分子诊断学期末复习资料.doc
分子诊断学 期末复习资料
1.（一）真核生物基因组：①有细胞核基因组和细胞器基因组之分；②核基因组以线状DNA分子的形式存在于染色质上；③基因多数为断裂基因，有内含子结构和大量重复序列；④单顺反子，基因家族；⑤核基因组由染色体DNA组成，分子量大，结构复杂，与蛋白质结合。
（二）原核生物基因组：①基因组相对较小，通常为一条双链DNA分子②功能相关的基因高度集中，构成操纵子③重复序列少，大多数的蛋白质基因保持单拷贝形式，而RNA基因常是多拷贝④没有内含子，基因是连续的⑤多顺反子，构成转录单位⑥绝大部分DNA都是用于编码蛋白质的，只有很少不编码序列⑦DNA分子中有各种功能区（三）病毒基因组：①只有一种核酸，4种类型，为双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA ②核酸大小差别较大③具有启动子和操纵子结构④具有重叠结构2.核酸提取总原则和过程：1)分离制备总原则：①保证核酸一级结构的完整性②尽量排除其他的污染，保证核酸的纯度2)核酸提纯步骤：①破碎细胞：超声破碎，匀浆法、低渗法②提取：采用酶学或化学试剂酚等去除蛋白质及其他大分子；③纯化：3.核酸分子杂交基本原理：利用核酸变性和复性的性质，使具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下按照碱基互补配对原则形成异质双链的过程。
（可发生在同源或异源的DNA链与DNA链之间，也可在RNA链与DNA链）4.理想探针的特点：①高度特异性②易于标记和检测③灵敏度高④稳定且制备方便5.核酸探针的种类和优缺点：1)基因组DNA探针：优点：制备方法简便、省时、易得，稳定不易降解，标记方法多样也较成熟缺点：杂交中可能会自我复性2)cDNA探针：优点：具有基因组DNA优点，且不存在内含子和其他高度重复序列，尤其适用于基因表达研究。
缺点：制备困难。
3)RNA探针：优点：不含高度重复序列，可降低非特异性杂交，复杂性低，杂交反应效率高；缺点：不稳定，标记方法复杂。
4)寡核苷酸探针：优点：①短的探针比长探针杂交速度快，特异性好；②可以在短时间内大量制备；③可以在合成过程中进行标记制成探针；④可合成单链探针，避免用双链DNA探针在杂交中的自我复性，提高了杂交效率；⑤可以检测小DNA片段缺点：长度有局限性，短链优于长链。
分子诊断复习
名词解释：Molecular diagnosis ：分子诊断，是指通过检测基因的结构异常或其表达异常，对人体的健康状态和疾病做出诊断的方法，属于病因学诊断。
评估基因的存在和缺陷通常以DNA为材料，而评估基因的表达量则以基因转录或翻译的产物RNA或蛋白质为材料来分析评估个体的生理/病理状态。
目前PCR、寡核苷酸探针杂交、DNA测序仍然是分子诊断的主流技术。
Molecular cloning：分子克隆，是指按照人的意愿， 在体外将制备的DNA片段与载体重组, 然后导入受体细胞, 并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝。
此技术称为分子克隆技术或DNA重组技术。
Molecular hybridization：核酸分子杂交，是在核酸变性与复性的基础上建立起来的一种分子生物学技术。
具有一定同源性的两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链在一定条件下按照碱基互补配对原则形成异质双链的过程称为分子杂交。
PCR：聚合酶链反应，是已知特异性DNA序列的体外引物定向酶促扩增技术。
RT-PCR：逆转录PCR，先将RNA用逆转录酶逆转录成cDNA，然后再加入特异引物对目标片段进行扩增，扩增产物的分析与其他常见PCR方法类似。
常用的逆转录酶有AMV逆转录酶（最适温度42℃)和MoMLV逆转录酶（最适温度37℃)，常用的逆转录引物有三种：随机引物、Oligo(dT)和特异性引物。
FQ-PCR：实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
Gene chip：基因芯片，又称DNA芯片或DNA微阵列，即将大量的基因片段有序地、高密度地固定排列在玻璃片、硅片或纤维膜等载体上制成点阵。
Genetic engineering：基因工程，是指将基因进行克隆, 并利用克隆的基因表达、制备特定的蛋白质或多肽产物, 或定向改造细胞和个体的特性所用的方法及相关工作。
分子诊断学复习资料__简答题部分
分子诊断学复习资料__简答题部分简答0、基因组的特点：人类基因组的特点：1、人类基因组具有23对染色体，基因组序列大约亿个核苷酸，含有蛋白质编码基因大约20, 000-25, 000个。
其中大量基因与中枢神经系统，特别是脑部发育相关；2、绝大多数基因为断裂基因，且分布不均。
除蛋白质编码基因外，其他大量基因为RNA编码基因；3、基因内和基因附近中存在大量短序列调控元件，发挥基因的调控表达和协调表达的作用；4、基因组中存在大量功能未知的其他序列，如串联重复序列、转座元件。
5、序列突变是人类基因突变的重要，序列/基因多态性是研究人类遗传突变的重要手段。
6、线粒体DNA是人类母系遗传疾病的重要基础。
真核基因组特点：1. 真核基因组结构庞大：人：3×10^9bp。
几、十、百倍于原核。
2.线性双链DNA，多条染色体和二倍体：DNA和组蛋白质形成染色体，存在于核膜内。
人：23对，46条；3.单顺反子(Monocistron) ：一个结构基因转录生成一条mRNA。
4. 功能基因不连续性，内含子与外显子并存：转录后需剪接(Splicing)5. 非编码区多于编码序列(9:1)6.含有大量重复序列2. 基因组DNA小，基因数目少，种间DNA大小差异大，GC含量差异大(菌种鉴定和分类标准），基因多为单拷贝基因 3. 基因组只有一个复制起始点，功能相关的基因大多成簇地串联排列在染色体上，结构基因无内含子，基因连续分布，为多顺反子。
4. 除主基因组外，原核生物往往还具有质粒基因组5. 转座元件/基因是原核生物基因组的重要特征是指可移动的基因成分，即能在一段DNA分子内部或两段DNA分子之间移动的DNA 片段，又称跳跃基因。
） 6. 致病基因是致病原核生物基因的重要特征病毒基因组的特点：1. 基因组大小相差很大2. 结构分子具有多样性3. 基因组多数是连续性，但RNA病毒往往不连续4. 编码序列占基因组的90%以上，间隔区序列很少；5. 多为单拷贝，即每个基因只出现一次；6. 相关基因丛集、有重叠基因和不规则基因结构序列。
分子诊断学复习docx
基因组概论一、名词解释：1.开放阅读框2.密码子偏爱3.C值矛盾4.基因组学二、问答题：1.简述基因的特点和鉴别标准。
2.简述基因组学研究对医学的影响。
参考答案名词解释：1.开放阅读框（open reading frame, ORF）是由始于起始密码子并终于终止密码子的一串密码子组成的核苷酸序列。
2.在不同物种的基因中经常为某种氨基酸编码的只是其中的某一特定的密码子，这种现象称密码子偏爱（codon bias）。
3.生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象称为C值矛盾。
4.基因组学（Genomics）指对所有基因进行基因组作图（包括遗传图谱、物理图谱、转录图谱），核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一门科学。
问答题：1.对于数量很少的编码tRNA、rRNA和某些小分子RNA的基因，我们较易通过核酸序列加以判断。
而对于数量极大的蛋白质编码基因，目前可根据其特点使用五项标准来鉴别：①开放阅读框（open reading frame, ORF）；②序列特征和密码子偏爱；③序列保守性；④转录产物；⑤基因失活。
但这些标准使用起来却往往会遇到一些困难。
2. 基因组学研究成果惠泽最多的莫过于医学，基因组学将改变整个医学是必然的趋势。
人类基因组中所有基因及其表达产物种类的确认和功能解析，野生型基因或突变型基因及其表达产物与疾病的关系的研究，将会大大加快加深人们对疾病分子机理的认识，并描绘出能准确用于每一种疾病的预测、诊断及预后的基因或蛋白质指纹图谱，将为药物的研究提供更多更有效的作用靶点。
人类个体之间DNA序列差异的研究，基因芯片与蛋白质芯片技术及快速测序技术等的发展和普及，将使基因组和蛋白质组范围内的快速、准确的分子诊断成为现实，人们将因此最大限度地了解自身对环境和疾病的易感性，增进健康，延长寿命。
医生将根据每个人的“基因特点”开出最优化的个体化处方。
另外，基因组学的成就将使基因治疗更为切实可行。
分子诊断学复习资料
分子诊断学复习资料分子诊断学复习资料——参照中国医药科技出版社（第二版）编写1.分子诊断学:是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法来研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、诊断、治疗和转归提供信息和依据。
①主要特点：直接以疾病基因为探索对象，属于病因学诊断，对基因的检测结果不仅具有描述性，更具有准确性；可准确诊断疾病的基因型变异，基因表型异常以及由外源性基因侵入引起的疾病。
灵敏度高，便于早期诊断及疾病预防；以基因分析为基础，特异性高。
②发展简史（三个阶段）第一个阶段：准备和酝酿阶段1953年前，蛋白质是生命的物质基础，DNA是遗传物质基础。
（三个实验：肺炎双球菌转化实验、体外转化实验、噬菌体转导实验）、第二个阶段：DNA双螺旋结构、中心法则、PCR技术第三个阶段：2001年，首张人类基因组序列图谱及其他物种基因组序列的公布。
基因组分、蛋白质组学等方面的巨大技术进步，促进进入第三阶段，即以生物芯片技术为代表的高通量密集型技术。
③主要应用：感染性疾病、遗传性疾病、肿瘤的分子诊断，个体化医疗，其他如耐药性、疗效监测，多基因疾病2.基因：是有功能的DNA片段，含有合成有功能蛋白质多肽链或RNA所必学的全部核苷酸序列，是遗传的结构和功能单位。
分为结构基因和调控基因。
①结构基因：编码蛋白质或RNA的编码序列调控基因：保证转录功能起调控作用的非编码序列②操纵子（operon）操纵基因与其控制下的结构基因共同组成的功能单位③断裂基因：指基因的内部存在间隔区，间隔区的DNA序列与该基因所决定的蛋白质没有关系。
间隔区又称为内含子。
出现在成熟RNA中的有效区段为外显子。
重叠基因：指基因的开放阅读框（ORF）存在一个或多个核苷酸重叠的基因跳跃基因：又称转座子，基因在染色体上的位置不固定，能由一条染色体跳到另一条染色体上。
必须基因：生物体中存在的一些维持生物细胞生长所必需的基因，缺少或突变这些基因均能导致生物体死亡3.基因组（gnome）：细胞中一套完整单倍体的遗传物质的总和基因组结构主要指不同的DNA功能区在DNA分子中的分布和排列4.C值：基因组的大小又称C值，常用碱基数目或碱基对数目来描述①C值是特异的，物种不同，差异极大，真核生物中，一般随着进化，C值增大②C值矛盾：又称C值悖论，生物的进化程度与基因组大小不完全成比例的现象5.真核生物基因组1）基本特征：①有细胞核基因组和细胞器基因组之分；②核基因组以线状DNA分子的形式存在于染色质上；③基因多数为断裂基因，有内含子结构和大量重复序列；④单顺反子，基因家族；⑤核基因组由染色体DNA组成，分子量较大，结构复杂，与蛋白质结合。
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1.（-）真核生物基因组：
①有细胞核基因组和细胞器基因组之分；②核基因组以线状DNA分子的形式存在于染色质上；③基
因多数为断裂基因，有内含子结构和大量重复序列；④单顺反子，基因家族；⑤核基因组由染色体DNA组成，分子量大，结构复杂，与蛋白质结合。
（-）原核生物基因组：
①基因组相对较小，通常为一条双链DNA分子②功能相关的基因高度集中，构成操纵子③重复序列
少，大多数的蛋白质基因保持单拷贝形式，而RNA基因常是多拷贝④没有内含子，基因是连续的⑤多顺反子，构成转录单位⑥绝大部分DNA都是用于编码蛋白质的，只有很少不编码序列⑦DNA分子中有各种功能区
（三）病毒基因组：
①只有一种核酸，4种类型，为双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA②核酸大小差别较大③具
有启动子和操纵子结构④具有重叠结构
2.核酸提取总原则和过程：
1）分离制备总原则：
①保证核酸一级结构的完整性
②尽量排除其他的污染，保证核酸的纯度
2）核酸提纯步骤：
①破碎细胞：超声破碎，匀浆法、低渗法
②提取：采用酶学或化学试剂酚等去除蛋白质及其他人分子；
⑤纯化：
3.核酸分子杂交基本原理：
利用核酸变性和复性的性质，使具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下按照碱基互补配对原则形成异质双链的过程。
（可发生在同源或异源的DNA链与DNA链之间，也可在RNA链与DNA链）
4.理想探针的特点：
①高度特异性6易于标记和检测③灵敏度高④稳定且制备方便
5.核酸探针的种类和优缺点：
1）基因组DNA探针：
优点：制备方法简便、省吋、易得，稳定不易降解，标记方法多样也较成熟
缺点：杂交屮可能会自我复性
2） cDNA 探针：
优点：具有基因组DNA优点，且不存在内含子和其他高度重复序列，尤其适用于基因表达研究。
缺点：制备困难。
3） RNA探针：
优点：不含高度重复序列，可降低非特异性杂交，复杂性低，杂交反应效率高；缺点：不稳定，标记方法复杂。
4）寡核昔酸探针：
优点：①短的探针比长探针杂交速度快，特异性好；
⑥可以在短吋间内大量制备；
③可以在合成过程屮进行标记制成探针；
④可合成单链探针，避免用双链DNA探针在杂交中的自我复性，提高了杂交效率；
⑥可以检测小DNA片段缺点：长度有局限性，短链优于长链。
6. PCR引物设计原则：
1）引物的长度：一般为15-30bp,常用是18-27bp,但不应大于38bp,过短会影响PCR反应的特异
性，过长会提高相应的退火温度，增加退火难度，并使延仲温度超过耐热DNA聚合酶的最适延仲温度。
2）引物的均衡性：引物中的碱基组成应尽可能随即分布，避免出现瞟吟或嚅噪碱基堆积现象。
两条引物GC量不能相差太大，G+C含量一-般为40%-60%
3）引物的二级结构：应避免由于引物分子之间存在较多的互补碱基而形成引物二聚体。
4）引物的末端：应避免在引物3,端使用碱基A, 3'端的几个碱基与模板DNA需严格配对，不能进行任何修饰，5'末端无严格限制。
5）引物的特异性：引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端。
7.荧光定量PCR技术的基本原理:
基于荧光能量传递技术，通过对PCR扩增反应每个循环结束时产物荧光信号的检测，对起始模版进行定量分析。
8.实时荧光定量PCR （real time FQ-PCR）：
在荧光定量PCR反应中，引物的荧光化学物质，在每经过一个循环后，产牛一个荧光强度信号，利用荧光信号累积及荧光强度变化实现对整个PCR过程实现监测。
9.FQ-PCR荧光定量PCR荧光标记的种类：
1.荧光染料法：常用染料：BBGreenl；非特异性。
2.荧光探针法：基于FRET原理（荧光共振能量转移）
①水解探针：TaqMan技术原理:于端的荧光Q分子吸收，宁端荧光R分子的荧光信号一探针宁端连接的
荧光R分子被Taq酶切割下来一荧光R分子发出荧光，切割的荧光分子数与PCR数量成比例。
②双杂交探针：LightCycler探针技术：有R发光探针和Q淬灭探针，荧光淬灭的程度与起始模版数的量
成正比。
③分子信标技术：分子灯塔形成茎环发夹结构，使荧光剂和淬灭剂紧密接触，导致荧光淬灭/单链寡核
昔酸探针由于与靶基因碱基序列互补而与之杂交/探针宁端和M端分离，淬灭剂对荧光剂的淬灭作用消失，产生荧光。
④复合探针技术：有R发光探针和Q淬灭探针当PCR扩增溶液无模版时，两探针特异性结合，无荧光；
有模版，荧光探针与模版结合，两探针分离，有荧光。
10.DNA序列测定四种常用方法：
Sanger双脱氧链末端终止法，DNA化学降解测序法，荧光自动测序法，DNA杂交测序法。
11.Sanger法（酶法）：双脱氧链终止法的原理：
利用DNA聚合酶，以单或双链DNA为模版，以dNTP为底物，其屮一种dNTP带放射性标记，在四组互相独立的反应体系中分别加入不同的丫3■双脱氧核昔三磷酸（ddNTP）作为链反应终止剂，根据碱基配对原则，在测序引物引导下，合成四组有序列梯度的互补DNA链，然后通过高分辨率的变性聚丙稀酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后识度待测DNA的互补序列。
判读：从DNA图谱读出DNA的碱基序列，新生链是待测DNA互补序列，从底部到顶部为宁到M端。
12.双脱氧链终止法步骤：
标记片段、凝胶电泳、区带显影、序列读取。
13•乙肝病毒（HBV）的分子诊断和临床意义：
（一）分子诊断：
1.HBV DNA：判断HBV是否复制以及传染性的最直接指标；
2.HBV基因分型：常用FQPCR、PCR-RDB、PCR-RFLP、DNA测序、基因芯片进行HBV基因分型。
3.HBV耐药基因检测：主要针对HBVDNA聚合酶P基因的检测，常用方法：FQ-PCR.核酸杂交、
基因型片。
（二）临床意义：HBV感染的早期诊断；监测治疗效果，判断病情；指导制订合理的治疗方案。
14.镰状细胞贫血的分子诊断：
（一）发病机制：镰状细胞贫血的分子机制是由于B珠蛋白基因发生了突变，导致［3链第6位谷氨酸（密码子GAG）变为颂氨酸（密码子GTG）o
（二）诊断方法：
Southern 杂交技术：该突变位点改变了限制性内切酶的位点，因此，在酶切之后用标记的B 珠蛋白基因探针进行Southern 杂交,正常人DNA 和患者DNA 就会出现不同模式的杂交条带。
切割正常DNA 产生
1.15kb + 0.20kb 长度的DNA 片段，若切割患者DNA 时，由于突变使得Mst II 的位点(CCTGTGG)缺失，便形成
1.35kb 长度的DNA 片段。
先通过PCR 扩增B 珠蛋口基因，将扩增的片段用限制性内切酶Mst II 消化后，进行电泳分析, 可以避免杂交过程。
PCR-ASO ：基于核酸杂交，灵敏度高，特异性好。
3、检测肿瘤标志：由于分子生物学技术自身的优势，采用分子生物学技术检测相关肿瘤标志物基 因、mRNA,更加有利于恶性肿瘤的治疗。
1. 3・
15.肿瘤分子诊断策略：
1、检测肿瘤相关基因：应注意选择与特定肿瘤相关性高的靶基因，靶基因应在拟诊肿瘤中具有较 高的突变频率，且存在突变热点；
2、 检测肿瘤相关病毒的基因：可以为某些肿瘤的诊断提供重要依据；。