试验九孚尔根Feulgen核反应染色法
实验7 细胞化学——鉴定DNA的Feulgen反应
实验7 细胞内核酸的原位显示和染色方法核酸是细胞中的重要组分，主要包括DNA和RNA。
DNA是遗传信息的载体，主要存在于细胞核中；RNA传递DNA的遗传信息，指导细胞合成各种蛋白质。
核酸的细胞化学研究已有近一个世纪的历史，1924年Feulgen和Rossenbeck于1924年创立显示DNA的特异性反应，1940年Brachet发明了甲基绿一派洛宁染色方法用以区别细胞中的DNA和RNA。
这些经典方法目前仍被广泛应用，并得到不断改进和发展。
研究细胞中核酸的含量及其动态变化，对于理解生长、发育、分化及凋亡等生物学基本问题具有重要的价值。
孚尔根反应(Feulgen reaction)是特异性显示DNA的最经典方法，得到了非常广泛的应用。
其原理是DNA经过稀盐酸水解后的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，脱氧核糖的C 端形成游离的醛基。
游离的醛基再同Schiff试剂的无色品红反应形成紫红色化合物，使细胞内含有DNA的部位呈现紫红色阳性反应。
甲基绿和派洛宁是2种碱性染色料，二者分别属于三芳基甲烷和氧杂蒽衍生物，与酸性的核酸具有亲和力，可以形成盐键而呈现出特殊的颜色反应。
在pH4.6时甲基绿与派洛宁跟核酸发生竞争性结合。
甲基绿分子具有2个正电荷，与聚合程度高的DNA具有较强的亲和力，与DNA双螺旋外侧的磷酸根基团结合从而阻止派洛宁从碱基之间插入，甲基绿与DNA的结合产物呈绿色；派洛宁只有1个正电荷，与低聚分子RNA具有较强的亲和力，中和RNA的磷酸基团，阻止甲基绿染色，派洛宁与RNA的结合物呈红色。
根据颜色的部位可以判断DNA和RNA的定位并且判断两种核酸的相对含量。
这一反应对pH敏感，脱水过程、染料的纯度和染料的结合力都影响到染色效果。
【实验目的】学习DNA的Feulgen染色方法，并了解Feulgen反应原理及其DNA在细胞中的分布。
掌握甲基绿-派洛宁法（methyl green-pyronin method）并了解DNA和RNA在细胞中的分布。
Feulgen反应
5．水洗5min。
6．将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖玻片，压片（洋葱表皮可省去压片这一步）。
7．显微镜检查。
结果：细胞中凡有DNA的部位应呈现紫红色的阳性反应（见图2－3）。
对照片：
方法一先将材料放在5%三氯醋酸中90℃水浴15min，主要把DNA抽提掉，然后按步骤1—7制片观察。
方法二材料不经1N HCl水解，直接放在Schiff试剂中染色，然后按步骤4—7制片观察。结果（见图2－4）
但在上述固定剂中，以OsO4和Carnoy效果较好，OsO4(1%或0.5%)是Feulgen反应的理想固定剂，只是因OsO4价钱较贵，故一般多采用Carnoy固定液。在Feulgen反应中，不能单独使用Bouin定液，因为它是Feulgen反应的最坏固定剂，但经Aller改进后的Bouin-Aller固定液效果却较好。
Feulgen反应原理
实验仪器、材料及试剂
（一）仪器、用具
显微镜、恒温水浴箱、温度计、解剖针、酒精灯、试管、烧杯、载玻片、盖玻片、吸水纸。
（二）材料
洋葱鳞茎（见图2－1）或根尖（见图2－2）
核酸的细胞化学
H2SO3
副品红碱:N-亚磺 副品红碱 亚磺 酸亚硫酸(无色透 酸亚硫酸 无色透 明)
醛基
醌型结构 (紫红色 紫红色) 紫红色
思考题
1.如何制作Feulgen反应 的对照片,要求写清 1.如何制作Feulgen反应 的对照片, 实验原理,步骤及结论. 实验原理,步骤及结论. 2.不利用做好的石蜡切片是否能够观察到细 2.不利用做好的石蜡切片是否能够观察到细 胞内的DNA？利用何种材料观察？ 胞内的DNA？利用何种材料观察？
核酸的细胞化学
Feulgen反应 Feulgen反应
实验原理
Feulgen反应的机理： Feulgen反应的机理： 利用1N 利用1N HCl 、60℃下水解时，可将 60℃ DNA分子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖 DNA分子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖 苷键打断，使嘌呤脱下，并使去氧核糖C 苷键打断，使嘌呤脱下，并使去氧核糖C-1 位置释放醛基与席夫试剂反应显紫红色。 细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根 细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根 反应，因此利用孚尔根反应，可以鉴定 DNA的存在。并广泛应用于核及染色体的 DNA的存在。并广泛应用于核及染色体的 研究中。
实验步骤
2. e. f. g. h. i. j. 染色 蒸馏水稍洗； 放入Schiff试剂，室温1h左右； 放入Schiff试剂，室温1h左右； 亚硫酸盐溶液洗3次，总时间6min； 亚硫酸盐溶液洗3次，总时间6min； 流水洗5min； 流水洗5min； 蒸馏水洗片刻； 经70％、80％、90％、95％ 乙醇脱水2-3min； 70％、80％、90％、95％ 乙醇脱水2 3min；
实验步骤
k. 如需要复染，可用1％的亮绿乙醇 溶液复 如需要复染，可用1 染数秒钟（注意切勿染的过深）； l. 95％乙醇浸泡1min； 95％乙醇浸泡1min； m. 无水乙醇浸泡两次，每次3-5min； 无水乙醇浸泡两次，每次3 5min； n. 纯乙醇与二甲苯等量混合液5min； 纯乙醇与二甲苯等量混合液5min； o. 二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5min； 二甲苯Ⅰ 5min； p. 中性树胶封藏
大学课程遗传学实验实验四 孚尔根(Feulgen)核染色课件
1N HCl 60℃
酸解使DNA醛基暴露
醛基与Schiff试剂发生显色反应
孚尔根核染色法是Feulgen和Rossonbek于1924 年提出的鉴定细胞中DNA的组织化学方法。其 优点是制片清洁、染色体清晰、组织软化好， 易于压片。但对小型染色体（如玉米、水稻） 效果较差。在切片、涂片上研究核和染色体时， 能减少细胞质着色对观察的影响。在细胞学研 究中普遍采用
材料：大蒜根尖、洋葱根尖
1mol/L 盐酸(常温和60℃) Schiff试剂 45%醋酸或亮绿
实验步骤
预处理的目的及方法
目的：改变细胞质粘度，破坏和抑制纺锤体 的形成，使染色体适度缩短和分散。
方法： 0.04-0.2%秋水仙素溶液2-4小时。 对二氯苯饱和溶液3-5小时。 0.002M (或0.03%)8-羟基喹啉1.5-2小时以
黑暗条件下染色。 要保证细胞呈单层，使染色体在一个平面上，
根尖的切片尽量要薄，压片必须用力适度，压 片的实验台面要平坦。
实验作业
绘制你所观察到的图象，并说明是有丝 分裂的哪一个时期，并注明放大倍数。
前期、中期、后期、末期
思考题
为什么要严格掌握DNA的水解条件？ 为什么实验材料从60℃盐酸中倒出后，
实验原理
有丝分裂是体细胞分裂的主要方式，在植物根尖或茎尖的 分生组织中可清晰观察。在有丝分裂时，细胞核与细胞质有很 大的变化，但以细胞核内染色体的变化最为明显，而且是有规 律地进行。各种生物染色体在数目上和形态上是相对恒定的， 并随科属种的不同而具有一定的特征。大蒜体细胞中有8对共 16条染色体，在有丝分裂过程中，每个染色体能复制一份， 然后分配到两个子细胞中，所以两个子细胞与母细胞所含的染 色体在数目、形态和性质上都是相同的。在细胞遗传学研究中， 人们常常需要了解某一物种的染色体数目，而最有效的方法就 是观察细胞有丝分裂的中期，这样能得到较为准确的结果。
DNA的Feulgen染色法
实验结果
实用文档
附录：植物细胞分裂的几个时期。 细胞周期分为间期及分裂期，按照有 无核膜，核仁、染色体，以及染色体 形态与分布位置的变化，细胞有丝分 裂又分为前期、中期、后期和末期四 个阶段。现将各期特点简述如下， （1）前期：此期的染色质螺旋盘绕 成一定数目的细而长的染色丝，此即 染色体。染色体先是分散于核液中， 以后，逐渐向核膜移动，在此时，核 仁逐渐消失，核膜溶解。 （2）中期：染色体进一步盘绕，变 短变粗，在细胞的中央（即赤道板） 规则地排列成行，仔细观察，可看到 染色体两侧的纺锤丝。
实用文档
二、实验原理
DNA经弱酸（1mol/LHCL）水解， 其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的 键打开，使脱氧核糖的一端形成 游离的醛基，这些醛基在原位与 Schiff试剂（无色品红亚硫酸溶 液）反应，形成紫红色的化合物 ，使细胞内含有DNA的部位呈紫红 色阳性反应。
紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基 是一个发色团，所以具有颜色。对照组预先用热三氯醋酸 或DNA酶处理，抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应，从而 证明了Feulgen反应的专一性。
（四）压片法 取一根尖置于载玻片上，用切下生长 区部位（染成紫红色），加盖玻片，用拇指或铅 笔的橡皮头轻压使细胞分散均匀，镜检。 （五）对照组预先用5%三氯醋酸（90℃）处理 15min，然后再依次进行实验步骤（二） （三） （四）。
实用文档
染色后倒出Schiff试剂，亚硫酸水漂洗2～3次 ，每次3~5min，自来水漂洗干净，盖上盖玻片 。
1. 材料 Carnoy液固定的洋葱根尖 2. 实验器材 显微镜、恒温水浴锅、镊子、解剖针、剪刀、 载玻片、盖玻片、吸水纸、青霉素瓶、吸管、 烧杯、量筒。
实用文档
五、实验方法和步骤
孚尔根染色
孚尔根染色法中Schiff试剂配方的研究一、实验目的1、进一步深入了解孚尔根染色的基本原理2、探究尝试用非传统的方法配置Schiff试剂并观察其染色效果二、实验原理DNA是遗传的物质基础，应用Feulgen反应法显示细胞DNA是常用的组化染色技术，其中Sehitt试剂是染色成败的关键因素。
Sehiit试剂(希夫试剂)，又称品红醛试剂，与醛类反应呈紫红色。
它有多种不同的配制方法，归结起来有经典热配法以及冷配法。
实验室经常采用的热配法，配制过程繁琐，常会因一个步骤的偏差而造成配制失败，实验中尝试改用冷配法，可收到与热配法同样的染色效果。
Schiff试剂的主要成分是碱性品红，属三氨基三苯甲烷类，它由副品红、品红、二号碱性品红组成四。
碱性品红在酸性环境下与亚硫酸盐作用，生成无色品红。
其配制方法有2种：热配法(将碱性品红加热煮沸)是通过热效应来加速分子运动，使染料溶解与脱色；冷配法(室温下采用振荡或搅拌的方法)是通过增加分子间的碰撞，促进染料溶解与脱色。
2种方法的反应机制相同。
三、实验器材实验材料：蚕豆根尖实验器具：显微镜、载玻片、盖玻片、电炉、滤纸、烧杯、纱布、量筒、锥形瓶、标签、刀片、容量瓶实验药品：蒸馏水、卡诺氏液、0.1mol/L的盐酸、碱性品红、盐酸、偏重亚硫酸钠、活性炭。
四、实验方法1.浸种催芽选择无虫、饱满、大小均匀的蚕豆种子50粒放入蒸馏水的烧杯中， 25℃浸泡24h,其中换水1次。
种子吸胀后，在培养皿中铺一层脱脂棉，倒入足量的蒸馏水，将种子置于其中25 ℃培养2至3天，期间随时补充水分，大部分初生根长至1～2cm左右。
2.不同试剂配置1. 热配法（常规法）称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中（用三角瓶），时时振荡，继续煮5min（勿使之沸腾），充分溶解。
然后冷却致50℃时用滤纸过滤，滤液中加入10ml1mol/L HCl，冷却致25℃时，加入0.5g偏重硫酸钠，充分振荡后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24h（有时需要2至3天），使其颜色退至淡黄，然后加入0.5g 活性碳，用力振荡一分钟，最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封瓶塞，外包黑纸。
Feulgen染色法-中国试剂网
有丝分裂（Feulgen染色法）一、实验原理：细胞中的DNA受1NHC1，60℃水解作用以后，核酸中的嘌呤碱很快完全被除掉，使脱氧核糖中潜在的醛基获得自由状态。
水解后，组织要经水洗再移至希夫（Schiff）试剂中，希夫试剂即同露出来的醛基发生反应，呈现紫红色。
这个反应是Feulgen在1942年提出来的，是DNA的一个特异性检查法。
水解的时间很重要，因为核酸的水解有两个过程，第一，漂呤碱很快被除掉，脱氧核糖中潜在的醛基显露出来，第二，组蛋白和核酸愈来愈多地被除掉。
在短时间的水解作用以后，第一个过程占优势，这时候用希夫试剂染色，染色体的染色作用最强。
随着水解作用的继续进行，第二个过程逐渐变成优势，因此水解液中的希夫反应增强，而染色体中的希夫应减弱。
最后，第二个过程超过第一过程时，染色体也随之停止反应。
希夫试剂是碱性品红———亚硫酸溶液，呈无色。
与DNA醛基反应后，使碱性品红恢复原来的红色。
二、实验目的：观察蚕豆根尖细胞或其它根尖细胞内染色体中的DNA，以及染色体在有丝分裂中的行为，掌握Feulgen染色方法。
三、实验材料：上次实验制成了石蜡切片。
四、实验准备：1．用具立式染色缸一套，镊子，盖玻片，小漏斗，铁架，毛边纸，玻璃棒，显微镜，恒温水浴锅，温度计，烧杯，棕色瓶，黑纸。
2．玻璃器皿的清洗主要是染色缸的清洗，一般用肥皂粉洗，用水冲净即可，如不能洗净时，要用洗液浸泡后，再冲洗，自来水洗后，再用少量蒸馏水过洗一次。
盛放100%酒精、二甲苯的染色缸必须干燥，缸盖内缘必须涂以几士林，以防止蒸发和收水分，影响浓度。
染色缸上要贴上标签。
3．实验所需药口及配制浓盐酸（36—38%），碱性品红，偏重亚硫酸钠（Na2S2O5）;亚硫酸钠（Na2SO3）,固绿（fast green），加拿大中性树胶乙醇（30—100%），二甲苯。
药品配制：1各种浓度的乙醇配制.21NHCI配制：取浓HCI 82.5毫升加蒸馏水至1000毫升，摇匀。
实验02 孚尔根核反应染色法
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有丝分裂各时期
中期 ——极面
后期
末期
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子细胞
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有丝分裂各时期
苏州大学 生命科学学院
20
六、注意事项
1. 水解时间和温度是实验的关键因素；
2. Schiff试剂中SO2的含量影响孚尔根反应的 颜色表现；
3. 压片技术是视野观察清晰与否的关键；
4. 材料的不同（DNA含量的不同），是影响 显色反应强度的根本因素；
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五、实验步骤
材料
培养的植物根尖长到2cm左右时，切下；或取幼小 花药或叶表皮或愈伤组织，或动物组织，或果蝇唾 腺等材料。
固定
将取出的材料放入新配制的Carrnoy固定液（无水 乙醇:冰醋酸=3:1）处理2~24hr→95%乙醇洗2次， 每次10min→80%乙醇洗1次，10min→70%乙醇， 冰箱保存。
染色30min~4h； 漂洗液漂洗2~3次，每次2~5min，待用。
五、实验步骤
以下各人独立完成： 将根尖置载玻片上，切取适当部位； 加45%醋酸洋红1滴； 压片； 镜检； 作图（实验报告）。
有丝分裂各时期
苏州大学 生命科学学院
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有丝分裂各时期
间期
前期
中期 ——侧面
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实验二 孚尔根核反应染色法
苏州大学 生命科学学院
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一、实验目的
1. 学习和了解孚尔根（Feulgen）反应的原理； 2. 掌握对植物组织及细胞中鉴别DNA分布的 孚尔根反应染色方法； 3. 掌握压片方法； 4. 了解制作玻片标本的方法； 5. 观察细胞中DNA的分布。
苏州大学 生命科学学院
Schiff试剂中的无色亚硫酸品红分子与活性醛 基反应而呈现为紫红色化合物。该产物能特异 地吸收峰值为550~570nm的光波。并在一定的 浓度范围内，在550~570nm光波的吸收值与 DNA含量成正比，即符合化学计量学关系。