核酸等反应生成和TBA-丙二醛反应物类似的红色物质, 532~ 535nm处的吸收包括了这些物质的贡献。
用荧光法可以避免这一点。
测量前,用HPLC 分离产物也可以减少误差。
脂质氧化终产物中还含有戊烷、己烷、己醛等烃类气体,这些气体可以用气相色谱检测。
通过某一小分子气体的量的变化,可反映脂质氧化程度,通常以己醛为检测指标。
该法准确,重复性好。
测量脂质氧化的方法很多,以过氧化值、共轭二烯、TBARS 法和顶空气相色谱法最为常用6.2清除自由基的方法6.2.1ABTSxxABTS(波长max= 342nm)可被K2S2O8、MnO2、ABAP和H2O2等各种试剂氧化,生成蓝绿色的自由基阳离子ABTS.+。
ABTS.+相当稳定,在414、645、734和805nm处有最大吸收峰。
在有供氢能力的抗氧化剂(如酚类物质)存在下, ABTS.+与之反应,变成没有颜色的ABTS。
抗氧化剂清除ABTS.+的能力可用414或734nm处吸光度的变化测量。
测得的结果以TEAC (当量抗氧化能力)表示,即被测抗氧化剂清除ABTS.+的能力(吸光度大小的变化)与标准抗氧化剂trolox ( VE 的水溶性类似物)清除ABTS.+的能力的比值。
trolox的TEAC 值是1。
Miller 等人提出的ABT S 法中,ABTS.+是由ABTS 与铁肌红蛋白自由基( ferryl myoglobin)反应生成的,而铁肌红蛋白自由基由高铁肌红蛋白( metamyoglobin)和H2O2反应生成。
在这种方法中,被测物是在H2O2引发生成ABT S.+前加入的,抗氧化剂也能和铁肌红蛋白自由基反应,造成TEAC 值被高估。
根据ABTS.+的生成方法和参比抗氧化剂的不同,提出了几种改进的ABTS 法,在这些方法中ABTS.+都是在添加被测试样前生成的,避免了干扰ABTS 法广泛用于评价抗氧化剂清除自由基的能力。