植物组织培养
3第三章 植物组织培养简介
的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力， 的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力， 回复到分生组织状态的过程。 回复到分生组织状态的过程。
3.再分化 redifferentiation〕 3.再分化〔redifferentiation〕:
Folke Skoog(1908- )
1955年，Miller从DNA降解物中分离出6－呋喃 1955年 Miller从DNA降解物中分离出6 降解物中分离出 氨基嘌呤（激动素）， ），发现它诱导芽分化的效率比 氨基嘌呤（激动素），发现它诱导芽分化的效率比 腺嘌呤高3万倍。控制器官分化的激素模式变为激动 腺嘌呤高3万倍。控制器官分化的激素模式变为激动 生长素的比例关系 促进组培的发展。 的比例关系。 素／生长素的比例关系。促进组培的发展。
Gottlieb Haberlandt(1854-1946). He was the first to formulate clearly the principles of plant cell culture.
细胞全能性学说： 细胞全能性学说： 植物体中任何生活细胞都具有该 物种的全部遗传信息， 物种的全部遗传信息，具有相同的形态结构和一定的生理 功能。只要条件合适， 功能。只要条件合适，由一个单细胞就可以发育成为一个 新的个体。 新的个体。 该文还报道了几种植物的细胞和组织的培养实验，由 该文还报道了几种植物的细胞和组织的培养实验， 于当时的条件所限，都没有成功. 于当时的条件所限，都没有成功
第三章 植物组织培养 (tissue culture) 概述
第一节
植物组织培养的意义
植物组织培养概念(重点 重点) 一、植物组织培养概念 重点 植物组织培养理论基础(难点 难点) 二、植物组织培养理论基础 难点 植物组织培养类型(难点 难点) 三、植物组织培养类型 难点 植物组织培养特点(重点 重点) 四、植物组织培养特点 重点
植物组织培养
矮牵牛茎尖离体培养培养
大蒜根尖培养及植株 再生
微型月季茎段离体培养
叶诱导愈伤组织
台湾百合离体培养
菊花体细胞胚胎发生及植株再生
矮牵牛茎尖离体培养培养
牡丹成熟胚的离体培养与快速繁殖
非洲紫罗兰叶片培 养
优化培养基
无蔗糖
1%蔗糖
5%蔗糖
无BAP
BAP 0.1mg/l
BAP 5.0mg/l
无NAA
种质资源的离体保存
体细胞无性系变异筛选
花粉、花药培养产生单倍体植株
幼胚拯救克服远缘杂交障碍
用于基因工程技术创造植物新种质。
3、大规模植物细胞、组织和器官培养生产次 生代谢物质；
根培养:正常根培养， 毛状根培养
4、用于植物生长发育理论研究，包括生理学、 病理学、胚胎学和细胞与分子生物学等。
1972年，Carlson等利用原生质体融合在两个烟草属中进行种间杂交。
1974年，Murashige等利用细胞分裂素诱导茎尖侧芽分枝。Zaenen和 Larebeke分别发现土壤农杆菌（Agribacterium）中的根瘤诱导的主 要成分是Ti质粒。 1978年，Melchers等进行了番茄和马铃薯的体细胞杂交。
五、植物组织培养技术的应用
1、优质种苗的快速无性繁殖： （1）无性繁殖作物及不易繁殖作物的快速繁殖
园艺植物种苗工厂化生产
兰科植物生产
A
B
C
E
F
G
花烛属植物
厥类植物
盆栽及切花植物的繁殖
珍贵树种
无菌苗快速繁殖
无菌苗驯化
组培苗驯化移栽
茎、芽和小植株的规模培养
经济植物快速繁殖
（2）通过茎尖培养生产脱毒健康种苗：如草莓、香蕉、
植物组织培养
（3）肌醇 又叫环己六醇，在糖类的相互转 化中起重要作用。 使用浓度：一般为lOOmg／L。 作用：适当使用肌醇，能促进愈 伤组织的生长以及胚状体和芽的形 成。对组织和细胞的繁殖、分化有 促进作用，对细胞壁的形成也有作 用。
（4）氨基酸 (almino acide） 作用：蛋白质的组成部分，也是一种有机氮化 合物。是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。 种类：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、 谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等 半胱氨酸及多种氨基酸的混合物（水解酪蛋白、水 解乳蛋白）等。
（11）再分化 经脱分化的组织或细胞在一定 的培养条件下可又转变为各种 不同细胞类型的能力。 （12） 分化培养 经过脱分化阶段的外植体（形 成愈伤组织），转移到另一培 养基上分化出芽（或小球茎） 或胚时，则称为分化培养，所 用的培养基为分化培养基。
（13） 增殖培养 已分化芽、小球茎或无性幼胚再继续进行增殖，即
1. 培养条件可人为控制，周年生产
植物组织培养中的植物材料完全是在人为提供的 培养基及小气候环境下生长的，摆脱了大自然中 四季、昼夜气温频繁变化及灾害性气候等外界不 利因素的影响，且条件均一、对植物生长极为有 利。因此植物组织培养不受气候和季节的限制， 可周年进行生产。
2. 生长周期短，繁殖速度快
植物组织培养可根据不同植物、不同器官、不同 组织的不同要求而提供不同的培养条件，满足其 快速生长的要求，缩短培养周期。一般20~30d就 完成一个繁殖周期.每一繁殖周期可增殖几倍到几 十倍,甚至上百倍,植物材料以几何级数增加。
3. 管理方便，可实现工厂化生产
植物组织培养是在人为的提供一定温度、光照、 湿度、营养和植物生长调节剂等条件下进行的， 不受自然界中病、虫、杂草等有害生物危害，生 产微型化、精细化、高度集约化，重复性强，便 于标准化管理和自动化控制，真正实现了种苗的 工厂化生产。与田间栽培、盆栽等相比，省去了 中耕除草、浇水施肥、病虫防治等一系列繁杂劳 动，可大大节省人力、物力及田间种植所需要的 土地。
植物组织培养概论
广义概念
人工培养植物体一 部分(即外植体 ) 生成完整植株。
愈伤组织：在离体培养过程中在人工培养基 上从外植体上长出来的，改变了它们原有的特性， 具有分生能力的能迅速增殖的无特定结构和功能 的细胞团。多在植物体切面上产生。
外植体：是指从植物体上分离下来的用于植 物组织培养的接种材料，它包括植物体的各种器 官、组织、细胞和原生质体等。
思考题：
1.什么是组织培养？组织培养的原理是什么？
2.组织培养分哪几种类型？ 3.组织培养有哪些特点？
四、植物组织培养的理论基础
细胞全能性理论
植物每一个具有 完整细胞核的体细胞， 都含有植物体的全部 遗传信息，在适当条 件下，具有发育成完 整植株的潜在能力。
植物细胞全能性的表达
分裂 细胞 分化 再 分 化 器官 分裂
组织
脱分化
已分化组织细胞
分裂 植株
植物细胞全能性的实现
• 植物的生活史：
受 精 卵 早期胚 胎发育 合 分化 子 胚 组 织 形成 器 构成 植 物 体
茎段培养成苗示意图
茎段培养成苗示意图
组织培养：为狭义的植物组织培养，是对植物体的 各部分组织进行培养，如茎尖分生组织、形成层、• 木质部、韧皮部、表皮组织、胚乳组织和薄壁组织 等等；或对由植物器官培养产生的愈伤组织进行培 养。二者均通过再分化诱导形成植株。
组织培养
愈伤组织培养 分生组织培养 薄壁组织培养 输导组织培养
团按照一定密度在液体培养基中进行培养增殖的技术。
平板培养：是指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄
层固体培养基中进行培养的技术。
看护培养：是指利用生长的愈伤组织所产生的物质
来培养单细胞或者异种愈伤组织等的方法。
微室培养：是指人工制造一个微室，将单细胞培养
植物组织培养(全)
胚培养是器官培养的一种。选用的外植体是成熟或未成熟的胚进行离体无菌培养。其具体方法是将取出放在液体或固体培养基上培养，由于胚包含在胚珠和子房里，因而进行胚胎培养时，常常是将胚珠和子房放在培养基上培养。
胚培养用途：1.拯救胚2.研究胚的发育营养研究3.一些特殊的领域的研究。
(4)细胞和原生质体培养
二是要给予它们适当的刺激，即给予它们一定的营养物质，并使它们受到一定的激素的作用。
全能性体现的两个过程
一个已分化的细胞要表现它的全能性，必须经历两个过程，即首先要经历脱分化过程，然后再经历再分化过程。
再分化的过程有两种方式：
一是器官发生方式 二是胚胎发生方式
2.激素（植物生长调节剂）调控
后来证明，激素可调控器官发生的概念对于多数物种都可适用，只是由于在不同组织中这些激素的内生水平不同，因而对于某一具体的形态发生过程来说，它们所要求的外源激素的水平也会有所不同。
⑤1958年，Wickson和Thimann指出，应用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的情况下处于休眠状态的腋芽的生长。
当把茎尖接种在含有细胞分裂素的培养基上以后，将可使侧芽解除休眠状态，而且，能够从顶端优势下解脱出来的不只是那些既存于原来茎尖上的腋芽，此外，还有由原来的茎尖在培养中长成的侧枝上的腋芽，结果就会形成一个郁郁葱葱的结构，里面包含了数目很多的小枝条，其中每个小枝条又可取出来重复上述过程，于是在相当短的时间内，就可以得到成千上万的小枝条。当把这些小枝条转够到另外一种培养基上诱导生根以后，即可移植于土壤中。
奠基阶段（从20世纪30年代中至20世纪50年代末）
30年代中期，植物组织培养领域两个重要的发现，其一是认识了B族维生素对植物生长的重要意义；二是发现了生长素--一种天然的生长调节物质。
植物组织培养技术
初代培养（ culture） 初代培养（primary culture）：指在组织 培养过程中，最初建立的外植体无菌培 养阶段。由于首批外植体来源复杂，携 带较多细菌，要对培养条件进行适应， 因此，初代培养一般比较困难。 继代培养（ subculture） 继代培养 （ subculture ） ： 在组织培养过 程中，当外植体被接种一段时间后，将 已经形成愈伤组织或已经分化根、茎、 叶、花等的培养物重新切割，转接到其 它培养基上以进一步扩大培养的过程称 为继代培养。
另一为药物和生物制品的工业生产，探索 天然药物生产工业化的途径是当前药物生产 的一个新方向，有可能用组织培养法来代替 全植物提取有效成分。组织培养应用在药学 方面的工作虽然历史不长，但发展很迅速， 它具有如下一些优点： 1．利用组织培养代替原植物的栽培以获得 所需的有效成分，达到产量高，成本低的目 的，还可节约土地。 2．除了应用于产生次生物质外，还可应用 于生物转化。例如烟草组织培养中蒂巴因去 甲基后可能生成吗啡。
目前中国已成功地将麦角菌、灵芝、猴 头菇等真菌进行工业化生产，高等植物组织 培养在工业化中的应用也正在研究。 总之，植物组织培养这一新技术在中草药 方面应用的前途是无限广阔的，它不仅有利 于探讨和阐明药用植物生理、遗传和成分生 物合成等一系列理论问题，而且一旦工业化 生产问题得到解决，将可以为防病治病做出 很大的贡献。
2 培养基的种类 MS培养基、B5培养基、White培养基、N6培养基等等。 3 培养基的配制 （1）混和培养基中的各成分 （2）融化琼脂 （3）调整pH为5.8 （4）分装 （5）灭菌 （6）放置备用
二组织培养操作的一般流程
1 2 3 4 5 6 器皿的洗涤 培养基的配制和灭菌 接种室及用具消毒 材料灭菌：70％酒精、氯化汞 接种 无菌培养
植物组织培养
植物组织培养植物组织培养：在无菌的条件下，将离体的植物材料包括器官，组织，细胞以及原生质体在人工培养基上进行培养，使其再生发育成完整植株的过程，又称植物离体培养。
细胞全能性：植物体的任何一个细胞都携带该物种的全部遗传信息，离体细胞在一定的条件下具有发育成完整植株的潜在能力。
外植体：植物组织培养中离体的植物材料，包括植物器官，胚胎、组织、细胞和原生质体。
细胞分化：导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。
脱分化：已分化成熟的植物组织或器官回复到分生状态，细胞开始分裂形成无组织结构的细胞团或愈伤组织的过程。
再分化：是指在一定条件下，脱分化形成的愈伤组织转变成为具有一定结构、执行一定生理功能的细胞团和组织、并进一步形成完整植株的过程，即从愈伤组织再生形成完整植株的过程。
愈伤组织：植物体受伤后的伤口处或在植物组织培养中外植体切口处产生的一团不定型的薄壁组织。
离体无性繁殖：根据植物细胞全能性原理，在无菌条件先短时间内形成大量植株。
玻璃化苗：在植物组培中，茎叶形成透明矮小肿胀的形态，生根能力差。
问答题：1、无菌操作是贯穿于整个组织培养过程的一门关键技术，请根据自己的体会论述如何在植物组织培养过程中做到无菌？1）取少菌的材料（春夏，中午的幼芽）2）严格灭菌3）合理安排操作程序4）无菌保存5）操作规范2、组培在生产上的应用有哪些？学好植物组培的意义？1）植物快速繁殖：增殖速度快，成本低，易于批量生成和管理。
比如利用一小块叶片或一个茎尖，一年内可繁殖出1000-100000株幼苗2）脱除病毒：植物在生长过程中几乎都要蒙受到病毒的危害，采用茎尖培养方法可以除去植物体内的病毒。
脱毒苗恢复了原有的优良种性，生长势明显增强，整齐一致。
3）培养新品种：克服远缘杂交不亲合性；克服远缘杂交的不孕性；选择细胞突变体；单倍体育种；转基因育种。
4）植物次生代谢产物生产：利用植物组织后细胞的大规模培养，可以生产一些天然有机化合物，这些次生代谢产物，往往具有一些特定的功能，对人类有重要的影响和作用。
第一章植物组织培养的基础理论与基本知识
第一章植物组织培养的基础理论与基本知识目的要求：(1) 掌握组织培养的概念和类型；(2) 掌握组织培养的特点；(3) 了解组织培养发展史；(4) 初步掌握组织培养在农业实践上的应用。
第一节植物组织培养的基本概念及类型一、植物组织培养的概念植物组织培养（tissue culture）指在无菌条件下，将离体的植物器官（如根、茎、叶、花、果、茎尖等）、组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）、细胞（如大孢子、小孢子及体细胞）以及原生质体，培养在人工控制的环境里使其再生形成完整的植株。
亦可称为无菌培养、离体培养、试管培养。
根据培养基的形态可分为固体培养和液体培养；液体培养又可分为悬浮培养、振荡培养、旋转培养等。
外植体（explant）：在植物组织培养过程中，有植物体上切取的根、茎、叶、花、果实、种子等器官以及各种组织和细胞统称为外植体。
愈伤组织：植物局部创伤后或在组织培养中，当已分化的细胞恢复了细胞分裂能力，而增殖形成的无组织结构、无器官分化的薄壁细胞团。
在组织培养中，先由外植体增殖产生，在一定条件下，对它经过一段时间培养，可能从其再分化出具一定结构及功能的器官，如根、茎、胚状体或重新形成完整的植株。
二、植物组织培养的类型1.植物培养植物培养是指幼小植株的培养。
例如兰花，兰花及兰科植物种子的发育特殊，种子成熟之后没有胚乳，需要与某些真菌共生，由真菌提供营养才能萌发，在自然条件下，萌发率很低。
早期通过人工接种真菌可使兰花种子萌发，但技术繁琐，难度较大，后来发现在人工培养基上，只要营养成分合适不需要真菌共生，兰花种子也能萌发。
以蝴蝶兰为例，由一个好的荚果播种后两个月左右可产生数万个小圆球茎，经过一个月分瓶后，就可以进行育苗，大约3个月后即可得到大量可移栽的试管苗。
无菌播种已是各个大型蝴蝶兰生产企业主要的种苗繁育技术。
2.器官培养将植物的器官如胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、花和幼果的部分组织接种在无菌培养基上进行培养，也称为植物离体培养。
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1.植物组织培养（离体培养）：是指在无菌条件下，将植物体的任何一部分，培养在人工配制的培养基上，并给予合适的培养条件，使之发育形成完整植物体的过程。
2、植物组织培养的类型（1）根据培养基的类型分为:固体培养液体培养半液半固体培养（2）根据培养材料（外植体类型）分为：植株培养器官培养组织培养原生质体培养胚胎培养细胞培养（3）按培养过程分：初代培养继代培养生根培养3、植物组织培养的一般工作流程1.准备阶段：（1）查阅资料，制定培养方案；（2）清洗组培用器皿、工具；（3）配制所需试剂和培养基；（4）试剂、培养基及器皿、工具的灭菌。
2.外植体的选择与消毒；3.初代培养；4.继代培养；5.生根培养；6.炼苗移栽4、植物细胞的全能性概念：指植物体的每个活细胞都携带有该物种的全套遗传信息，在适宜条件下，离体细胞都具有发育为一个完整植株的潜在能力。
注意：（1）活细胞（2）离体细胞（3）细胞全能性表达的难易程度取决于细胞的分化程度5、细胞全能性的强弱表现：（1）植物细胞全能性根据细胞的性质不同由强到弱：营养生长中心＞形成层＞薄壁细胞＞厚壁细胞（木质化细胞）＞特化细胞（导管等）（2）植物细胞全能性根据所处的组织不同由强到弱：顶端分生组织＞侧生分生组织＞居间分生组织＞薄壁组织＞厚角组织＞输导组织＞厚壁组织6、植物组织培养中全能性表达的条件：1.无菌条件；2.离体条件；3.一定的营养物质；4.植物生长调节物质；5.适宜的外界条件。
7、胚性细胞的特点：未分化状态；细胞具有旺盛分裂能力；具有两极性8、脱分化：指在一定条件下，已分化成熟的细胞、组织或器官恢复到未分化的分生状态，并进行细胞分裂形成未分化的细胞团，如愈伤组织的形成过程。
9、愈伤组织形成的三个时期：（1）诱导期又称启动期（最难）。
（2）分裂期（3）分化期10、优良愈伤组织的特征：（1）具有旺盛的增殖能力；（2）容易散碎；（3）具有高度的胚性或再分化能力，便于植株再生；（4）经过长期的继代保存而不丧失胚性。
11、再分化：指一定条件下，脱分化的细胞或组织转变为具有一定结构、执行一定功能的细胞团和组织，并进一步形成完整植株的过程，即由愈伤组织再生形成完整植株的过程。
12、植物形态建成的途径——全能性的实现途径——植物分化成苗的类型（1）器官发生型（2）胚状体发生型（3）原球茎发生型（4）芽再生型13、高压蒸汽灭菌锅——湿热灭菌灭菌要求：0.105 MPa的压力下，锅内温度达121℃，保持20~30min干热灭菌：要求：160~170℃，1~2h，如有玻璃器皿则必须待温度降至50℃时，才能打开烘箱门，以防温度骤降玻璃破碎。
过滤灭菌：细菌过滤器、注射器，适用于高温高压下易分解的试剂，主要是植物生长调节物质，如IAA、GA3、ZT的灭菌。
14、培养基成分（1）.大量元素：包括：N、P、K、Ca、Mg、S、Cl等。
（2）微量元素：包括Fe，B，Mn，Cu，Zn，Mo，Co等。
15、植物生长调节剂：（1）生长素类：常用吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）（2）组培中的作用：①促进细胞伸长；②促进生根；③诱导愈伤组织的形成；（3）作用的强弱顺序：2,4-D＞NAA ＞IBA ＞IAA（4）需注意的问题：①IAA稳定性差——过滤灭菌，避光保存；②生长素与细胞分裂素（CTK）配合使用：IAA/CTK比值高，促进根的分化；IAA/CTK比值低，促进芽的分化；IAA/CTK比值适中，形成愈伤组织，不分化③2,4-D可有效诱导愈伤组织的形成，但对芽的形成具有抑制作用，且使用浓度范围较窄，稍过量对植物组织有毒害作用；④诱导分化、增殖和生根阶段一般选用IBA和NAA16、细胞分裂素（CTK）：（1）作用：①促进细胞分裂；②诱导胚状体和不定芽的分化；③抑制顶端优势，促进侧芽萌发生长，延缓离体组织衰老；④对根的生长一般起抑制作用（2）常用的细胞分裂素：6-苄基腺嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、玉米素（ZT）等。
（3）使用浓度：一般0.1~10.0mg/L17、培养基的类型及特点高盐培养基：（1）特点：无机盐含量较高，尤其是硝酸盐、铵盐、钾盐含量较高；元素平衡好，缓冲性好；微量元素和有机物质含量齐全丰富；（2）种类：MS、LS、BL、BM、ER等低盐培养基：（1）特点：无机盐含量特别低，约为MS培养基的1/4，有机物含量也低。
（2）种类：改良的White、1/4的MS培养基（3）适用范围：生根培养18、计算：欲配制1L MS＋6-BA 0.5mg/L+NAA1.0mg/L＋3%蔗糖+0.6%琼脂培养基，已知MS母液已经配制完成，其浓度分别是：大量元素10倍，微量元素200倍，铁盐100倍，有机物500倍，1.0mg/ml 6-BA，0.1mg/ml NAA。
（1）计算各种母液、蔗糖和琼脂的用量（2）叙述培养基的配制过程1.确定培养基配方及配制量；2.根据配方和配制量计算出各种母液及糖、琼脂的用量。
3.按需吸取母液、称量蔗糖和琼脂。
4.用60%-70%培养基最终容积的蒸馏水将琼脂煮溶。
5.分别加入各种母液和糖，一些不耐热的激素在灭菌后用过滤灭菌法加入。
6.加蒸馏水定容至最终容积，调PH值。
7.分装8.包扎9.瓶身上做标记10.高压灭菌：0.105 MPa，121℃，20~30min19、外植体的消毒外植体预处理：（1）适当修剪（2）流水冲洗2.70%乙醇浸泡10~30s，无菌水冲洗1次3.选择合适的消毒剂，浸泡适当时间（次氯酸钠8-10分）4.无菌水冲洗3~5次20、污染的来源（1）细菌污染症状：培养基或外植体上出现粘液状或水迹状菌斑，多呈乳白色或橙黄色，有强烈的酸臭味，多在污染后1~2天内发生。
（2）真菌污染症状：培养基或外植体表面出现绒毛状、絮状菌落，有白、黑、绿等色的菌丝(孢子)。
接种后３－５天内发生21、植物组织快繁：又称植物微繁或植物离体繁殖，是指利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，短期内获得大量遗传性一致的再生植株的方法。
22、继代培养——影响组培苗繁殖的因素1. 植物材料：植物材料增殖的难易程度：一般草本植物＞木本植物；被子植物＞裸子植物；年幼植物＞老年植物；刚分离的组织＞已继代的组织；胚＞营养体组织；芽＞胚状体＞愈伤组织23、驯化现象：在开始继代培养中需要生长调节物质的植物材料，其后在加入少量或不必加入生长调节物质就可以生长的现象。
24、壮苗和生根培养（一）壮苗的措施：1. 调节植物生长调节剂的种类和浓度：降低CTK的浓度，增加生长素或赤霉素的浓度。
如苗细弱，节间长，可添加少量多效唑（PP33）2. 改善培养条件和培养方式：（1）培养条件：高温、高湿、低光照防徒长措施：适当降温（20~25℃），增加光照强度3000LX（2）培养方式：透气（二）生根培养：1. 试管内生根：组培苗生根的优劣主要体现在根系质量（粗度、长度）和根系数量两个方面：根较粗，长度适中，根多——优质根相较于粗而少和细而多，则后者相对于较好。
25、炼苗定义：移栽前，通过增强光照和改变空气湿度等措施，对组培苗进行提高其适应能力的锻炼，使植株生长粗壮，并慢慢适应外界环境，这个过程称为驯化或炼苗。
26、1. 褐变：培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基和外植体逐渐变褐而死亡的现象。
2.褐变的原因：外植体从切口向外释放酚类物质，在多酚氧化酶的作用下，酚类物质被氧化为褐色的醌类物质。
3.影响褐变的因素（1）植物基因型木质化程度越高越易褐变（2）外植体的影响外植体部位：幼嫩的茎尖褐变轻取材时间：春、秋季取材褐变轻外植体的生理状态：老化程度越高，木质素含量越高，褐变越严重外植体大小：易褐变的植物外植体越小，褐变越严重外植体的切割：切口越大，褐变越严重（3）培养基：无机盐浓度过高会使褐化程度增加；细胞分裂素水平过高褐变严重（4）培养条件：光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可加速被培养的外植体的褐变程度。
减轻褐变现象发生的方法（1）合适的外植体：选择生长旺盛的外植体、生于遮阴处、侧枝的顶芽。
（2）合适的培养条件：合适的无机盐成分、温度，采取暗培养或弱光下培养可有效降低褐变现象的发生。
（3）添加褐变抑制剂和吸附剂：使用半胱氨酸、抗坏血酸，0.1%～0.5%的活性炭（4）连续转移27、1.玻璃化：组培过程中组培苗呈透明或半透明水渍状的过度含水的现象。
属于生理失调症。
危害症状：试管苗生长缓慢繁殖系数下降生根率下降移栽成活率下降2.玻璃化产生的原因；组培苗C、N代谢和水分代谢发生生理异常引起的，即植物细胞分裂和增大的速度超过了干物质的积累过程。
3.影响玻璃化苗发生的因素⏹培养基成分：氮含量，尤其是NH4+含量高；⏹植物生长调节剂：高浓度的CTK增加玻璃化苗发生的比例；⏹培养条件：长时间的高温、高湿、弱光培养易发生玻璃化.玻璃化现象的预防措施①增加蔗糖和琼脂用量，降低培养基的水势；②采用通透性较好的容器进行培养；③减少培养基中含氮化合物的用量，尤其是铵态氮；④降低培养温度，进行变温培养或40℃热击处理；⑤降低细胞分裂素用量⑥增加光照⑦添加生长抑制剂28、茎尖分生组织培养脱毒的原因1、病毒在植物体内通过维管组织传播，但茎尖分生组织中无维管组织，病毒转移困难；2、病毒通过胞间连丝移动速度很慢，其速度远远低于茎尖分生组织细胞分裂的速度，因此茎尖或根尖等分生组织几乎不含病毒或浓度很低。
3、茎尖分生组织中含有高浓度的生长素，可抑制病毒的增殖。
29、茎尖剥离和接种将已消毒的芽放在带滤纸的培养皿上—器械固定—解剖镜下剥去幼叶—切下带1-2个叶原基的生长点（0.2-0.5mm）—切下的茎尖转至培养基上（顶部向上）。
注意：为提高成活率，暴露时间越短越好；无菌水湿润无菌滤纸后解剖。
30、接种后生长与调节的方法（1）生长正常：生长点伸长，无愈伤组织形成，1-3周形成小芽，4-6周长成植株（2）生长停止：原因为剥离时茎尖受损（3）生长缓慢：茎尖转绿，但增长缓慢原因：培养条件不适合（4）生长过速：茎尖基部形成大量愈伤组织，可降低培养温度，调整培养基中激素的用量31、热处理脱毒原理一些病毒对热不稳定，在高于常温的温度下（35-40度）即钝化失活。
2.脱毒方法（1）温汤浸渍（2）热空气处理。