植物组织培养

1.植物组织培养（离体培养）：是指在无菌条件下，将植物体的任何一部分，培养在人工配制的培养基上，并给予合适的培养条件，使之发育形成完整植物体的过程。

2、植物组织培养的类型

（1）根据培养基的类型分为:

固体培养液体培养半液半固体培养

（2）根据培养材料（外植体类型）分为：

植株培养器官培养组织培养原生质体培养胚胎培养细胞培养

（3）按培养过程分：

初代培养继代培养生根培养

3、植物组织培养的一般工作流程

1.准备阶段：（1）查阅资料，制定培养方案；（2）清洗组培用器皿、工具；

（3）配制所需试剂和培养基；（4）试剂、培养基及器皿、工具的灭菌。

2.外植体的选择与消毒；

3.初代培养；

4.继代培养；

5.生根培养；

6.炼苗移栽

4、植物细胞的全能性概念：指植物体的每个活细胞都携带有该物种的全套遗传信息，在适宜条件下，离体细胞都具有发育为一个完整植株的潜在能力。

注意：（1）活细胞（2）离体细胞（3）细胞全能性表达的难易程度取决于细胞的分化程度

5、细胞全能性的强弱表现：

（1）植物细胞全能性根据细胞的性质不同由强到弱：营养生长中心＞形成层＞薄壁细胞＞厚壁细胞（木质化细胞）＞特化细胞（导管等）

（2）植物细胞全能性根据所处的组织不同由强到弱：顶端分生组织＞侧生分生组织＞居间分生组织＞薄壁组织＞厚角组织＞输导组织＞厚壁组织

6、植物组织培养中全能性表达的条件：

1.无菌条件；

2.离体条件；

3.一定的营养物质；

4.植物生长调节物质；

5.适宜的外界条件。

7、胚性细胞的特点：未分化状态；细胞具有旺盛分裂能力；具有两极性

8、脱分化：指在一定条件下，已分化成熟的细胞、组织或器官恢复到未分化的分生状态，并进行细胞分裂形成未分化的细胞团，如愈伤组织的形成过程。

9、愈伤组织形成的三个时期：

（1）诱导期又称启动期（最难）。（2）分裂期（3）分化期

10、优良愈伤组织的特征：

（1）具有旺盛的增殖能力；（2）容易散碎；（3）具有高度的胚性或再分化能力，便于植株再生；（4）经过长期的继代保存而不丧失胚性。

11、再分化：指一定条件下，脱分化的细胞或组织转变为具有一定结构、执行一定功能的细胞团和组织，并进一步形成完整植株的过程，即由愈伤组织再生形成完整植株的过程。

12、植物形态建成的途径——全能性的实现途径——植物分化成苗的类型

（1）器官发生型（2）胚状体发生型（3）原球茎发生型（4）芽再生型

13、高压蒸汽灭菌锅——湿热灭菌灭菌要求：0.105 MPa的压力下，锅内温度达121℃，保持20~30min

干热灭菌：要求：160~170℃，1~2h，如有玻璃器皿则必须待温度降至50℃时，才能打开烘箱门，以防温度骤降玻璃破碎。

过滤灭菌：细菌过滤器、注射器，适用于高温高压下易分解的试剂，主要是植物生长调节物质，如IAA、GA3、ZT的灭菌。

14、培养基成分（1）.大量元素：包括：N、P、K、Ca、Mg、S、Cl等。

（2）微量元素：包括Fe，B，Mn，Cu，Zn，Mo，Co等。

15、植物生长调节剂：

（1）生长素类：常用吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、

2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）

（2）组培中的作用：①促进细胞伸长；②促进生根；③诱导愈伤组织的形成；

（3）作用的强弱顺序：2,4-D＞NAA ＞IBA ＞IAA

（4）需注意的问题：

①IAA稳定性差——过滤灭菌，避光保存；

②生长素与细胞分裂素（CTK）配合使用：

IAA/CTK比值高，促进根的分化；IAA/CTK比值低，促进芽的分化；IAA/CTK比值适中，形成愈伤组织，不分化

③2,4-D可有效诱导愈伤组织的形成，但对芽的形成具有抑制作用，且使用浓度范围较窄，稍过量对植物组织有毒害作用；

④诱导分化、增殖和生根阶段一般选用IBA和NAA

16、细胞分裂素（CTK）：

（1）作用：①促进细胞分裂；②诱导胚状体和不定芽的分化；③抑制顶端优势，促进侧芽萌发生长，延缓离体组织衰老；④对根的生长一般起抑制作用

（2）常用的细胞分裂素：6-苄基腺嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、玉米素（ZT）等。

（3）使用浓度：一般0.1~10.0mg/L

17、培养基的类型及特点

高盐培养基：（1）特点：无机盐含量较高，尤其是硝酸盐、铵盐、钾盐含量较高；元素平衡好，缓冲性好；微量元素和有机物质含量齐全丰富；

（2）种类：MS、LS、BL、BM、ER等

低盐培养基：

（1）特点：无机盐含量特别低，约为MS培养基的1/4，有机物含量也低。

（2）种类：改良的White、1/4的MS培养基（3）适用范围：生根培养

18、计算：

欲配制1L MS＋6-BA 0.5mg/L+NAA1.0mg/L＋3%蔗糖+0.6%琼脂培养基，已知MS母液已经配制完成，其浓度分别是：大量元素10倍，微量元素200倍，铁盐100倍，有机物500倍，1.0mg/ml 6-BA，0.1mg/ml NAA。（1）计算各种母液、蔗糖和琼脂的用量

（2）叙述培养基的配制过程

1.确定培养基配方及配制量；

2.根据配方和配制量计算出各种母液及糖、琼脂的用量。

3.按需吸取母液、称量蔗糖和琼脂。

4.用60%-70%培养基最终容积的蒸馏水将琼脂煮溶。

5.分别加入各种母液和糖，一些不耐热的激素在灭菌后用过滤灭菌法加入。

6.加蒸馏水定容至最终容积，调PH值。

7.分装8.包扎9.瓶身上做标记10.高压灭菌：0.105 MPa，121℃，20~30min

19、外植体的消毒

外植体预处理：（1）适当修剪（2）流水冲洗2.70%乙醇浸泡10~30s，无菌水冲洗1次

3.选择合适的消毒剂，浸泡适当时间（次氯酸钠8-10分）

4.无菌水冲洗3~5次

20、污染的来源

（1）细菌污染

症状：培养基或外植体上出现粘液状或水迹状菌斑，多呈乳白色或橙黄色，有强烈的酸臭味，多在污染后1~2天内发生。

（2）真菌污染症状：培养基或外植体表面出现绒毛状、絮状菌落，有白、黑、绿等色的菌丝(孢子)。接种后３－５天内发生

21、植物组织快繁：又称植物微繁或植物离体繁殖，是指利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，短期

内获得大量遗传性一致的再生植株的方法。

22、继代培养——影响组培苗繁殖的因素

1. 植物材料：植物材料增殖的难易程度：一般草本植物＞木本植物；被子植物＞裸子植物；年幼植物＞老

年植物；刚分离的组织＞已继代的组织；胚＞营养体组织；芽＞胚状体＞愈伤组织

23、驯化现象：在开始继代培养中需要生长调节物质的植物材料，其后在加入少量或不必加入生长调节物质就可以生长的现象。

24、壮苗和生根培养

（一）壮苗的措施：

1. 调节植物生长调节剂的种类和浓度：降低CTK的浓度，增加生长素或赤霉素的浓度。如苗细弱，节间长，可添加少量多效唑（PP33）

2. 改善培养条件和培养方式：

（1）培养条件：高温、高湿、低光照

防徒长措施：适当降温（20~25℃），增加光照强度3000LX

（2）培养方式：透气

（二）生根培养：

1. 试管内生根：组培苗生根的优劣主要体现在根系质量（粗度、长度）和根系数量两个方面：根较粗，长度适中，根多——优质根相较于粗而少和细而多，则后者相对于较好。

25、炼苗定义：移栽前，通过增强光照和改变空气湿度等措施，对组培苗进行提高其适应能力的锻炼，使植株生长粗壮，并慢慢适应外界环境，这个过程称为驯化或炼苗。

26、1. 褐变：培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基和外植体逐渐变褐而死亡的现象。

2.褐变的原因：外植体从切口向外释放酚类物质，在多酚氧化酶的作用下，酚类物质被氧化为褐色的醌类物质。

3.影响褐变的因素（1）植物基因型木质化程度越高越易褐变

（2）外植体的影响外植体部位：幼嫩的茎尖褐变轻取材时间：春、秋季取材褐变轻外植体的生理状态：老化程度越高，木质素含量越高，褐变越严重

外植体大小：易褐变的植物外植体越小，褐变越严重

外植体的切割：切口越大，褐变越严重

（3）培养基：无机盐浓度过高会使褐化程度增加；细胞分裂素水平过高褐变严重

（4）培养条件：光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可加速被培养的外植体的褐变程度。

减轻褐变现象发生的方法

（1）合适的外植体：选择生长旺盛的外植体、生于遮阴处、侧枝的顶芽。

（2）合适的培养条件：合适的无机盐成分、温度，采取暗培养或弱光下培养可有效降低褐变现象的发生。（3）添加褐变抑制剂和吸附剂：使用半胱氨酸、抗坏血酸，0.1%～0.5%的活性炭

（4）连续转移

27、1.玻璃化：组培过程中组培苗呈透明或半透明水渍状的过度含水的现象。属于生理失调症。

危害症状：试管苗生长缓慢繁殖系数下降生根率下降移栽成活率下降

2.玻璃化产生的原因；组培苗C、N代谢和水分代谢发生生理异常引起的，即植物细胞分裂和增大的速度超过了干物质的积累过程。

3.影响玻璃化苗发生的因素

?培养基成分：氮含量，尤其是NH4+含量高；

?植物生长调节剂：高浓度的CTK增加玻璃化苗发生的比例；

?培养条件：长时间的高温、高湿、弱光培养易发生玻璃化

.玻璃化现象的预防措施

①增加蔗糖和琼脂用量，降低培养基的水势；

②采用通透性较好的容器进行培养；

③减少培养基中含氮化合物的用量，尤其是铵态氮；

④降低培养温度，进行变温培养或40℃热击处理；

⑤降低细胞分裂素用量

⑥增加光照

⑦添加生长抑制剂

28、茎尖分生组织培养脱毒的原因

1、病毒在植物体内通过维管组织传播，但茎尖分生组织中无维管组织，病毒转移困难；

2、病毒通过胞间连丝移动速度很慢，其速度远远低于茎尖分生组织细胞分裂的速度，因此茎尖或根尖等分生组织几乎不含病毒或浓度很低。

3、茎尖分生组织中含有高浓度的生长素，可抑制病毒的增殖。

29、茎尖剥离和接种

将已消毒的芽放在带滤纸的培养皿上—器械固定—解剖镜下剥去幼叶—切下带1-2个叶原基的生长点（0.2-0.5mm）—切下的茎尖转至培养基上（顶部向上）。

注意：为提高成活率，暴露时间越短越好；无菌水湿润无菌滤纸后解剖。

30、接种后生长与调节的方法

（1）生长正常：生长点伸长，无愈伤组织形成，1-3周形成小芽，4-6周长成植株

（2）生长停止：原因为剥离时茎尖受损

（3）生长缓慢：茎尖转绿，但增长缓慢

原因：培养条件不适合

（4）生长过速：茎尖基部形成大量愈伤组织，可降低培养温度，调整培养基中激素的用量

31、热处理脱毒原理一些病毒对热不稳定，在高于常温的温度下（35-40度）即钝化失活。

2.脱毒方法

（1）温汤浸渍（2）热空气处理