(植物组织培养)
3第三章 植物组织培养简介
的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力， 的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力， 回复到分生组织状态的过程。 回复到分生组织状态的过程。
3.再分化 redifferentiation〕 3.再分化〔redifferentiation〕:
Folke Skoog(1908- )
1955年，Miller从DNA降解物中分离出6－呋喃 1955年 Miller从DNA降解物中分离出6 降解物中分离出 氨基嘌呤（激动素）， ），发现它诱导芽分化的效率比 氨基嘌呤（激动素），发现它诱导芽分化的效率比 腺嘌呤高3万倍。控制器官分化的激素模式变为激动 腺嘌呤高3万倍。控制器官分化的激素模式变为激动 生长素的比例关系 促进组培的发展。 的比例关系。 素／生长素的比例关系。促进组培的发展。
Gottlieb Haberlandt(1854-1946). He was the first to formulate clearly the principles of plant cell culture.
细胞全能性学说： 细胞全能性学说： 植物体中任何生活细胞都具有该 物种的全部遗传信息， 物种的全部遗传信息，具有相同的形态结构和一定的生理 功能。只要条件合适， 功能。只要条件合适，由一个单细胞就可以发育成为一个 新的个体。 新的个体。 该文还报道了几种植物的细胞和组织的培养实验，由 该文还报道了几种植物的细胞和组织的培养实验， 于当时的条件所限，都没有成功. 于当时的条件所限，都没有成功
第三章 植物组织培养 (tissue culture) 概述
第一节
植物组织培养的意义
植物组织培养概念(重点 重点) 一、植物组织培养概念 重点 植物组织培养理论基础(难点 难点) 二、植物组织培养理论基础 难点 植物组织培养类型(难点 难点) 三、植物组织培养类型 难点 植物组织培养特点(重点 重点) 四、植物组织培养特点 重点
植物组织培养
1.植物组织培养（离体培养）：是指在无菌条件下，将植物体的任何一部分，培养在人工配制的培养基上，并给予适宜的培养条件，使之发育形成完整植物体的过程。
2、植物组织培养的类型（1）根据培养基的类型分为:固体培养液体培养半液半固体培养（2）根据培养材料（外植体类型）分为：植株培养器官培养组织培养原生质体培养胚胎培养细胞培养（3）按培养过程分：初代培养继代培养生根培养3、植物组织培养的一般工作流程1.准备阶段：（1）查阅资料，制定培养方案；（2）清洗组培用器皿、工具；（3）配制所需试剂和培养基；（4）试剂、培养基与器皿、工具的灭菌。
2.外植体的选择与消毒；3.初代培养；4.继代培养；5.生根培养；6.炼苗移栽4、植物细胞的全能性概念：指植物体的每个活细胞都携带有该物种的全套遗传信息，在适宜条件下，离体细胞都具有发育为一个完整植株的潜在能力。
注意：（1）活细胞（2）离体细胞（3）细胞全能性表达的难易程度取决于细胞的分化程度5、细胞全能性的强弱表现：（1）植物细胞全能性根据细胞的性质不同由强到弱：营养生长中心＞形成层＞薄壁细胞＞厚壁细胞（木质化细胞）＞特化细胞（导管等）（2）植物细胞全能性根据所处的组织不同由强到弱：顶端分生组织＞侧生分生组织＞居间分生组织＞薄壁组织＞厚角组织＞输导组织＞厚壁组织6、植物组织培养中全能性表达的条件：1.无菌条件；2.离体条件；3.一定的营养物质；4.植物生长调节物质；5.适宜的外界条件。
7、胚性细胞的特点：未分化状态；细胞具有旺盛分裂能力；具有两极性8、脱分化：指在一定条件下，已分化成熟的细胞、组织或器官恢复到未分化的分生状态，并进行细胞分裂形成未分化的细胞团，如愈伤组织的形成过程。
9、愈伤组织形成的三个时期：（1）诱导期又称启动期（最难）。
（2）分裂期（3）分化期10、优良愈伤组织的特征：（1）具有旺盛的增殖能力；（2）容易散碎；（3）具有高度的胚性或再分化能力，便于植株再生；（4）经过长期的继代保存而不丧失胚性。
植物组织培养
植物组织培养的含义：将植物的离体材料（器官、组织、细胞、原生质体等）无菌培养，使其生长、分化、繁殖，再生出完整植株或生产次生代谢物质的技术。
植物组织培养的理论基础是植物细胞的全能性：指一个完整的植物细胞拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息，在适宜条件下具有发育成完整植株的能力。
外植体：在植物组织培养中，在活体植物上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等均称为外植体。
外植体选择的原则：①、再生能力强；②、遗传稳定性好；③、来源丰富；④、灭菌容易。
植物组织培养的类型：根据培养材料（即外植体）的不同，可将植物组织培养划分为植株、胚胎、器官、组织、细胞和原生质体五个水平上的培养类型。
愈伤组织：原指植物在受伤后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组织培养中，则指在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。
植物组织培养的特点：①、培养材料经济；②、培养条件可以人为控制；③、生长周期短，繁殖率高；④、管理方便，利于工厂化生产和自动化控制。
White（1943）撰写的《植物组织培养》是第一部有关植物组织培养的专著。
PH值最适5.6，高温、高压灭菌后PH值会降低，配制时一般为5.7~5.8，若PH值偏高，培养基会偏硬，会不利于植物材料吸取营养；PH值偏低，培养基凝固不好，不利于植物材料的固定。
MS培养基特点：①、无机盐成分很高，硝酸盐、NH+、K+含量高；②、元素平衡较好；③、缓冲性能也比较好；④、微量元素、有机成分丰富、齐全。
无机盐母液适度冷藏保存。
维生素等有机营养元素在—20℃保存，使用前用温水溶解。
MS培养基母液的成分：大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机物母液。
CuSO4、CuCl2取25mg溶于10mL，制成2.5mg/mL溶液，配制50mL微量元素母液，吸取该溶液0.05mL。
灭菌的条件：培养基的成分：1、水分2、无机盐①、大量元素：指植物生长发育所需浓度大于0.5mmol/L的营养元素。
植物组织培养
（3）肌醇 又叫环己六醇，在糖类的相互转 化中起重要作用。 使用浓度：一般为lOOmg／L。 作用：适当使用肌醇，能促进愈 伤组织的生长以及胚状体和芽的形 成。对组织和细胞的繁殖、分化有 促进作用，对细胞壁的形成也有作 用。
（4）氨基酸 (almino acide） 作用：蛋白质的组成部分，也是一种有机氮化 合物。是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。 种类：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、 谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等 半胱氨酸及多种氨基酸的混合物（水解酪蛋白、水 解乳蛋白）等。
（11）再分化 经脱分化的组织或细胞在一定 的培养条件下可又转变为各种 不同细胞类型的能力。 （12） 分化培养 经过脱分化阶段的外植体（形 成愈伤组织），转移到另一培 养基上分化出芽（或小球茎） 或胚时，则称为分化培养，所 用的培养基为分化培养基。
（13） 增殖培养 已分化芽、小球茎或无性幼胚再继续进行增殖，即
1. 培养条件可人为控制，周年生产
植物组织培养中的植物材料完全是在人为提供的 培养基及小气候环境下生长的，摆脱了大自然中 四季、昼夜气温频繁变化及灾害性气候等外界不 利因素的影响，且条件均一、对植物生长极为有 利。因此植物组织培养不受气候和季节的限制， 可周年进行生产。
2. 生长周期短，繁殖速度快
植物组织培养可根据不同植物、不同器官、不同 组织的不同要求而提供不同的培养条件，满足其 快速生长的要求，缩短培养周期。一般20~30d就 完成一个繁殖周期.每一繁殖周期可增殖几倍到几 十倍,甚至上百倍,植物材料以几何级数增加。
3. 管理方便，可实现工厂化生产
植物组织培养是在人为的提供一定温度、光照、 湿度、营养和植物生长调节剂等条件下进行的， 不受自然界中病、虫、杂草等有害生物危害，生 产微型化、精细化、高度集约化，重复性强，便 于标准化管理和自动化控制，真正实现了种苗的 工厂化生产。与田间栽培、盆栽等相比，省去了 中耕除草、浇水施肥、病虫防治等一系列繁杂劳 动，可大大节省人力、物力及田间种植所需要的 土地。
3.植物细胞培养（植物组织培养）
3.植物细胞培养（植物组织培养）第三章植物细胞培养植物细胞培养：指对从植物器官或由愈伤组织上分离的单细胞（或⼩细胞团）进⾏培养，形成单细胞⽆性系或再⽣植株的技术。
Haberlandt（1902）⾸次尝试分离和培养植物叶⽚单细胞。
细胞培养的意义有利于进⾏细胞⽣理代谢以及各种不同物质对细胞代谢影响的研究。
进⾏细胞培养，通过单细胞的克隆化，即称为“细胞株”（cell line），可以把微⽣物遗传技术⽤于⾼等植物以进⾏农作物的改良。
细胞培养的增殖速度快，适合⼤规模悬浮培养，⽣产⼀些特有的产物，如许多种植物的次⽣代谢产物，包括各种药材的有效成分等，⽤于医药业、酶⼯业及天然⾊素⼯业，这是植物产品⼯业化⽣产的新途径。
由于植物组织培养中细胞之间在遗传和⽣理⽣化上会出现种种变异，这些细胞形成的植株也都表现出⼀定的差异。
这种差异反映在它们的植株的形态、产量、品质、抗病⾍和抗逆性等⽅⾯。
所以由单细胞培养获得的单细胞⽆性繁殖系，并对不同的细胞进⾏研究，在理论上和实践上都有很重要的意义。
细胞培养就是从⾼等植物的某个特定的器官或组织中取得单个细胞进⾏培养，并诱导其分裂增殖，由细胞分裂形成细胞团，再通过细胞分化形成芽根等器官或胚状体，长成完整植株。
第⼀节植物细胞培养⼀. 单细胞培养(⼀)单细胞分离1.机械法2.酶解法3.从愈伤组织中分离(⼆)单细胞的培养⽅法1、平板培养（细胞的⽣长周期）2、看护培养3、微室培养 4. 条件化培养⼆. 细胞悬浮培养（⼀）悬浮培养的⽅法1、分批培养（细胞的⽣长周期）2、半连续培养3、连续培养——封闭型、开放型（化学、浊度恒定式）4、固定化培养（⼆）培养细胞的同步化1. 化学⽅法(饥饿法、抑制法、有丝分裂抑制法）2. 物理⽅法（分选、低温）（三）培养基振荡⼀、单细胞培养（⼀）单细胞的分离1.机械法: Ball(1965)⾸次由花⽣成熟叶⽚利⽤机械的⽅法使叶⾁细胞得到分离的技术。
⑴⼑⽚刮: 取下叶⽚→叶⽚消毒(75%酒精或7%次氯酸钠)→撕去下表⽪(露出叶⾁细胞) →⽤解剖⼑刮下细胞→单细胞悬浮培养⑵研磨离⼼法: 取下叶⽚→叶⽚消毒(75%酒精或7%次氯酸钠) →研磨匀浆(10g叶⽚+40ml研磨介质)→匀浆过滤(细纱布) →离⼼(先低速去碎屑) →游离细胞沉降到底部(净化细胞) →植株培养或悬浮培养研磨介质: 20µmol蔗糖+ 10µmol MgCl2 + 20µmol Tris-HCl (pH7.8)机械法的特点：⑴细胞不受酶的伤害；⑵不发⽣质壁分离。
植物组织培养(精)
• 根据培养目的和取材大小可分为微茎尖培养和普通 茎尖培养。微茎尖指带有1-2个叶原基的生长锥，其 长度不超过0.5mm。普通茎尖指较大的茎尖(如几 mm到几十mm)、芽尖及侧芽。
• 特点：技术简单，操作方便，茎尖容易成活，成苗 所需时间短。
• 培养条件：培养基，激素，环境因 Nhomakorabea。 • 诱导结果：在不同培养基中可得到花芽、营养芽、
根或愈伤组织。
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“胚胎发生丛(EC)”或胚性愈伤组织；生长迅速， 通常在黑暗或弱光下进行。
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愈伤组织
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三.植物薄层组织培养
• 薄层组织培养：是指对植物的薄细胞层组织进行 离体培养的技术。
• 外植体材料：薄细胞层（ 一般3~6层），在适宜 条件下，可以获得不同的器官。 如烟草花序轴3~6层表皮及表皮下细胞组成的薄壁 组织。
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茎尖离体培养后，可能会出 现的反应：
① 生长太慢； ② 生长过旺，愈伤增多； ③ 生长正常；
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二.植物愈伤组织培养
• 愈伤组织培养：是指诱导植物外植体产生无序生 长的薄壁细胞及对其培养的技术。
• 产生原因：经过灭菌或切割后，在适当的环境下 产生的。
• 一般薄壁细胞和形成层易形成愈伤组织。 • 特点：或疏松或致密；颜色不一；可形成一些
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• 茎尖培养广泛应用于种苗快速繁殖，脱毒 苗的生产，品种改良和基础理论研究。快 速繁殖可取数毫米大小，脱毒苗培育要求 取小于1mm的茎尖。
为什么茎尖培养可用于脱毒苗的生产？ 原因：病毒在植物体内分布的不均一性；
植物组织培养(1)
0.1.3 植物组织培养的研究类型和任务
• 组织培养：分生组织、形成层组织、薄壁组织、韧皮部组 织等。
• 器官培养：根、茎、叶、花、果实、种子。 • 胚胎培养：幼胚、成熟胚、胚乳、胚珠、子房等。 • 细胞培养：单细胞或较小细胞团，如性细胞、叶肉细胞、
1. Thimann和Wickson
• 1958年，他们发现腋芽（当顶芽存在时为休眠状态） 的生长，可以通过外源细胞分裂素的应用而启动。这 样，将茎段培养在含有细胞分裂素的培养基上，就可 以在一个具有完整顶芽的生长中的茎上诱导侧芽的形 成。这将消除顶端优势，得到大量不定芽。
Thimann
2. Morel－脱毒、快繁商业化
• 1922 年 ， 植 物 离 体 组 织 培 养 取 得 了 一 些 进 展 。 德 国 人 Kotte和美国人Robbins两人同时分别独立地将分生组织作 为外植体。Kotte研究切下的根尖，如豌豆、玉米根尖， 将它们放在含有Knop溶液盐成分、葡萄糖、含氮化合物 如天冬酰氨酸、丙氨酸以及肉汁的各种营养液中。Kotte 观察到根尖生长持续了2周，但他没有进行继代培养。另 一方面Robbins通过继代，将玉米根尖离体培养了更长的 时间，但随着时间延长，生长量减少，最后消失。
• 1952年， Morel和Martin提出了植物脱毒（virus free）技 术，通过分离已被病毒感染的大丽花个体的根尖，并将其 离体培养，重新获得了无病毒的大丽花。
• 1960年，Morel利用兰花茎尖培养，实现了脱毒和快速繁殖 （rapid clone propagation）的两个目的。这一技术导致欧 洲、美洲和东南亚许多国家“兰花工业”的兴起。
0.2 植物组织培养的形成和发展
植物组织培养(全)
胚培养是器官培养的一种。选用的外植体是成熟或未成熟的胚进行离体无菌培养。其具体方法是将取出放在液体或固体培养基上培养，由于胚包含在胚珠和子房里，因而进行胚胎培养时，常常是将胚珠和子房放在培养基上培养。
胚培养用途：1.拯救胚2.研究胚的发育营养研究3.一些特殊的领域的研究。
(4)细胞和原生质体培养
二是要给予它们适当的刺激，即给予它们一定的营养物质，并使它们受到一定的激素的作用。
全能性体现的两个过程
一个已分化的细胞要表现它的全能性，必须经历两个过程，即首先要经历脱分化过程，然后再经历再分化过程。
再分化的过程有两种方式：
一是器官发生方式 二是胚胎发生方式
2.激素（植物生长调节剂）调控
后来证明，激素可调控器官发生的概念对于多数物种都可适用，只是由于在不同组织中这些激素的内生水平不同，因而对于某一具体的形态发生过程来说，它们所要求的外源激素的水平也会有所不同。
⑤1958年，Wickson和Thimann指出，应用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的情况下处于休眠状态的腋芽的生长。
当把茎尖接种在含有细胞分裂素的培养基上以后，将可使侧芽解除休眠状态，而且，能够从顶端优势下解脱出来的不只是那些既存于原来茎尖上的腋芽，此外，还有由原来的茎尖在培养中长成的侧枝上的腋芽，结果就会形成一个郁郁葱葱的结构，里面包含了数目很多的小枝条，其中每个小枝条又可取出来重复上述过程，于是在相当短的时间内，就可以得到成千上万的小枝条。当把这些小枝条转够到另外一种培养基上诱导生根以后，即可移植于土壤中。
奠基阶段（从20世纪30年代中至20世纪50年代末）
30年代中期，植物组织培养领域两个重要的发现，其一是认识了B族维生素对植物生长的重要意义；二是发现了生长素--一种天然的生长调节物质。
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植物组织培养
1.简述植物组织培养的基本技术。
（10分）
答：植物的组织培养）技术是指利用细胞全能性和植物生长调节物质对于植物细胞组织的分化和决定具有关键性作用，分离一个或数个体细胞或植物体的一部分在无菌条件下培养的技术。
通常我们所说的广义的组织培养，是指通过无菌操作分离植物体的一部分(即外植体)，接种到培养基上，在人工控制的条件进行培养，使其生成完整的植株。
2.简述植物组织培养的主要障碍、发生原因及防治措施。
（10分）
植物组织培养的主
要障碍
发生的原因防治措施
褐变1)材料的基因型差异
2)材料的生理状态
3)培养基成分
4)其他因子的影响（培养时间
的长短等）1.选择适当的外植体
和培养条件
2.抗氧化剂和抑制剂
的作用
3.其他防止褐变的措
施（连续转移或预
处理等）
玻璃化 1.玻璃化苗的形态学，解剖学
特征1.选择适当的外植体
2.改善培养基组成
2.玻璃花苗的生理生化特点
3.外植体
4.培养环境条件
5.培养成分
3.改善培养条件
遗传的稳定性自身的遗传特性选择合适的外植体
控制好培养条件
污染污染的来源（材料的本身，由
外界环境侵入）1)供体材料的选择
（选择健康，无病
毒的植株）
2)培养物的检验
3)合理的扩繁程序
4)严格的无菌操作
规程
3.组培苗生长环境有何特点？如何提高其移栽成活率？（10分）
组培苗生长环境特点:组培苗水分散失较快，易于萎蔫。
吸水能力较弱。
所以导致环境有了极大的改变：湿度降低、光照增强、温度升高、温差变大。
具以上特点的组培苗，在此环境下，叶片失水较严重，根系吸水能力不足，即吸水量小于蒸腾水量，从而造成植物萎蔫，炼苗失败。
另一种情况是，空气温度上升要比基质温度上升快，而根系的吸水能力在一定范围内与温度是成正比的，当气温升高时，加之湿
度较低，叶片蒸腾急速增加，此时基质温度上不去，根系吸水能力不够，造成蒸腾大于吸水的失衡状态，从而萎蔫死亡。
提高移栽成活率措施：一方面提高出瓶苗的质量，提高其抗逆性，生根前的壮苗、理想的生根配方和生根培养环境的调控是关键；另一方面就得有针对组培苗特点创造一个适宜的炼苗环境，比如保证空气湿度，平衡空气和基质的温度平衡关系等。
4.生长素类和细胞分裂素类调节剂在组培中有哪些生理作用？在快速繁殖的起始、芽增殖及生根培养阶段应如何使用它们？（10分）
培养中生长素一方面用于诱导愈伤组织的形成和生根，另一方面是与一定量的细胞分裂素配合使用共同诱导不定芽的分化，侧芽的萌发与生长以及某些植物胚状体的诱导。
在植物组织培养中的细胞分裂素的主要功能是促进细胞的分裂和分化，打破顶端优势，诱导芽的分化和增殖，促进组织和器官的不定芽发育。
当培养基中的细胞分裂素与生长素的比例高时，诱导芽的分化，反之，诱导根的分化。
快速繁殖的起始阶段：培养基中加入适量的生长素和细胞分裂素类
芽增殖阶段：向培养基中加入较多的细胞分裂素类的物质促进芽的分化
生根培养阶段：向培养基中加入较多的生长素类物质促进根的分化
5.通过组织培养的哪些途径可以生产大量苗木？技术路线是怎样的？最常用的是哪条途径？（10分）
培养苗木及次生代谢物的手段培养对象
植物器官培养 . 离体根，离体的茎尖，离体叶或离
体的茎。
分生组织培养凡是有分化能力的细胞都可以
植物胚胎培养离体胚
植物细胞培养（悬浮培养，细
具有活性的细胞和细胞小聚体
胞悬浮培养，细胞培养等）
植物微繁技术外植体
培养新品种的手段培养对象
植物细胞培养（悬浮培养，细
具有活性的细胞和细胞小聚体
胞悬浮培养，细胞培养等）
植物原生质体培养去了细胞壁的有活性的细胞
原生质体融合原生体
植物花药和花粉培养植物有活性的花粉和花药
6.影响植物组织培养成功的因素有哪些？请分别说出下列配方的主要目的。
（10分）
答：影响植物组织培养成功的因素：
1.实验室要合适，要很好的控制好光照，湿度和温度。
2.培养材料及所需要的实验用具要洗净，严格的消毒灭菌。
3.培养基配置技术要合理，要注意调溶液的PH等（如：如果要培养长根的话，可以适当的加大生长素的浓度）
4.注意无菌操作技术
实验操作是要注意无菌操作（操作幅度不要过大，手要消毒彻底等）5.外植体的选择（同一植物不同部位的细胞活性不同，一般植物鲜嫩的部位比较好，比如说茎尖。
像木质部就不合适。
）
6.各种激素类物质的配合比例要合适。
各种配方作用;
①MS+NAA0.2mg/L+6-BA0.5mg/L
②MS大量+MS微量
③MS+NAA2.0mg/L+KT0.5mg/L
④MS+2,4-D0.2mg/L+KT0.5mg/L
⑤MS+NAA0.2mg/L+6-BA1.0mg/L
⑥MS+NAA2.0mg/L+KT1.0mg/L
7.利用组织培养的哪些技术可以培育新品种、新种质？培养对象分别是什么？（10分）
培育新品种技术：
（1）植物组织培养的快速繁殖
（2）脱毒（组织培养无病毒苗的方法已在很多作物的常规生产上得到应用，如马铃薯，甘薯，草莓，苹果，香石竹，菊花等。
）
（3）体细胞无性系变异和新品种培育
（4）单倍体育种（花药、花粉的培养在苹果、柑橘、葡萄、草莓、石刁柏、甜椒、甘蓝、天竺葵等约20种园艺植物得到了单倍体植株。
（5）种质保存（6）遗传转化
组织培养对象：组织或愈伤培养、器官培养、植株培养、细胞和原生质体培养等。
8.某地区的一种马铃薯经多年种植后，植株变得矮小，产品和品质下降，请用所学植物组织培养知识分析原因，并设计一个解决方案。
（10分）
原因：几乎所有的栽培植物都发现感染甚至几种病毒，大部分的病毒属于RNA病毒，病毒对植物的生长发育产生不良的影响，常常会导致植物矮小，产量和品质的下降。
解决方案：（分生组织培养脱毒法）
1.分生组织的分离
从大田中取健壮的植株的顶芽或萌发芽，带回实验室除去可见叶，材料清洗干净。
用75%酒精漂洗，在用20倍的次氯酸钠消毒8-10分钟，无菌水冲洗3次，然后在无菌操作室进行无菌操作。
切下生长点转入合适的培养基进行培养。
2.培养
茎尖分生组织分离后转入到琼脂培养基上于25℃-27℃条件下进行光培养。
3.建立无性繁殖体系
利用生长点培养无毒苗的成活率和脱毒率都非常低，培养出来的
新苗要进行鉴定，鉴定无毒后再用新苗的茎尖再进行培养新苗。
4.脱毒苗试管株的移栽和品种特性鉴定
将试管苗移栽到土壤中，这个转变要有一个逐渐锻炼适应。
9.现有MS培养基母液6瓶，母液1为50倍，母液2为50倍，母液3为50倍，母液4为100倍，母液,5为20倍，母液,6为200倍，激素母液有1mg/ml IAA,0.5mg/ml NAA,2mg/ml6-BA, 4mg/ml KT,以及蔗糖和琼脂若干，请利用这些材料配制2L MS+2mg/L IAA+1mg/LNAA+3mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.7%琼脂培养基，写出配制方法步骤（包括计算过程）及灭菌过程。
（10分）
答：配制方法：
配制2L的各种物质的用量如下：吸取母液的用量为：
母液1：2000ml/50=40ml 母液2：2000ml/50=40ml
母液3：2000ml/50=40ml 母液4：2000ml/100=20ml
母液5：2000ml/20=100ml 母液6：2000ml/200=10ml
激素用量：
IAA：吸取1mg/ml IAA母液4ml NAA:吸取0.5mg/ml NAA母液4ml 6-BA:吸取2mg/ml 6-BA母液3ml 蔗糖：60g 琼脂：14g
灭菌过程：
将混合的培养液加琼脂加热，到适宜的温度后调PH值为5.8后倒入培养瓶中，冷却看是否凝固，如果凝固的话放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌。
（0.1Mpa 121℃ 20分钟）灭菌之前要看灭菌锅中是否有水，如
果水不够是话要加水，灭菌好了之后，关掉电源放气，当指针指到0 Mpa时就可以打开灭菌锅的盖子，最后拿出培养瓶放好，千万不要打开瓶盖
10.简述植物无糖组培的意义及技术要点。
（10分）
答：无糖组培的意义：传统的主旨植物组织培养都使用含糖的培养基，杂菌很容易侵入培养容器并在培养基中繁殖造成污染，是造成组织培养的一大障碍。
为了防止杂菌的侵入，在组织培养中通常将培养容器完全密闭，这种方式使植物生长相对缓慢，且易出现形态及生理的异常，同时也大大提高人工费用和生产成本。
而无糖组培解决了这些问题。
无糖组培在培养基中不加入糖，只是通过提高培养空间的光照度，二氧化碳的浓度，温度和湿度，以及气流交换速度等来增强组织培养植物的光合速率，从而促进植物的增殖，生长和发育。
但是要求的环境控制设备高。
无糖组培的技术要点：
外植体的选择：带有芽或侧芽、叶或根的外植体。
要进行光合作用制造能量供自己生长。
环境的控制：提高培养空间的光照度、二氧化碳的浓度、温度和湿度以及气流交换速度。