RNA的分离纯化技术
rna提取的原理
rna提取的原理
rna提取是一种用于分离和纯化RNA分子的技术。
它是基于RNA在生物体中具有碱性特性以及RNA与DNA之间的化学
差异。
首先，需要将样品（如细胞组织、细胞培养物等）收集并打碎，以释放细胞内的RNA分子。
然后，通过加入裂解缓冲液，可
以使RNA保持在溶液中而不受降解的影响。
接下来，需要加
入含有离子的溶液，如乙酸或盐溶液，以中和RNA分子的碱
性特性。
这样一来，RNA分子会以氢键和离子键的形式与溶
液中的离子结合，形成稳定的RNA-离子复合物。
为了进一步纯化RNA，可以使用酚/氯仿提取法。
该方法利用
酚的亲水特性和氯仿与酚相互不相溶的性质，将RNA-离子复
合物从其他细胞组分中分离出来。
在这个过程中，酚会与
RNA-离子复合物结合，而其他细胞组分则会保留在无机相
（如下层的氯仿相）中。
接下来，离心可将上层的RNA-酚复合物沉淀到底部。
然后，
通过加入冷酒精，可进一步沉淀和纯化RNA分子。
冷酒精中
的离子和RNA结合形成了RNA-离子复合物，这样可以使
RNA从水溶液中沉淀出来。
最后，通过离心将RNA沉淀到管底。
随后，可以使用酚/氯仿
再次提取以去除可能残留的污染物。
最终，用无脂乳状液或其他适当的溶液溶解RNA，在纯化过程完成后就可以得到纯的RNA样品了。
通过RNA提取技术，可以获得高质量的RNA分子，以用于后续的实验和研究，如逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、Northern印迹、测序等。
提取细胞中的rna的方法
提取细胞中的rna的方法提取细胞中的RNA是一项重要的实验技术，它能够帮助研究人员深入了解RNA在细胞中的生物学功能及表达调控机制。
下面将介绍几种常见的RNA提取方法。
1. TRIzol法TRIzol法是一种广泛应用于RNA提取的方法。
该方法基于TRIzol试剂对细胞或组织样品中RNA的溶解作用，通过氯仿沉淀和酒精洗涤来纯化RNA。
该方法简单易行，适用于各种类型细胞和组织，同时提取的RNA质量较好，但相对来说RNA纯度不高。
2. 磁珠法磁珠法是一种全自动化的RNA提取方法，通过使用磁性珠子将RNA 特异性结合剂捕获目标RNA，再通过磁力将磁性珠子从混合物中分离出来。
该方法操作简便，具有较高的RNA纯度和产量，且适用于从小样品中提取RNA。
3. 柱式纯化法柱式纯化法即RNA纯化柱法，基于RNA特异性结合柱将RNA捕获，由于RNA与柱子上的化学物质发生特异性亲和作用，其它核酸和蛋白质可以被去除。
该方法RNA纯度高，产量也比较可靠。
4. 整体细胞RNA提取法整体细胞RNA提取法采用混合酚（phenol）和氯仿（chloroform）作为RNA溶解和分离剂，该方法能够直接溶解细胞膜来提取细胞中的RNA。
整体细胞RNA提取法的优点在于它可以同时纯化RNA和DNA，同时提取的RNA产量较高，但RNA质量不够纯粹。
5. 分子降解法分子降解法是使用各种离子、化学物质和酶来切断RNA的方法，从而释放出RNA。
该方法适用于各种细胞和组织类型，它在纯化RNA的同时能够消除能降解和干扰RNA研究的RNA样品，提高RNA纯度。
但该方法RNA产量比较低，不适合处理大量样品。
总之，以上提取RNA的方法各有优缺点，选择哪种方法取决于实验目的、样品类型和实验条件等因素。
RNA的分离纯化技术
RNA的分离纯化技术RNA分离过程中的难点在于多数核糖核酸酶（RNA酶）都非常稳定并且活性很高，不需要任何辅助因子就能进行酶解反应。
因此，在所有RNA分离提取的操作方案中，第一步都是在能使RNA酶失活的化学环境中裂解细胞，然后才是从各种细胞分子中分离提取RNA。
一、RNA制备中的关键因素RNA制备中最关键的因素是尽量减少RNA酶的污染。
（一）去除外源RNase的污染1.避免手、唾液的污染戴口罩、手套，并经常更换（使用一次性手套）。
2.避免空气中的细菌等微生物污染在超净台中操作，工作区域应与进行普通微生物实验的区域分隔开，特别是用于细菌接种、培养基和试剂配制的区域，因为这些区域富含RNA酶。
3.玻璃器皿的处理用水清洗干净后，200℃烘烤4小时。
4.塑料用品的处理尽量使用一次性塑料制品，并用0.05%～0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）浸泡吸头及Eppendorf管过夜或37℃2小时，1.2kPa高压30分钟去除残留的DEPC。
5.溶液的配制先配0.1%DEPC过夜，然后1.2kPa高压30分钟除DEPC，用此水配液，然后用0.22μm的滤膜过滤除菌，最好使用未曾开封的试剂配制。
6.RNA电泳槽的处理先用去污剂洗涤、水清洗、乙醇干燥，再浸泡于冰H2O2溶液中放置10分钟后，用0.1% DEPC处理过的水彻底冲洗。
7.降低Rnase活性尽量在冰浴中操作。
此外，最好将RNA实验用的玻璃器皿、塑料器皿和电泳槽专用专放，标上明显的标记并放在固定位置。
（二）去除内源RNase的污染在细胞破碎的同时，Rnase也被释放出来，原则上应尽可能早地去除细胞内蛋白并加入RNase抑制剂。
1.去蛋白质试剂由于RNase为一种蛋白，故去除蛋白质的试剂可非特异地抑制RNase的活性。
（1）酚-氯仿：其作用为使蛋白质与核酸解离；另外，作为蛋白质变性剂，可以抑制RNase的活性；并且酚-氯仿联合可增强对RNase的抑制。
（2）蛋白酶K：与1%～2%的SDS合用其效果更佳。
rna纯化原理
rna纯化原理
RNA纯化是一种重要的实验步骤，目的是从混合样品中分离、纯化并富集RNA。
在进行RNA纯化的过程中，需要考虑到RNA的稳定性以及杂质的去除。
以下是一些常用的RNA纯化
方法和原理：
1. 酚/氯仿法：该方法利用RNA和DNA在酚相和水相中的差
异分配特性，将细胞裂解后的混合样品经酚酸盐处理，使
RNA富集在酚相中，而DNA和蛋白质则富集在水相中。
2. 硅胶柱层析法：该方法基于RNA与硅胶之间的结合性质，
通过将样品溶液滴入硅胶柱中，RNA会与硅胶发生结合，然
后通过洗脱步骤来去除杂质，最终得到纯化的RNA。
3. 离心过滤法（Ultrafiltration）：该方法利用超滤膜的孔径大
小来分离RNA和其他分子。
样品置于超滤膜中，通过离心加
速运动，分子会根据其大小通过膜孔，使得RNA被保留在滤
膜上，从而实现纯化。
4. 核酸磁珠法：该方法利用具有亲和性的磁珠来捕获RNA分子，然后通过磁场将磁珠与复合物分离出来，并进行洗脱步骤来去除杂质，使得RNA得到纯化。
这些方法各有优缺点，需要根据实验需求和样品特性选择最合适的方法进行RNA纯化。
在实验过程中，需要注意避免RNA 的降解，避免污染以及误差的引入，以确保最终纯化的RNA
质量和纯度的高度。
rna纯化方法及原理
rna纯化方法及原理RNA纯化是分离和提纯RNA分子的过程，常用于RNA的后续研究和应用。
本文将介绍几种常见的RNA纯化方法及其原理。
一、酚-氯仿法酚-氯仿法是一种经典的RNA纯化方法，其原理基于RNA在酚相中溶解度较低，而在氯仿相中溶解度较高的特点。
该方法主要包括细胞破碎、酚相和氯仿相的提取、RNA的沉淀和洗涤等步骤。
将待纯化的细胞破碎，释放出细胞内的RNA分子。
然后，将酚溶液加入细胞裂解液中，混合均匀。
酚与细胞裂解液中的蛋白质结合形成上层的酚相，而RNA则溶解在下层的水相中。
接着，加入等体积的氯仿，形成两层相。
RNA会从水相转移到氯仿相中。
通过离心，将RNA富集在上层的氯仿相中。
然后，将RNA沉淀下来，用乙醇洗涤去除杂质。
最后，将RNA溶解在适当的缓冲液中，即可得到纯化的RNA。
酚-氯仿法是一种简单有效的RNA纯化方法，适用于大量样品的处理，但存在RNA降解的风险。
二、硅胶柱法硅胶柱法是一种基于RNA与硅胶之间的亲和性纯化方法。
硅胶柱具有较大的比表面积和亲和力，可将RNA分子捕获在柱子上，而其他杂质则通过洗涤缓冲液的洗脱。
将待纯化的RNA样品与硅胶柱上的RNA结合缓冲液混合，使RNA与硅胶结合。
然后，将混合物加载到硅胶柱中，RNA会与硅胶发生亲和作用，结合在柱子上。
接着，通过洗脱缓冲液的洗涤，去除非特异性结合的杂质。
最后，使用洗脱缓冲液将纯化的RNA 从硅胶柱上洗脱下来。
硅胶柱法具有选择性好、纯化效果较好的优点，适用于小样本和高质量RNA的纯化，但操作较为繁琐。
三、磁珠法磁珠法是一种基于磁性珠子的RNA纯化方法。
磁性珠子表面修饰有亲和基团，可与RNA发生特异性结合，将RNA富集在磁珠上，然后通过外加磁场将磁珠与RNA分离。
将待纯化的RNA样品与磁珠上的亲和基团发生特异性结合。
然后，通过外加磁场，将磁珠与结合的RNA分离出来，形成磁珠-RNA复合物。
接着，用洗涤缓冲液洗脱非特异性结合的杂质。
最后，去除磁场，将纯化的RNA从磁珠上洗脱下来。
RNA的分离与纯化
RNA的分离与纯化包括Northern杂交在内的许多分子生物学实验均是以RNA为材料，mRNA的制备也需要一定质量的总RNA样品，RNA的数量、纯度与完整性将直接影响这些实验的结果。
RNA中rRNA的数量最多，占总量的80%～85%；tRNA及核内小分子RNA占15%～20%；mR NA仅占1%～5%。
由于各种rRNA、tRNA及核内小分子RNA的结构与功能已比较清楚，从基因克隆、表达与诊断的目的出发，目前对RNA的分离与纯化，主要集中在总RNA 与mRNA上。
一、RNA制备的条件与环境为防止RNase对RNA 的水解，一要全力避免细胞外RNase的污染并抑制其活性，二要尽快地抑制细胞内RNase的活性并极力地去除RNase。
对广泛存在的细胞外RNase，应在RNA制备的全过程中保持高度的警惕，并采取严格的措施以避免其污染和抑制其活性。
从RNA提取的初始阶段开始，就选择性地使用针对RNase的蛋白质变性剂（如酚、氯仿等有机溶剂以及强烈的胍类变性剂）、蛋白的水解酶（如蛋白酶K）和能与蛋白质结合的阴离子去污剂（如SDS、sarkosyl或脱氧胆酸钠等）并联合使用RNase的特异性抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的水解。
另外，在变性液中加入β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）等还原剂可以破坏RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。
二、总RNA的分离与纯化由于RNase的影响，为获得完整的RNA分子，就必须在总RNA分离纯化的最初阶段，尽可能快地灭活胞内RNase的活性。
在β-巯基乙醇的协同作用下，高浓度的(异)硫氰酸胍可以极大极快地抑制RNase的活性，能从胰腺等富含RNase的组织细胞中分离出完整的RNA分子，目前已成为常规使用的试剂。
pH8.0的Tris饱和酚用于DNA的制备，但在RNA纯化时，应使用pH4.5～5.5的水饱和酸性酚，这既有利于DNA的变性又有利于RNA的分离。
RNA的分离纯化技术解析
4、密度梯度离心
• 用胍盐/氯化铯将细胞抽提物进行密度 梯度离心。蛋白质密度<1.33g/cm3在最 上层。DNA密度在1.71g/cm3左右，位 于中间。RNA密度>1.89g/cm3,沉在底部。 用此方法可制备较大量纯度的天然RNA
11/1/2018
结果分析
• 分光光度法测260nm和280nm下OD 值 • Northern-Bolt杂交 • 1）甲醛-琼脂糖凝胶电泳 • 2）聚丙烯酰胺凝胶电泳 • RT-PCR检测
11/1/2018
试验流程图
细胞
氯仿 水相
细胞选择
纯化 RNA 基因组DNA
离心
贴壁细胞 悬浮细胞
加入裂解液 (TRNzol-A+)
有机相
pH5.7
11/1/2018
3、苯酚法
• 细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起， 以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要 把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含 有十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate,SDS）的缓冲液中，加等体积水饱 和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层 水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚 变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相 界面处形成凝胶层。 • 苯酚法提取酵母RNA
RNA的分离纯化技术
第四组
【实验目的】
1.了解RNA分子的种类、分布及其 结构特点 2.掌握总RNA提取的基本原理和实 验方法 3.掌握总RNA浓度检测的方法 4.掌握总RNA完整性检测的方法
11/1/2018
主要内容
• • • • RNA的概述 分离RNA的意义 总RNA的分离与纯化 结果分析
11/1/2018
植物RNA的分离纯化(LiCl沉淀法)
rRNA条带的1.5-2倍。反之，说明部分28S rRNA已经降解成 18S rRNA。若无清晰条带，则说明样品RNA已严重降解；若 加样孔内或孔附近有荧光区带，则说明有DNA污染。
【注意事项】
1．条件允许的实验室应专门辟出RNA操作区，离心机、移液 器、试剂等均应专用，RNA操作区应保持清洁，并定期行除 菌。 2．操作过程中应始终戴一次性手套，并经常更换，以防止手、 臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带到试管或污染 用具。 3．避免在操作过程中说话聊天。 4．配制溶液用的酒精、异丙醇、Tris等应采用未开封的新瓶。 5．所有旧塑料制品都必须用0.5mol/L的NaOH处理10min，用 双蒸水彻底冲洗，DEPC-H20浸泡过夜后灭菌。 6．所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下烘烤6h或更 长时间。 7．配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC在37℃处理12h以上， 然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当 用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除 菌。
16．弃去上清液，沉淀分别用70%乙醇和无水乙醇1ml洗涤，并 短暂离心。 17．小心吸去残留的乙醇，空气中凉干3min。 18．RNA用20-30l无菌水溶解，贮藏于-70℃备用。 19．RNA的浓度测定和纯度分析 取2-5lRNA溶液稀释至100l，于紫外核酸蛋白检测仪上测 定A260、A280和A320的OD值，并计算RNA浓度和得率。 注：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm，对纯的RNA来 说，OD260／OD280为2.0，1个OD260约为40g/ml RNA。 20．RNA的完整性检测 1.2%琼脂糖凝胶电泳 在紫外检测仪下观察，完整的总RNA样品应呈现三条带： 28S、18S、和5S rRNA。其中28S rRNA条带的亮度应该为18S
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
4、密度梯度离心
• 用胍盐/氯化铯将细胞抽提物进行密度 梯度离心。蛋白质密度<1.33g/cm3在最 上层。DNA密度在1.71g/cm3左右，位 于中间。RNA密度>1.89g/cm3,沉在底部。 用此方法可制备较大量纯度的天然RNA
8/15/2016
结果分析
• 分光光度法测260nm和280nm下OD 值 • Northern-Bolt杂交 • 1）甲醛-琼脂糖凝胶电泳 • 2）聚丙烯酰胺凝胶电泳 • RT-PCR检测
8/15/2016
异硫氰酸胍—酚法提取植物组织总RNA
1） 取2g左右植物组织放入研钵中，反复加入液氮充分研磨至粉末 状。加4－5mL异硫氰酸胍溶液。转移到小离心管中，每管0.5mL。 2） 置于冰上，顺序加入：50μl 2mol/L NaAc , 混匀，0.5mL水饱和酚， 170μl CI，混匀。置冰上15min。 3） 各管平衡后，4℃,12 000g离心20-30min。转移上清到另一管中， 加入等体积的异丙醇，混匀，－20℃沉淀30min-1hr或－80℃沉 淀10min。4℃,12 000g离心20min回收RNA。 4） 用70％乙醇洗一次，4℃，12 000g离心5min。吸去乙醇，空气中 吹干RNA沉淀。用150μl 异硫氰酸胍溶液，65℃吹打RNA沉淀溶解。
8/15/2016
试验流程图
细胞
氯仿 水相
细胞选择
纯化 RNA 基因组DNA
离心
贴壁细胞 悬浮细胞
加入裂解液 (TRNzol-A+)
有机相
pH5.7
8/15/2016
3、苯酚法
• 细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起， 以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要 把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含 有十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate,SDS）的缓冲液中，加等体积水饱 和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层 水相和下层酚相。核或者在两相 界面处形成凝胶层。 • 苯酚法提取酵母RNA
8/15/2016
2、TRIzol法
• TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总 RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持 RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成 水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收 集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇 沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的 DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙 醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加 入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样 品间标准化RNA的产量十分有用。
8/15/2016
RNA的分类
• 信使RNA（messengerRNA，mRNA）mRNA是合 成蛋白质的模板，按照细胞核中的DNA所转录； • 转移RNA（transferRNA，tRNA）tRNA是mRNA上 碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸 的转运者； • 核糖体RNA（ribosomalRNA，rRNA）rRNA是组 成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。 • 微小RNA（microRNA，miRNA）内源性的具有调 控功能的非编码RNA
RNA的分离纯化技术
第四组
【实验目的】
1.了解RNA分子的种类、分布及其 结构特点 2.掌握总RNA提取的基本原理和实 验方法 3.掌握总RNA浓度检测的方法 4.掌握总RNA完整性检测的方法
8/15/2016
主要内容
• • • • RNA的概述 分离RNA的意义 总RNA的分离与纯化 结果分析
8/15/2016
8/15/2016
8/15/2016
5） 加等体积异丙醇－20℃沉淀30min-1hr或－80℃沉 淀10min。4℃,12 000g离心20min回收RNA。 6） 用70％乙醇洗两次后，吹干溶于适量的DEPC－H2O 中。部分分装后进行纯度及完整性的检测。其余加 2.5倍体积乙醇沉淀于－80℃冰箱中存放。 7） 紫外分光光度分析纯度和含量，甲醛变性琼脂糖 凝胶电泳分析完整性。
异硫氰酸胍—酚法提取RNA的原理如下： GIT与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活 性；GIT与 十二烷基肌氨酸钠 （Sarcosyl） 作用使蛋白质变性，从而释放RNA；酸性条 件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性 被离心下来，RNA则溶于上清中。该法所提 RNA纯度高完整性好较A（Ribonucleic Acid)的概述
存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。 由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类 核酸，因含核糖而得名，简称RNA。RNA普遍存在于动物、 植物、微生物及某些病毒和噬菌体内。RNA和蛋白质生物 合成有密切的关系。在RNA病毒和噬菌体内，RNA是遗传 信息的载体。 RNA一般是单链线形分子；也有双链的如呼肠孤病毒RNA； 环状单链的如类病毒RNA
8/15/2016
分离RNA的意义
进行完整的RNA的提取和纯化是进行 RNA方面研究工作的基本前提，如 Northern杂交、mRNA分离、RT-PCR、 基因表达水平检测、cDNA合成及体外 转录和翻译等实验均需要首先得到高 质量的RNA样品。
8/15/2016
总RNA的分离
1、异硫氰酸胍—酚法
8/15/2016
RNA制备的条件与环境
• 为防止RNase对RNA 的水解，一要全 力避免细胞外RNase的污染并抑制其 活性，二要尽快地抑制细胞内RNase 的活性并极力地去除RNase。对广泛 存在的细胞外RNase，应在RNA制备 的全过程中保持高度的警惕，并采 取严格的措施以避免其污染和抑制 其活性。