微核实验-毒理学-洋葱根尖染色体观察

微核试验摘要：利用大蒜根尖细胞微核染色与计数技术测定不同浓度6价铬和1.2,4-三氯苯以及它们的不同浓度混合液对大蒜根尖分生区细胞微核率和细胞分裂各期的影响。

以蒸馏水为对照组，设置的实验组为3组不同浓度的6价铬和三氯苯以及它们的混合液。

用孚尔根染液法对不同试剂及各浓度的处理的根尖进行染色。

在显微镜下观察各试剂各浓度处理下的微核率以及不同分裂期细胞的比例。

关键字：孚尔根染色法、微核、微核率、分裂期细胞Abstract:Use of garlic root tip cell micronucleus dyeing and counting technology . Different concentrations of chromium 6 and 1,2, 4 - t hree hlorobenzene as well as their different concentration mixture to garlic root tip meristematic cells in the areas of micronucleus rate and the influence of each stage of cell division.With distilled water as control group, the group set up for the three groups of different concentrations of chromium 6 and 3 chlorobenzene and their efu's root dye solution for different reagent and the concentration of the treatment of root tip for dyeing. Under the microscope to observe the reagent concentration under the treatment of micronucleus rate and different proportion of split phase cellsKey Words：Fu's root staining method、micronucleus、Micronucleus rate、Split phase cells一、研究的目的与意义：1：知道微核产生的原理。

2：学会识别微核以及计算微核率。

3：学用微核试验来评价药物、放射线、有毒物质等对人体细胞或体外培养细胞遗传学损伤。

4：了解不同化学试剂对细胞各个分裂期的影响。

由于大量新的化合物的合成，原子能应用，各种各样工业废物的排出，使人们很需要有一套高度灵敏，技术简单的测试系统来监视环境的变化。

真核测试系统能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害。

利用微核实验这种遗传毒性试验方法可以检测检测染色体或者有丝分裂器损伤，计数细胞的微核率。

检测已存在或潜在的危害。

二、研究进展微核( micronucleus, 简称MCN) , 是真核生物细胞中的一种异常结构, 是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。

一般认为, 微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体片断产生的。

在细胞有丝分裂时, 受到有害理化因子的损伤, 染色体发生断裂, 在下一次分裂后期, 丧失着丝粒的染色体片断行动滞后, 不能进入子细胞的主核, 形成滞留在核外的微小染色质块, 即微核。

有些研究者认为, 微核可以是细胞凋亡的产物, 当致畸因素导致凋亡基因激活, 内切酶激活, 切割DNA, 形成细胞核碎片, 最终导致产生许多微核[1]。

微核试验广泛应用于药品、食品添加剂、农药、化妆品、工业化学品、环境污染物等遗传毒性的检测、安全性评价和遗传损害的监测, 为接触有害物质的人群提供遗传损害检测和工作环境监测, 为行政管理部门的决策、立法奠定理论依据。

污染物对人体或生物产生的损害可以方便快速地通过微核检测出来。

蚕豆根尖微核技术作为水污染检测方法, 早在1988 年就被国家环保局批准, 由许多研究表明, 蚕豆根尖微核技术在检测流域或湖泊水污染方面, 有非常好的效果, 有关这方面的研究较多。

氯苯类化合物是一类普遍存在于环境中的有毒有机污染物, 由于其具有致突变、致癌、致畸特征及其在环境中残留持久, 美国国家环保局所列129种优先控制污染物中氯苯类化合物占25种之多[2]。

以未经适当处理的废水、垃圾、废气和废渣排放是向环境释放氯苯类化合物的重要污染源.。

我国该类化合物污染也相当严重, 在沈阳等大城市及其周边地区的土壤及地下水检测浓度均较高。

农作物受到氯苯类化合物污染后, 不仅影响其产量和质量, 更为严重的是氯苯类化合物经食物链进入人体, 并在人体内富集, 危害人体健康。

因此, 研究这些污染物对生态系统可能带来的负面影响及其机理具有重要的理论和现实意义。

研究表明,TCB是细胞膜上Ca2+ 通道的抑制剂, 通过降低细胞质中Ca2+浓度, 阻止微管蛋白聚合而抑制微管的装配, 从而损害纺锤体的形成和功能, 导致染色体被阻止而停留在该分裂时期, 或使染色体不分离而形成多倍化细胞。

结果表明, 随TCB 浓度增加和处理时间延长, 蚕豆幼苗根长的生长及根尖细胞有丝分裂指数降低甚至停止。

TCB 诱发蚕豆根尖细胞有丝分裂过程中染色体数目畸变和结构畸变[3]。

铬以Cr-2 到Cr+6等多种氧化态存在自然中，其中以三价和六价铬最稳定。

铬的价态不一样，毒性也不一样。

在一定的阈值内，三价铬是人和哺乳动物的必需元素，六价铬则有潜在的致癌性。

由于铬的硬度大、抗腐蚀性能强，可与其他金属形成合金，因此，铬被广泛应用于国防、冶金、化学等行业。

这些活动不可避免地导致大量含铬弃物排放，而这些废弃物主要是六价铬化合物，以铬酸根离子［（CrO4）2-］存在，严重污染水、大气和土壤。

据不完全统计，国内受铬严重污的土壤已愈1250万ｔ。

铬污染土壤具有隐蔽性、滞后性、累积性和不可逆转等特性。

进入土壤的铬具有较高的生物有效性，易被植物根系吸收并积累在植物体内，对植物产生严重的生理毒害作用，不仅影响其生长和发育，可通过食链最终影响人类健康。

因此，研究铬污染对生态系统可能带来的负面影响及其作用机制具有重要的理论和实际意义。

研究表明低质量浓度Cr6+促进蚕豆种子萌发，而高质量浓度Cr6+有抑制作用，并且随处理时间的延长，其最适质量浓度降低。

当Cr6+质量浓度≤100㎎/L时，随着质量浓度的增加和处理时间的延长，蚕豆根尖细胞微核率增加。

当Cr6+质量浓度为200㎎/L，处理超过48h后，随着处理时间的延长，其微核率反而下降[4]。

本实验根据前人的实验经验为前提采用大蒜根尖代替蚕豆根尖作为微核试验的材料，研究了不同浓度的1,2,4-三氯苯这一典型氯苯类化合物和不同浓度重铬酸钾溶液以及重铬酸钾和1,2,4-三氯苯的联合作用对大蒜根尖细胞有丝分裂指数及染色体畸变率的影响,旨在探讨铬离子对植物体的细胞毒性和遗传。

三、研究内容与技术路线3.1 研究内容：通过观察不同浓度的1,2,4-三氯苯和铬以及它们的交互作用对大蒜根尖细胞微核率以及不同分裂期细胞的比例的影响，来判断其遗传毒性。

3.2 技术路线：冷冻保存大蒜根尖培养处理24h 剪根固定解离染色制片观察孚尔根染液配制四、实验方法4.1实验材料大蒜、甲醇、冰乙酸、碱性品红、偏重亚硫酸钠、比重1.18的浓盐酸、蒸馏水、酒精、重铬酸钾、氯苯、丙酮、显微镜、载玻片、盖玻片、定性滤纸、烧杯、100毫升容量瓶、200毫升容量瓶、镊子、刀片、纱布、青霉素小瓶、移液管、试管4.2试剂准备：1、1mol/LHCl：用10mL移液管量取8.69mL浓盐酸加入100mL容量瓶，用在蒸馏水定容至100mL。

2、50mg/L、100mg/L、150mg/L Gr6+：称取170mg重铬酸钾，加水溶解，在200mL容量瓶中定容，配制300mg/L的Gr6+母液，然后稀释到50mg/L、100mg/L、150mg/L3、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L 1,2,4-三氯苯：称取将1,2,4-三氯苯用少量丙酮溶解，配制1000mg/L 1,2,4-三氯苯母液，然后将稀释到浓度30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L4、卡诺式固定液：将甲醇：冰乙酸按3:1比例混合配制5、Schiff氏试剂：称取0.5g碱性品红加入到100mL煮沸的蒸馏水中，时时振荡，继续煮5min，使碱性品红充分溶解。

冷却致50℃，用滤纸过滤，滤液中加入10ml1mol/LHCl，冷却致25℃，加入1.5g偏重亚硫酸钠，充分振荡，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24h，用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封瓶塞，外包黑纸。

贮存于冷暗处（4℃冰箱中）备用。

4.3实验过程：4.3.1、材料准备：将大蒜剥皮后放进垫了滤纸的培养基中，加入清水，放进25℃恒温培养箱中2~3天，催化大蒜生根。

选择根长0.5~1cm且不定根生长情况差不多的大蒜分为10组4.3.2、Schiff氏试剂检验：在大蒜生根之后，先选取一些根尖放进卡诺式固定液中固定3个小时，用Schiff氏试剂染色，镜检，观察染色体是否能染上色以及染色效果。

若染色效果不行，则重新配制Schiff氏试剂，直至染色效果良好，然后将其贮存于4℃冰箱中准备使用。

4.3.3、大蒜根尖处理：将分好组的大蒜分别用清水、50mg/L Gr6+、100mg/L Gr6+、150mg/L Gr6+、30 mg/L 1,2,4-三氯苯、40 mg/L 1,2,4-三氯苯、50 mg/L 1,2,4-三氯苯、浓度分别为50mg/L Gr6+和30 mg/L 1,2,4-三氯苯的混合液、100mg/L Gr6+和40 mg/L 1,2,4-三氯苯的混合液、150mg/L Gr6+和50 mg/L 1,2,4-三氯苯的混合液培养24小时。

清水组为对照组。

4.3.4、固定：在早上有丝分裂旺盛的时候，将处理过的大蒜根尖剪下，分别放入青霉素小瓶中，加入卡诺氏固定液固定3个小时，然后放入4℃冰箱内保存，以备使用。

4.3.5、解离：取出部分经过固定的根尖先用酒精和清水洗涤，加入1mol/LHCl覆盖根尖，放入60摄氏度水浴锅内水浴加热7~10分钟，取出用清水洗涤3次，每次5分钟。

4.3.6、染色制片：取出解离后的根尖，放在载玻片上，用刀片切下根尖乳白色的分生区部分，滴加1滴Schiff氏试剂染色10分钟，然后盖上盖玻片，吸干染液，并用镊子钝的一端在盖玻片上轻轻敲击，将细胞打散。

4.3.7、镜检:将制备好的根尖放在显微镜下观察，统计微核数目、以及有丝分裂间期、前期、中期、后期、末期细胞数目并计算有丝分裂指数以及微核率。