分子诊断学完整终结版

分子诊断学完整终结版

1.分子诊断学:是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法来研究人体内源性或外源性生物大分子和

2.SNP：单核苷酸多态性，指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。

3．基因(gene)：是有功能的DNA片段，含有合成有功能蛋白质多肽链或RNA所必学的全部核苷酸序列，是遗传的结构和功能单位。分为结构基因和调控基因。

4．结构基因：编码蛋白质或RNA的编码序列调控基因：保证转录功能起调控作用的非编码序列

5．操纵子（operon）操纵基因与其控制下的结构基因共同组成的功能单位

6．断裂基因：指基因的内部存在间隔区，间隔区的DNA序列与该基因所决定的蛋白质没有关系。

间隔区又称为内含子。出现在成熟RNA中的有效区段为外显子。

7.重叠基因：指基因的开放阅读框（ORF）存在一个或多个核苷酸重叠的基因

8.跳跃基因：又称转座子，基因在染色体上的位置不固定，能由一条染色体跳到另一条染色体上。

9.必须基因：生物体中存在的一些维持生物细胞生长所必需的基因，缺少或突变这些基因均能导致生物体死亡

10.基因组（genome）：细胞中一套完整单倍体的遗传物质的总和.

11.基因组结构主要指不同的DNA功能区在DNA分子中的分布和排列

12．多顺反子（polycistron）：操纵子中常常有一至多个功能相关的结构基因串连一起，受同一个调控区调控，转录在同一个mRNA分子中。

13.黏性末端：基因组双链两端具有能够互补的单链DNA部分

14.末端正向重复序列：又称末端冗余，指病毒双链DNA分子两端有一段相同的核苷酸

15.末端反向重复序列（ITR）：指病毒基因组两端的反向互补重复序列

16.重叠基因：指两个或两个以上基因的ORF共有一段DNA 序列

17.分段基因：指病毒基因组由几条不同的核酸分子组成，多冗于tDNA病毒，RNA病毒及双链RNA病毒

18.LTR：即长末端重复序列，逆转录病毒逆转录后生产的dsDNA中，两端有LTR结构

19.DNA重组：是指将不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键将末端连接形成重组DNA.

20.DNA克隆（分子克隆）：将某一特定DNA片段通过重组DNA技术插入到一个载体（质粒和病毒等）中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片段的群体。

21..限制性片段长度的多态性（RFLP）：个体之间DNA的核苷酸序列存在差异，称为DNA多态性。若因此而改变了限制性内切酶的酶切位点可导致相应的限制性片段的长度和数量发生变化，称RFLP。

22..限制性核酸内切酶（RE）:重要的工具酶之一。RE是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶.(水解磷酸二酯键)

23..DNA聚合酶Ⅰ是从大肠杆菌中发现的第一个DNA聚合酶，分子量为109000.具有５’—3’聚合酶活性、3’—5’核酸外切酶活性、5’-3’核算外切酶活性的工具酶。

24..Klenow片段：用特异性的蛋白酶可将DNA聚合酶Ⅰ裂解为小片段与大片段，大片段即Klenow片段，具有5’--3’聚合酶活性及3’--5’外切酶活性，而失去了5’—3’外切酶活性，是分子生物学研究的常用工具酶

25.TaqDNA聚合酶：一种耐热的依赖DNA的ＤＮＡ聚合酶。具有5’—3’聚合酶活性和依赖于聚合作用的5’—3’外切酶活性。（最佳作用温度是70~80℃，TaqDNA聚合酶可用于DNA 测定及通过聚合酶链反应（PCR）对DNA分子的特定序列进行体外扩增）

26.同工异源酶：在DNA上，来源不同但能识别和切割同一位点的酶。

27..逆转录酶：是具有依赖RNA的DNA聚合酶活性、核酸酶H的水解作用、以DNA为模版的DNA聚合酶作用的多

功能酶。

28.末端脱氧核糖核苷酰转移酶（简称末端转移酶）TdT：在二价阳离子存在下，催化ｄＮＴＰ转移到单链或双链DNA 分子的3'-OH末端的工具酶。

29.ＤＮＡ连接酶：催化双链ＤＮＡ一端的３’－ＯＨ与另一双链ＤＮＡ５'端的磷酸根形成３'，５＇－磷酸二酯键，将具有相同黏性末端或平端的两条双链DNA片段连接起来，实现DNA的体外重组，其催化黏性末端连接效率要比平末端高得多。

30.碱性磷酸酶：用于催化去除DNA、RNA或dNTP上的5'-磷酸基团的工具酶。

31.T4多核苷酸激酶：来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌．包

括前向反应和交换反应。用于催化ATP上的γ-磷酸转移到ＤＮＡ链的５＇端上的工具酶．

32.核酸酶Ｓ１：可用于水解双链DNA、ＲＮＡ或DNA－Ｒ

ＮＡ杂交分子的单链部分的工具酶．

33.载体（vector）：是携带靶DNA（目的DNA）片段进入宿主

细胞进行扩增和表达的运载工具，本质为DNA。

34.克隆载体：能将目的基因在受体细胞中复制扩增并产生大

量目的基因的载体称为克隆载体。

35.分子诊断主要特点：直接以疾病基因为探索对象，属于病因学诊断，对基因的检测结果不仅具有描述性，更具有准确性；可准确诊断疾病的基因型变异，基因表型异常以及由外

源性基因侵入引起的疾病；灵敏度高，便于早期诊断及疾病预防；以基因分析为基础，特异性高。

36分子诊断三个阶段:(第一个阶段：准备和酝酿阶段1953年前，蛋白质是生命的物质基础，DNA是遗传物质基础。（三个实验：肺炎双球菌转化实验、体外转化实验、噬菌体转导实验）、第二个阶段：DNA双螺旋结构、中心法则、PCR技术第三个阶段：2001年，首张人类基因组序列图谱及其他物种基因组序列的公布。基因组分、蛋白质组学等方面的巨大技术进步，促进进入第三阶段，即以生物芯片技术为代表的高通量密集型技术。

③主要应用：感染性疾病、遗传性疾病、肿瘤的分子诊断，个体化医疗，其他如耐药性、疗效监测，多基因疾病

37.四项生物技术：细胞融合技术，分子克隆技术，蛋白工程技术，基因扩增技术

38.C值：基因组的大小，常用碱基数目或碱基对数目来描述

①C值是特异的，物种不同，差异极大，真核生物中，一般随着进化，C值增大②C值矛盾：又称C值悖论，生物的进化程度与基因组大小不完全成比例的现象

39.真核生物基因组基本特征：①有细胞核基因组和细胞器基因组之分；②核基因组以线状DNA分子的形式存在于染色质上；③基因多数为断裂基因，有内含子结构和大量重复序列；④单顺反子，基因家族；⑤核基因组由染色体DNA组成，分子量较大，结构复杂，与蛋白质结合。

40.注意点：①染色质的基本组成单位是核小体，由组蛋白核心和周围的DNA组成。组蛋白H2A、H2B、H3和H4各2个分子组成核心即组蛋白八聚体②一个基因有n个内含子，则相应有n+1个外显子③重复序列分为4类：单一序列、轻度重复序列（2—10个拷贝）、中度重复序列（10—12个拷贝）、高度重复序列（1万以上）④多基因家族：一些有编码功能的重复序列，即指起源相同，序列相似，功能相关的的一组基因，分为基因簇（相对集中分布在某一染色体的特定区域）和另一类基因家族成员在整个染色体上散在分布，甚至位于不同染色体⑤超基因家族：由基因家族和单基因组成的较大的基因家族，结构不等的同源性，功能不一定相同⑥假基因：基因家族中有的成员因突变而失活，不能表达出有活性的产物。

41．人类基因组计划（HGP）：旨在测出人类基因组30亿碱基对的核苷酸序列，发现所有人类基因并确定它们在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息，发展基因组学新技术，探讨人类基因组研究的社会法律与伦理等问题的一个国际性研究项目。

1）主要任务：人类的DNA测序，包括序列图谱、遗传图谱、物理图谱、转录图谱等的绘制2）测序策略：经典的逐步克隆法、全基因组鸟枪法3）人类基因组概貌：①GC含量：平均41%（33%—65%）②CpG岛：即二核苷酸CG③染色体的重组率④基因突变率：男性多见⑤重组序列的含量，包

括SINE、LINE、LTR、卫星DNA、Tn等⑥单核苷酸多态性（SNP）含量⑦基因数量：2、6万—3、9万个⑧蛋白质数量：选择性剪接较多，使得蛋白质多而复杂⑨疾病基因⑩人基因组序列：99、99%相同4）人类基因组多样性：同一人种或不同人种基因组存在或多或少的差异。通常DNA分子中某一特定位点的变异频率低于1%为基因突变，高于1%为DNA分子多肽。人类DNA分子多肽性的产生有以下几种主要方式：①重复序列单元的拷贝数变异，如微卫星DNA多态性②转座因子导致的分子多肽，如Alu序列多态性③单个核苷酸的变异即SNP

42．原核生物基因组一般特点：①基因组相对较小，通常为一条双链DNA分子②功能相关的基因高度集中，构成操纵子③重复序列少，大多数的蛋白质基因保持单拷贝形式，RNA基因常是多拷贝④没有内含子，基因连续⑤多顺反子，构成转录单位⑥绝大部分DNA都是用于编码蛋白质的，只有很少不编码序列⑦DNA分子中有各种功能区

43、质粒是多数细菌和某些真核生物细胞的染色体外的双链环状DNA分子

44.遗传特性：①双链环状DNA分子，且为共价闭合环状DNA

（cccDNA）②质粒复制有赖于宿主细胞的复制，但其自身基因可控制合成的时限及拷贝数③垂直传递④不影响宿主细胞代谢，但可能

赋予宿主细胞新的表型⑤治理的复制方式为半保留复

制。单向/双向，单向，双向。

45.特性：①质粒的不相溶性：两种不同质粒如果利用同一复制和维持机制，会在复制和随后向子代细胞分配的过程中相互竞争，因而不能在同一宿主细胞内稳定存在，其中一种质粒将被丢失的现象。这两种质粒属于同一不相容群（InC）。

②质粒的稳定性：质粒在宿主细胞内能稳定存在不被丢失称为质粒的稳定性。③质粒的转移性。④质粒的选择性标记。

46.①质粒的拷贝数：在正常生长条件下，每个宿主细胞或每条染色体所对应的平均质粒数。由其携带的复制子决定。②复制子是一个复制单位，包括复制起点及其相关的调控元件。

③质粒的复制由复制子与调节因子协同作用来启动。

47.松弛型质粒：以RNA为调节因子的质粒的复制不需任何

自身编码的蛋白质，完全由宿主细胞提供的寿命较长的酶及其他蛋白质因子来完成，这些质粒的复制不受宿主细胞的控制，以所谓的“松弛”方式进行。属高拷贝质粒。48.严紧型质粒：携带与蛋白质调节因子相互作用的复制子的质粒。属低拷贝质粒。

49.转座因子：又称可转座元件，指能在基因组中从一个位点移至另一位点的DNA序列。

1）①转座现象或移位：指由可移动因子介导的遗传物质重排现象。

②转座作用结果：a.导致宿主细胞基因组DNA的插入突

变或基因重排，是毗邻基因失活或表达水平下降。b.转座因子被认为是基因组进化的重要推动力量，还可作为遗传学研究及基因工程的工具。

2）原核生物转座因子的种类：插入序列（IS）、转座子（Tn）、可转移性噬菌体。

①IS：a.IS两端有正向重复序列（DR）和反向重复序列（IR）；

b.IR结构的对称使IS既可正向插入靶位点，也可反向插入靶位点；

c.IS的中间位编码序列，仅编码与转座有关的酶，含有依赖p因子的转录终止信号及终止密码，从而导致插入位点的基因失活或表达水平下降。

②Tn：基因组中存在的能自主复制和位移的一些DNA序列。特点：a.两端有反向重复序列；b.转座后靶位点重复序列是正向重复序列；c.编码与转座有关的蛋白；d.可以在基因组中移动。

50.转座类型：复制型转座、非复制型转座。

①复制型转座：转座因子在转座过程中能够复制，结果是供体与受体都有一个拷贝的转座因子。需转座酶和解离酶。

②非复制型转座：转座因子不复制，直接从一个位点移到另一个位点，结果是供体失去一个转座因子而受体得到一个转座因子。需转座酶。

51..病毒基因组：1)特点：①只有一种核酸，4种类型，为双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA ②核酸大小差别较大（1.3×103bp~3.6×106bp）③具有启动子和操纵子结

构④具有重叠结构

2）结构：①帽子和poly（A）尾结构，对RNA起保护作用，并于病毒感染性有关

52.分子克隆技术中，常用的工具酶有：限制性核酸内切酶，DNA聚合酶Ⅰ,逆转录酶，DNA连接酶，碱性磷酸酶，多核苷酸激酶等。

53.限制性核酸内切酶（RE）命名：Hin dⅢ①H产生该酶的宿主菌属名→大写，斜体②③in代表宿主菌的种名缩写→小写，斜体④d代表宿主菌的株或型→正体⑤Ⅲ代表同一种菌株中不同限制酶的编号（按发现先后顺序）→罗马数字。回问结构：通常是双链DNA分子中按对称轴排列的反向互补序列。星号活力：RE在非标准条件下，能切割一些与其特异识别顺序类似的序列，酶的特异性降低，这种现象称为星号活力，使用时应避免产生星号活力。

54.DNA聚合酶.（1）DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段（2）TaqDNA聚合酶

55.Klenow片段的主要用途：①补齐双链DNA的3’端，使3’端标记；②在cDNA克隆中，第二股链的合成；③DNA序列分析

56.逆转录酶：（多功能酶）功能：（1）依赖RNA的DNA聚合酶活性，以RNA为模版，4种dNTP为底物（此过程称为逆转录作用），催化合成DNA。（2）核酸酶H的水解作用（3）以DNA为模版的DNA聚合酶作用

57.末端脱氧核糖核苷酰转移酶（简称末端转移酶）TdT功能：

①在载体或目的基因3’端上加上互补的多聚体尾，形成便于重组的人工黏性末端②用于DNA片段3’端的同位素探针标记

58.DNA连接酶主要有两者：大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶

辅基分别为NAD+（只能连接黏性末端）ATP（既能连接黏性末端，又能连接平末端）重组DNA技术中常用T4噬菌体DNA连接酶T4DNA连接酶最初来自受T4噬菌体侵染的大肠杆菌，但目前的分离纯化手段已能快速而又简便的得到大量高度特异性酶。

注意：DNA分子磷酸二酯键的断裂称为切口（Nick），可以用T4 DNA连接酶来修复。DNA分子中核酸缺失，称缺口（gap），不能单独用连接酶来修复。

59.碱性磷酸酶(1)细菌碱性磷酸酶（BAP）→由大肠杆菌分离出来的(2)小牛肠碱性磷酸酶（CIP）→由牛肠道分离出来的（两个催化去除DNA、RNA或dNTP上的5’-磷酸基团）主要用途：①.除去DNA段上的5′磷酸，以防自身连接。

②.在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标记前，除去RNA 或DNA上5′端的磷酸，以便进一步用32P标记的r-磷酸重新磷酸化，使5′端段被32P标记。

60 核酸酶S1的作用：①.除去双链DNA的黏性末端以生产平

末端。②.除去cDNA合成时形成的发夹结构。

③.分析RNA的茎环结构和DNA-RNA分子的杂交情况

等。

载体主要有质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色体等多种类型。根据其用途分为克隆载体和表达载体

61.克隆载体常有两种：质粒载体和噬菌体载体

1）质粒载体复制特性：紧密型和松弛型（与宿主有关）

作为克隆载体的质粒具备特点：①具有松弛型复制子；②在复制子外存在几个单一的酶切入点，以便目的DNA插入；

③具有插入失活的筛选标记，理想的质粒载体应具有两种抗生素抗性标记；④分子量相对较小和较高的拷贝数。

质粒缺点：容量较小，一般只能接受小于15kb的外来DNA。质粒克隆载体用途①保存和扩增﹤2kb目的DNA ②构建cDNA 文库③目的DNA的测序④作为核酸杂交时的探针来源。

目前常用的质粒有PBR322，PUC系列，以及由后者衍生而来的PSP和PGEM系列等。

PBR322系列载体特点：①带有一个复制起始点②具有二个抗生素抗性基因③具有较小的分子量④具有较高的拷贝数2）PUC18、PUC19质粒载体

2)噬菌体载体：λ噬菌体载体、M13噬菌体

噬菌体是指感染细菌的病毒，按其生活周期分为溶菌性噬菌体和溶源性噬菌体

1）λ噬菌体包括插入型和置换型两类，其主要用途：①用作一般的克隆载体；②用于构建一般的基因体或cDNA文

库（小于22kb）；③用于抗体库或随机肽库的构建; ④核酸的序列分析。

3、表达载体和穿梭载体讲的很少，了解它们的结构便可P39-41.

62.分子克隆的基本步骤:①目的基因的制备②载体的选择和制备③目的基因与载体的连接④重组DNA导入受体细胞⑤目的基因的筛选和鉴定

63.目的基因的获取制备方法：（1）基因从文库中获取【基因文库（G-文库）：是指含有某种生物全部基因随即片段的重组DNA克隆群。（C-文库）：将细胞的全部mRNA经逆转录制备出全套的cDNA克隆群】（2）逆转录合成cDNA（3）人工合成DNA 片段（100bp）（4）PCR合成（5）直接从染色体DNA中分离目的基因

2）载体的选择：λ噬菌体和黏性质粒载体常用来构建基因组文库，pUC系列常用于构建cDNA文库和克隆较小DNA片段，M13噬菌体则用于克隆一些待测的DNA序列

3）目的基因和载体的连接：平末端连接和黏性末端连接（容易些）

黏性末端DNA分子连接（目的基因或DNA插入片段与适当的载体存在同源粘性末端）：用牛小肠碱性磷酸酶去除载体的5’磷酸抑制DNA的自身环化，使它只能与未经碱性磷酸酶处理的外源DNA片段连接

平末端连接法（质粒与目的基因无相同的酶切位点）有

以下几种方法①T4DNA连接酶连接②人工头连接③通过同聚尾连接

4）将重组DNA导入受体细胞

（1）重组DNA分子导入原核细胞

目的基因与载体在体外连接成重组体后，需先导入受体细胞，常用的受体细胞是大肠杆菌。转化方法：①Cacl2处理法②电击法转化作用：将重组的DNA分子引入细菌（原核细胞），使其在细菌体内扩增及表达的过程称为转化作用

转染：将噬菌体、病毒或以它们为载体构建的DNA重组体导入真核细胞的过程

（2）重组DNA分子导入真核细胞①Cacl2处理法②电击法③聚聚乙二醇介导的转染法④磷酸钙-DNA

共沉淀法⑤二乙胺乙基-葡聚糖介导的转染⑥原生

质体融合⑦脂质体法⑧细胞核的显微注射法

5）重组体的筛选和鉴定

（１）根据载体的性状变化进行筛选：筛选出转化菌，

筛选带重组体的克隆，对ＤＮＡ重组体进行鉴别。

①根据载体的性状变化进行筛选②根据载体抗药性

标志插入失活选择③β-半乳糖苷酶系统④根据插

入的外源性DNA片段的性状进行筛选

（2）根据重组DNA的结构特征进行筛选①重组子大小鉴别筛选②限制性内切酶图谱进行分析③PCR

扩增方法进行鉴定④核酸分子杂交方法进行鉴定⑤

DNA序列分析鉴定

64.插入失活效应：选用含有两个以上的抗药基因的载体，外源DNA片段插入其中一个基因，并导致这个基因的失活，就可用两个含不同药物的平板，互相对照，筛选含重组DNA 的菌落

65.核酸分子杂交基本原理：利用核酸变性和复性的性质，使具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下按照碱基互补配对原则形成异质双链的过程。（可发生在同源或异源的DNA链与DNA链之间，也可在RNA链与DNA链）

66.核酸变性（denaturation）：指维系核酸双链互补碱基对之间的氢链断裂变成单链的过程，并不涉及共价键的断裂。（黏度减小，浮力密度增大，260nm处紫外吸收增加，活性降低）（热变形，酸碱变性，化学变性）

67.Tm（melting temperature）：通常把热变性过程中DNA 变性一半所需要的温度成为融解温度。DNA的Tm值在82~95℃之间Tm影响因素：①DNA的均一性②碱基组成

③溶液的离子强度④pH⑤变性剂

68.DNA复性（renaturation）：当变性条件缓慢去除后，两条彼此分开的互补单链重新缔合成双螺旋结构的过程。（许多理化性质恢复，但热变性后骤然冷却，DNA则不可复性）

①退火（annealing）：热变性后，将温度缓慢降低而使DNA 逐渐冷却即可复性的过程。

②复性过程分两步：成核作用（nucleation）和拉链作用（zippering）成核作用：两条核酸单链随机碰撞形成暂时局部双链，如果局部双链周围碱基不能配对，则迅速解离，重新碰撞直到找到正确的互补序列，这个过程称为成核作用。拉链作用：在成核的基础上，两条单链的其余部分碱基迅速互补配对，就像拉链那样形成完整的双链分子。

③复性速度用Cot1/2衡量，Co：单链DNA的起始浓度（mol/L），t为时间（s），Cot1/2表示单链DNA的起始浓度与复性一半所需时间之积，与复性速度成反比，与DNA复杂度有关影响因素：DNA的分子大小和复杂度，离子强度，DNA的浓度，温度

69.探针（probe）：广义上指的是能特异性与特定靶分子发生相互作用，并能被某些方法所检测的分子。

70理想探针的特点：①高度特异性②易于标记和检测③灵敏度高④稳定且制备方便

71核酸探针：指能与特定靶基因序列发生特异性互补结合，并可用特殊方法检测的被标记的已知核酸序列

72.核酸探针的种类：基因组DNA探针、cDNA探针、RNA 探针、寡核苷酸探针

1）基因组DNA探针：①制备方法：a.分子克隆b.采用聚合酶链反应扩增特定的基因组DNA片段②优点：制备方法简便、省时、易得，稳定不易降解，标记方法多样也较成熟2）cDNA探针：①cDNA（complementary DNA）：指与mRNA

互补的DNA分子，它是以mRNA为模板，遵循碱基互补配对原则，由逆转录酶催化合成②优点：具有基因组DNA优点，且不存在内含子和其他高度重复序列，尤其适用于基因表达研究（但制备困难）

3）RNA探针：杂交效率高，杂交分子稳定，不存在高度重复序列，非特异性杂交较少，不易标记，易降解

4）寡核苷酸探针：①特点：a.根据实验需要合成b.长度一般为20~50nt c.可以识别靶分子的单个碱基变化 d.特异性不高，杂交信号不强②设计原则：a.探针长度一般20~50nt b.剪辑成分，Gtc含量在40%~60%为宜 c.不应存在大于4bp 的互补序列 d.避免同一碱基重复出现多于4次 e.同源性不应超过70%或有连续8个上碱基同源

73核酸探针的标记，两大类（1）放射性核素：最常用，灵敏度和特异性极高，但半衰期短，检测时间长，污染环境（2）非放射性核素：稳定、安全、经济、检测时间短，但灵敏度74.理想探针标记物特点：①高灵敏度②标记物与探针结合后，不影响碱基对的特异性，杂交体的稳定性及其Tm值。

③检测方法应高灵敏度、特异、假阳性率低④标记物与探针结合后稳定，保存时间长⑤标记物对环境无污染、对人体无损伤、价格低廉。

75 放射性核素的标记物类型常用32P 35S 3H 125I 131I其类型特点：

①32P:比放射活性3.4×1014Bq/mmol.最常用。放射性强，释

放的β粒子能量高，穿透能力强，灵敏度高，半衰期仅14.4d，射线散射严重而影像分辨率，影响结果分析。②35S：比放射活性 5.55×1013Bq/mmol.释放的β粒子较32P稍低，半衰期87.1d，灵敏度比32P低，散射作用弱，分辨率较高，适用于原位杂交。③3H：比放射活性1.07×1012Bq/mmol，释放的β粒子能量较低，半衰期12.1年，采用延长曝光时间的方法可产生本底低，分辨率高的结果，金庸与细胞原位杂交，可反复使用，对环境影响大。④125I、131I：释放β粒子和γ射线，具有较高敏感性，较强分辨率，危害性大。76放射性核素的标记标记法：采用体外标记法，包括化学法和酶法

1)化学法：利用标记物分子和探针分子上活性基团间的化学反应，将标记物结合到探针分子的标记方法。

2)酶法：预先将标记物标记在核苷酸分子上，经过酶促反应将标记号的核苷酸分子或标记基因掺入或交换到探针分子中的方法，有切口平移法，随机引物法，末端标记法，PCR 标记法，体外转录法

（1）切口平移法：DNaseI Mg2+随机切割3’—OH加d NTP(被标记) E.coli DNA聚合酶I全酶切除5’端的核苷酸合成互补单链，适用于任何形式的双链DNA但不适合单链DNA和RNA（2）随机引物法：随机引物是人工合成的由6个核苷酸残基构成的寡核苷酸片断的混合物。模版DNA变性，加入随机引物在Klenow酶催化加入d NTPs(一种被标记)，变性形成标记探针，适合单双链DNA和RNA探针标

记3)末端标记法：①3’端标记法：模版DNA经限制性内切酶形成5’端突出的DNA，klenow酶+d NTPs变性得到3’端标记DNA，经变性成3’端标记单链DNA探针②5’端标记法; T4噬菌体多核苷酸激酶（PNK）标记法、碱性磷性磷酸酶（ALP）切除5’端的磷酸基团PNK作用转移

77.非放射性核素标记：生物素、地高辛、光敏生物素、荧光素、酶标法{ALP 和辣根过氧化酶（HRP）}

核酸探针的纯化：①乙醇沉淀法②凝胶过滤色谱法核酸探针的检测：（1）放射性：①放射自显影②液体闪烁计数法（2）非放射性：偶联反应、显色反应（酶促显色法、荧光法、化学发光法）

78.核酸分子杂交的类型：固相杂交和液相杂交两大类

1）①液相杂交：将待测核酸样品和核酸探针同时放入杂交液中进行反应，然后分离杂交分子和过量的未杂交探针，再对杂交结果进行检测②固相杂交：预先将待测的靶核酸链固定在固相支持物上，然后与溶解于杂交液中的核酸探针进行杂交反应，洗去支持物上未参加反应的游离核酸探针，再检测杂交信号，分析结果。

2）常用固相杂交：Southern 印迹杂交Northern印迹杂交、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、原位杂交

①Southern 印迹杂交:指经凝胶电泳分离的待测DNA片断转印并结合到一定固相支持物(尼龙膜或硝酸纤维素膜)，然后用标记的探针DNA分子检测靶DNA的一种方法。