抗体分离纯化技术
抗体纯化的基本流程
抗体纯化的基本流程一、引言抗体是一种特殊的蛋白质，可以识别并结合到特定的抗原上。
在生物医学研究中，抗体被广泛应用于诊断、治疗和基础研究等领域。
抗体纯化是制备高纯度抗体的重要步骤之一，本文将介绍抗体纯化的基本流程。
二、前期准备1.选择适当的来源：根据需要选择合适的来源，如小鼠、兔子等。
2.免疫原制备：根据需要制备相应的免疫原。
3.动物免疫：将免疫原注射到动物体内进行免疫。
三、收集血清1.采集血液：在动物免疫后，采集相应量的血液。
2.离心分离血清：将采集到的血液离心分离出血清。
四、初步纯化1.蛋白A亲和层析：将血清通过蛋白A亲和层析柱进行初步纯化。
蛋白A是与IgG亚类结合较紧密的亲和素。
2.洗脱：通过改变pH值或盐浓度等条件，将与蛋白A柱结合的IgG 洗脱下来。
五、中期纯化1.离子交换层析：将初步纯化后的IgG通过离子交换层析柱进行中期纯化。
选择适当的离子交换树脂，使得IgG可以被结合并随后洗脱。
2.洗脱：通过改变盐浓度或pH值等条件，将与离子交换树脂结合的IgG洗脱下来。
六、后期纯化1.凝胶过滤层析：将中期纯化后的IgG通过凝胶过滤层析柱进行后期纯化。
选择适当的凝胶过滤树脂，使得IgG可以在某一分子量范围内被分离出来。
2.洗脱：将分离出来的IgG进行洗脱，并进行最终检测。
七、总结抗体纯化是制备高质量抗体的重要步骤之一。
本文介绍了抗体纯化的基本流程，包括前期准备、收集血清、初步纯化、中期纯化和后期纯化等步骤。
在实际操作中，应根据具体情况选择适当的方法和条件，以获得高纯度的抗体。
抗体纯化方法
抗体纯化方法1. 引言抗体是一类免疫蛋白，具有识别和结合特定抗原的能力。
在生物医学研究和临床应用中，纯化高质量的抗体是非常重要的。
抗体纯化方法可以去除杂质，提高抗体的纯度和活性，从而提高其应用效果。
本文将介绍几种常见的抗体纯化方法。
2. 凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法是一种基于分子大小的纯化方法。
该方法利用不同孔径的凝胶过滤介质，将目标分子（如抗体）与较大分子（如蛋白质杂质）分离开来。
具体操作步骤如下：1.将含有目标抗体的混合物加入到预先平衡好的凝胶柱中。
2.使用缓冲液进行洗脱，使较大分子无法通过凝胶柱而流出。
3.目标抗体由于分子大小适中，能够通过凝胶柱被保留下来。
4.最后使用洗脱缓冲液将目标抗体从凝胶柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。
凝胶过滤层析法的优点是简单易行，不需要特殊设备，且适用于各种规模的实验室。
但其缺点是分离效率较低，只能实现较为粗略的纯化。
3. 亲和层析法亲和层析法是一种基于生物分子之间特异性相互作用的纯化方法。
该方法利用抗体与抗原之间的特异性结合来实现目标抗体的纯化。
具体操作步骤如下：1.将含有目标抗体的混合物加入到预先包含特异性结合配体（如蛋白A、蛋白G等）的亲和层析柱中。
2.目标抗体与配体之间发生特异性结合。
3.使用洗脱缓冲液将非特异结合的组分洗脱掉。
4.最后使用洗脱缓冲液将目标抗体从亲和层析柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。
亲和层析法具有高选择性和高效率的优点，能够得到高纯度的抗体。
但其缺点是需要特定的亲和剂和配体，成本较高。
4. 离子交换层析法离子交换层析法是一种基于生物分子表面电荷的纯化方法。
该方法利用目标抗体与离子交换柱中固定的离子之间的相互作用来实现纯化。
具体操作步骤如下：1.将含有目标抗体的混合物加入到预先平衡好的离子交换柱中。
2.使用缓冲液进行洗脱，使与固定离子相同电荷的分子无法通过离子交换柱而流出。
3.目标抗体由于表面电荷不同，能够通过离子交换柱被保留下来。
4.最后使用洗脱缓冲液改变pH或盐浓度等条件，将目标抗体从离子交换柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。
免疫学研究中的免疫细胞分离和纯化技术
免疫学研究中的免疫细胞分离和纯化技术免疫学研究是现代生物医学领域的一个重要分支，它研究的是人类和动物身体对各种病原微生物、异物和肿瘤细胞的防御反应。
在免疫系统中，免疫细胞是起关键作用的细胞类型。
它们能够识别和灭杀感染体和变异细胞，调节和模拟免疫反应，从而维持机体的免疫平衡。
因此，为了更好地研究免疫学的各个方面，对免疫细胞进行有效的分离和纯化是非常重要的。
免疫细胞的分离和纯化技术主要有以下几种：一、梯度离心分离法梯度离心分离法是采用密度梯度离心分离免疫细胞的方法。
具体步骤是将单个样品分离成不同的浓度梯度，并将样品均匀地添加在内层管子上，然后进行离心分离。
通过分析分离后的离心上清液中各种细胞类型的分布情况，可得到高纯度的特定免疫细胞。
该方法具有简单、快速、操作简单等优点。
二、单克隆抗体柱纯化法单克隆抗体柱纯化法是使用和特定抗体相结合的高亲和性蛋白质固相柱进行免疫细胞分离和纯化的方法。
该方法是将单个样品进行混合，将混合物通过配对的特定抗体柱，将目标细胞捕获和结合。
然后用缓冲液除去不结合的细胞，然后逐步提高pH、浓度等条件进行脱附和纯化。
该方法可以获得高纯度特定细胞的纯度，但需要对抗体进行结合实验，需要一些特殊的仪器和设备。
三、磁珠分离法磁珠分离法是将磁性珠子通过表面结合蛋白并与目标细胞结合的方法实现免疫细胞的分离和纯化的方法。
目前，该方法是免疫学研究分离和纯化细胞的主要方法之一。
该方法具有结合力强、纯度高、高通量、实时观察和可重复等特点。
然而，现有产品价格较高，因此利用磁珠结合留存的免疫抗体分子，促进自主磁珠制备已成为热门技术研究领域。
四、流式细胞术流式细胞术是一种使用单胞悬液通过免疫表型分析和单细胞相关性分析的方法。
该技术是通过将免疫细胞进行标记，然后将其通过流式细胞术仪器进行检测和分析，以实现细胞分离和分析的方法。
流式细胞术是高分析刻度，可以分析更多的样品、更少的细胞、更少的步骤，同时也能够研究细胞的表面和内部组成，测定分析数据的精确性高，检测的速度快等多种优点。
抗体的分离纯化原理和测定
•
当然，表中所例举的各种色谱模式，还可以 再细分为不同的类别。在抗体的分离、纯化中， 用得最多的是离子交换色谱、凝胶色谱与亲和色 谱。 • 在以色谱技术进行抗体的分离纯化时，还应 注意柱色谱和高效液相色谱(HPLC)的区别，以便 实现对样品的最有效、最合理的分离。在通常的 柱色谱中，多使用软质凝胶或强度较好的半硬胶 为基质，填料的粒径约40-150um。
（二）盐的选择
• 蛋白质盐折常用中性盐，主要有硫酸铵、硫 酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最 广的是硫酸铵，其优点是温度系数小，溶解度大 (25℃时饱和溶解度为4.1mol/L，即767g/L)。在不 同饱和度的硫酸铵溶液内，不同蛋白质依次析出， 而且硫酸铵价廉易得，分段效果好，不容易引起 蛋白质变性。 • 硫酸铵浓溶液的pH常在4.5—5.5之间，市售 的硫酸铵还常含有少量游离硫酸，pH往往在4.5 以下，需用氨水调节其pH至7.0左右。
• 4．温度 • 出于高浓度的盐溶液对蛋白质有一定保 护作用，盐析操作一般可在室温下进行， 但在使用某些中性盐进行盐析时，温度对 盐溶解度的影响比较明显。 • 5. 脱盐 • 蛋白质用盐析沉淀分离后，常需脱盐 才能获得纯品。最常用的脱盐方法是透析。 通过透析袋内外的离子交换，最后使透析 袋内溶液的盐浓度与外界相一致。当然， 也可以使用凝胶过滤或超滤的方法除盐。
二、膜分离技术
• 可以形象地将膜分离技术比喻成以多 孔膜进行过滤或过筛子的过程。在实际操 作时，由于膜上的孔很小，需使用一定的 压力，才能将含有待分离物质的液体驱动 通过分离膜，使具有不同分子量的物质或 通过膜、或截留于膜上而得到分离。有多 种膜技术可用于抗体的分离与纯化。
• 但最基本的是使用超滤膜。超滤膜的孔径 在1—100nm之间，其截止到分子量的范围 为几百至一百万，所需的驱动压力在0.1— 1.0MPa左右。
抗体纯化工艺
抗体纯化工艺一、引言抗体是一种重要的生物大分子，具有广泛的应用前景。
在许多领域中，如医学、生物技术和生命科学等方面都有着重要的应用。
抗体的纯化是研究和应用这些分子的基础，因此抗体纯化工艺显得尤为重要。
二、抗体纯化工艺流程1. 细胞培养及收获细胞培养是抗体制备的第一步，通常使用哺乳动物细胞系来表达目标蛋白。
细胞培养条件包括温度、CO2浓度、营养成分和培养基等。
当细胞达到最大密度时，可以进行收获。
收获后将细胞离心并取下上清液。
2. 亲和层析亲和层析是最常用的抗体纯化方法之一。
它利用特定配体与目标分子之间的亲和作用，将目标分子从混合物中选择性地吸附到固相材料上。
例如，使用含有蛋白A或蛋白G的树脂来选择性地捕捉IgG类别的抗体。
3. 尺寸排除层析尺寸排除层析是一种基于分子大小的分离方法。
它利用不同分子大小的抗体在树脂中的渗透性差异，从而实现对目标分子的纯化。
尺寸排除层析通常用于去除杂质，如细胞碎片、DNA和RNA等。
4. 离子交换层析离子交换层析是一种利用不同离子性质进行分离的方法。
在这种方法中，树脂表面上带有正负电荷的功能团能够与目标抗体中带有相反电荷的部位结合。
通过调节pH或盐浓度，可以实现目标抗体与树脂之间的选择性结合和解离。
5. 亲水性交换层析亲水性交换层析是一种基于溶液中物质亲水/疏水特性进行分离的方法。
它利用具有不同亲水性质的树脂来选择性地捕捉和纯化目标抗体。
6. 逆流色谱逆流色谱是一种高效液相色谱技术，在抗体制备中也有广泛应用。
它可以快速地分离和纯化目标抗体，并且可以在大量样品中进行高通量分析。
7. 超滤超滤是一种利用膜过滤器进行分离和纯化的方法。
它可以去除大分子杂质，如细胞碎片、DNA和RNA等，从而提高目标抗体的纯度。
三、结论抗体纯化工艺是抗体制备中不可或缺的一部分。
通过合理地设计和选择不同的纯化方法，可以实现高效、快速和经济地纯化目标抗体。
在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的工艺流程，并进行优化和改进，以提高抗体的产量和质量。
4种常用抗体分离纯化工艺介绍
4种常用抗体分离纯化工艺介绍抗体分离纯化的主要目的是将抗体与工艺相关杂质和产品相关杂质分离，最终获得高纯度、低潜在危害的抗体药物。
纯化过程中需要去除的工艺相关杂质包括细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸及培养基与加料液成分，需去除的产品相关杂质主要包括抗体片段和聚集体。
纯化过程还需具备足够的病毒灭活去除能力，以去除宿主细胞自身表达的内源病毒样颗粒和未及时发现的外源病毒。
大多数工艺利用ProteinA来捕获抗体，并利用了至少1个离子交换层析作为精纯步骤，仅少数工艺使用了疏水、羟基磷灰石和分子筛层析等步骤。
下图中显示了一个常见的抗体纯化工艺。
反应器收获液首先经过离心和过滤，去除细胞和细胞碎片，然后经过ProteinA层析捕获抗体,捕获后的抗体经低pH孵育后，通过两个离子交换层析进行精纯,然后进行病毒过滤，最后换液并调整抗体浓度，得到抗体原液。
工艺中的低pH孵育和病毒过滤是两个正交的专属病毒去除灭活步骤。
这两个专属步骤与层析步骤一起，可大大降低原液中可能存在的病毒数目。
工艺中的低pH孵育和病毒过滤是两个正交的专属病毒去除灭活步骤。
这两个专属步骤与层析步骤一起，可大大降低原液中可能存在的病毒数目。
抗体分离纯化工艺其中最常用的四种纯化方法，也就是今天的主角“四大名捕”。
我们接着往下看吧。
1、Protein A从原核金黄色葡萄球菌细胞壁分离的结合受体Protein A(~56kDa)与不同免疫球蛋白同型的Fc区以及人VH3家族的Fab区具有高度的亲缘关系。
进一步研究表明，Protein A仅限于与IgG亚类IgG1、IgG2和IgG4结合，与IgG3的反应性很低，约占总IgG的8%。
天然的Protein A有5个IgG结合结构域和未知功能的非Fc结合域，结构示意图如下：Protein A的结构域示意图此结构的Protein A大量结合IgG的同时，其非Fc结合域能结合部分杂蛋白，导致洗脱下来的IgG纯度不够，因此科学家利用基因工程的方法克隆Protein A 的基因并进行改造，得到重组型Protein A，其非特异性结合明显降低。
抗体纯化的方法有哪些
抗体纯化的方法有哪些抗体纯化是一种将杂质和其他成分从混合物中分离出抗体的过程。
采用不同的方法可以实现抗体的纯化，具体方法取决于纯化过程中抗体与其他成分之间的特定相互作用。
以下是常见的抗体纯化方法：1. 亲和层析（Affinity chromatography）：基于抗体与目标抗原之间的高特异性结合作用。
可以使用结合在固定支持介质上的目标抗原来精确地捕获抗体。
2.蛋白A、蛋白G和蛋白L亲和层析：这些层析方法基于蛋白质和抗体之间的亲和性。
蛋白A、蛋白G和蛋白L是一类结合在细菌细胞壁上的蛋白质，它们与抗体Fc区域的不同部位结合，因此可以用于从混合物中富集抗体。
3. 离子交换层析（Ion exchange chromatography）：基于抗体与离子交换基质之间的相互作用来实现分离纯化。
通过调节溶液的pH值，可以控制离子交换基质上的电荷，从而实现对抗体的选择性捕获。
4. 尺寸排阻层析（Size exclusion chromatography）：通过根据抗体与其他分子的大小差异来实现分离纯化。
大分子如抗体会快速通过填充在柱内的孔隙，而较小分子则会被孔隙所限制，因此可以通过尺寸选择性地捕获和纯化抗体。
5. 亲和吸附（Affinity adsorption）：用于捕获抗体的固定介质上表面共价或非共价地固定目标抗原，然后将混合物通过固定介质，使抗体与目标抗原相互作用，并通过洗涤和再生步骤来清除杂质。
6.电泳分离：电泳是基于分子在电场中迁移速率的差异来实现纯化的方法。
通过电泳可以将抗体与其他成分分离开来。
7.沉淀和沉降：使用盐类、有机溶剂或其他物质来促使抗体的沉淀或沉降，然后可以通过离心等方法将其与上清液分离开。
8. 磷酸铵沉淀（Ammonium sulfate precipitation）：将逐渐增加浓度的磷酸铵加入混合物中，使抗体产生沉淀，在沉淀过程中可以通过离心等方法将其分离出来。
9. 过滤法（Filtration）：通过使用滤膜和适当的压力或真空来分离大分子（如抗体）和小分子。
抗体的提取与纯化
抗体的提取与纯化精制免疫球蛋白的方法很多。
一般采用综合技术，避免蛋白变性。
如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。
提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。
一、盐析法1 取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。
2置4℃，3h以上，使其充分沉淀离心（3000rpm）,20min,充上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
3 置4℃3h以上，[此时，（NH4）2SO4的饱和度为33%]重复上述第二步过程1～2次。
4 末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以0.02mol/L pH7.4 PBS溶解至xml装入透析袋。
对PBS 充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。
5 取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意（参阅本章第二节）。
二、冷酒精沉淀法分离过程如下。
血清加3倍体积的蒸馏水，调节pH至7.7(±)冷却到0℃。
在激烈搅拌的条件下，加预冷的酒精（-20℃）到最终浓度为20%，保持在-5℃。
产生的沉淀（A），含有大多数种类的免疫球蛋白。
沉淀A悬浮于25倍体积的0.15～20mol/L NaCl溶液（冷）中，加有0.05mol/L醋酸调节pH到5.1，产生的沉淀（B），包括大部分的IgA和IgM，IgG留在上清液内。
调节上清液的pH到7.4，加冷酒精（-20℃～-30℃）到最终浓度为25%，维持在-5℃。
所得到的沉淀（C）含有90%～98%IgG。
不同动物，IgG分离的条件和产量略有不同。
见表2-5。
从沉淀（B）可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物：将沉淀（B）悬浮在0℃水中，调节pH到5.1，离心去除不溶的蛋白。
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SDS-PAGE图 1.marker 2. 腹水上样 3.腹水blue柱穿透 4. 腹水blue柱洗脱 5.腹水PrA柱穿透 6. 腹水PrA柱洗脱
2.亲和纯化血浆中的抗体
重组蛋白A琼脂糖凝胶FF 柱纯化的SDS-PAGE图 1.marker 2. 血浆上样 3.和5.穿透 4.和.6 洗脱
蓝色琼脂糖凝胶FF纯化SDS-PAGE图 1.marker 2. 血浆上样 3.blue柱穿透 4. blue柱洗脱
填料：吡啶琼脂糖凝胶 FF 20ml Buffer A: 20mM PBS,0.8M Na2SO4,pH7.5 Buffer B: 20mM PBS, pH7.5 Buffer C: 20mM PBS, pH7.5,30%异丙醇
吡啶琼脂糖纯化SDS-PAGE图
1.marker 2. 粗提物 3.吡啶柱穿透 4.和 5 .吡啶柱洗脱
缺点
有失活可能，价格高，不适合所 有抗体。时间长，载量小。
最好配合沉淀的方法。 价格还是比较贵 时间长，纯度低，回收率低 效果一般，麻烦，纯度不高
亲和适合IgG纯化，效果不错，疏水和去杂质的方 法成本低，价格便宜，效率高，载量大是很适合的 纯化抗体的方法，而操作简单，具体使用什么方法 完全取决于对抗体的种类，纯度要求，自己已有条 件等因素。
3.疏水色谱纯化细胞培养样品中的抗体
1800 1500
A280(mAu)
1200 900 600 300 0 0 50 100 150 200 250 300
volume(ml)
苯基琼脂糖凝胶FF纯化抗体
填料： Phenyl sepharose FF 5ml Buffer A:50mM PBS，0.6M 硫酸铵，pH7.0 Buffer B: 50mM PBS，pH7.0 结果：洗脱蛋白量4.5mg/ml×20ml=90mg
洗脱pH 3.5-4.5 3.5-4.5 ≤7.0 3.0-6.0 4.5-6.0 3.5-5.5 3.0-4.0 3.5-5.5
二、抗体分离纯化的方法 1.亲和色谱纯化抗体
200
250 200
A280(mAu)
150பைடு நூலகம்
A280(mAu)
150 100 50 0
100
50
0 0 10 20 30
0
10
谢 谢！
20
30
重组蛋白A琼脂糖凝胶FF纯化腹水中抗体 样品：同上，上样2ml,蛋白量4.6mg 填料：rProtein A sepharose 1ml BufferA:20mM PBS，pH7.4 BufferB:0.1M 柠檬酸，pH4.0 结果：穿透8.5ml,蛋白量3.9mg 洗脱4ml,蛋白量0.6mg
5.其他纯化抗体的方法 1.离子交换法 2.类似亲和法 3.金属螯合色谱法 4.辛酸沉淀法 5.羟基磷灰石法 6.免疫亲和法
三、各种纯化的方法对比
方法名称
蛋白A和蛋白G 疏水色谱法 去杂质法 类似亲和法 沉淀法 离子交换法 羟基磷灰石法
优点
特异性好，快捷，方便。 适用范围广，成本低，配合硫酸铵 沉淀效果更好，载量高。 回收率高，活性好，时间短。 成本低，效果好，载量高 简单，低成本 简单，低成本 成本低，效果好，能分离各种亚型
抗 体 分 离 纯 化 技 术
韦 新 桂
北京韦氏博慧色谱科技有限公司
一、抗体的种类和特性
rProteinA Sepharose纯化条件
抗体类型 人抗体IgG1，IgG2 人抗体IgG3，IgG4 小鼠IgG1 小鼠IgG2a 小鼠IgG2b 小鼠IgG3 兔抗体 作用强弱 抗体类型 大鼠IgG3 马抗体 猴抗体 猪抗体 狗抗体 牛抗体 山羊抗体 作用强弱
++++
+ +
++++ +++ ++ ++++
+ ++ ++++ ++++ ++ ++ +
吸附和洗脱条件
抗体种类 人IgG1 人IgG2 人IgG3 人IgG4 小鼠IgG1 小鼠IgG2a 小鼠IgG2b 大鼠IgG3
作用强弱 ++++ ++++ + + + ++++ +++ +
吸附pH 6.0-7.0 6.0-70 8.0-9.0 7.0-8.0 8.0-9.0 7.0-8.0 ≈7.0 ≈7.0
蓝色琼脂糖凝胶FF纯化腹水中抗体 样品：腹水1.5ml，蛋白量4.6mg 填料： Blue sepharose FF，1ml BufferA：50mM KH2PO4, pH7.0 BufferB：50mM KH2PO4, 1.5M KCl， pH7.0 结果：穿透6.2ml,蛋白量2.4mg 洗脱3.7ml,蛋白量1.9mg
苯基琼脂糖凝胶FF纯化SDS-PAGE图
1.marker 2. 培养液上清 3.苯基柱 穿透 4.和5 .苯 基柱洗脱
4.疏水色谱纯化蛋黄中的抗体
400 300 200 100 0 0 50 100 150 200 250 300 350
A280(mAu)
volume(ml)
吡啶琼脂糖凝胶分离抗体