免疫荧光法—冰冻切片
免疫荧光法—冰冻切片
免疫荧光－冰冻切片间接法
免疫荧光法实验——冰冻切片
间接法
【标本】正常肝、肝癌标本冰冻切片
【抗体和试剂】
（1）荧光标记抗体：兔抗人LAPTM-4B-N端（胞浆内）一抗；羊抗兔IgG-TRITC二抗；小鼠抗人integrin α6 McAb；小鼠抗人EGFR多抗
（小鼠抗人EGFR单抗）；羊抗鼠IgG-FITC二抗（工作浓度为1:30）；
（2）0.01mol/L pH7.4 PBS
（3）2%BSA：用于配制一抗及封闭非特异性结合位点（可用正常羊血清封闭非特异性结合位点）
（4）缓冲甘油封片：1份0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液与9份甘油混合
0.2mol/L PB：X ml 0.2mol/L Na2HPO4 + Y ml 0.2mol/L NaH2PO4
pH8.0 X=94.7ml; Y=5.3ml
【染色步骤】
1．冰冻切片室温丙酮（冷丙酮）固定10min，PBS洗5min×3；
2．2％BSA37︒C封闭60min或4︒C过夜；
3．置切片于湿盒内，分别滴加一抗37︒C 30min；
4．PBS洗5min×3；
5．分别滴加二抗37︒C 30min；
6．PBS洗5min×3；
7．若染核；用1μg/ml Hoechst33342染色10min；PBS洗5min×3；
8．缓冲甘油封片；
9．荧光显微镜下观察或-20℃避光保存；。
冰冻切片免疫荧光直接一抗操作流程
冰冻切片免疫荧光直接一抗操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor.I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!冰冻切片免疫荧光直接一抗操作流程详解在生物医学研究中，冰冻切片免疫荧光技术是一种常用的方法，它能帮助我们观察和分析细胞或组织中的特定蛋白质。
冰冻切片 免疫荧光组化
冰冻切片免疫荧光组化
冰冻切片和免疫荧光组化技术是生命科学中广泛应用的技术。
以
下是两种技术的简介：
1. 冰冻切片技术：冰冻切片是把组织或细胞快速冻结并切成薄
片的技术。
不同于石蜡包埋技术，冰冻切片不需要前期的化学处理和
固定，具有样品保留完整活性、切片速度快、质量高等优点。
冰冻切
片广泛应用于免疫荧光组化、原位杂交、基因组学等技术中。
2. 免疫荧光组化技术：免疫荧光组化技术是一种利用特异性抗
体对目标分子进行标记和检测的技术。
该技术在机体免疫学、病毒学、肿瘤学和神经科学等领域广泛应用，可用于检测病毒、肿瘤标志物、
蛋白质表达、分子相互作用等。
通过将免疫球蛋白标记荧光染料或酶
标记物质后，通过显微镜或荧光显微镜观察样品上的染色，并进行分析。
该技术具有灵敏、特异、可视化等优点，已成为生命科学研究中
必不可少的技术之一。
冰冻切片免疫荧光间接法实验
实验报告3.因为相同种属的一抗具有相同的同种型抗原表位，因此一种与一抗不同种属的二抗可以结合多种一抗。
间接法荧光标记一方面节省标记成本，提高通用性；另一方面提高灵敏性，使信号更强。
但容易出现非特异染色，所以要用用与二抗同种的正常血清或白蛋白与组织孵育，封闭非特异位点。
4.注意：1）一抗和二抗是不同种属来源的抗体。
2）标记二抗与一抗必须是同一类（通常用的是抗人IgG）分、均匀，同时降低非特异结合或吸附）。
3）反应后用PBS洗3次，每次5分钟。
4）在冰浴中预先用0.1MPBS 配制荧光标记二抗。
5）切片甩干，擦去多余PBS。
滴加适量的二抗，盖好湿盒。
于37℃恒温培养箱孵育2小时。
注意加二抗过程及孵育过程中避光。
6）为更好显示细胞结构，一般用蓝色DAPI衬染，以确定所检测抗原的位置。
DAPI分装后，一般用锡纸包裹避光，-20℃保存，用时提前取出解冻。
7）在二抗孵育结束前8分钟，取出湿盒，滴加荧光染料DAPI，吹吸混匀，盖好湿盒。
于37℃继续孵育8分钟。
注意实验过程中避光。
8）二抗孵育结束后取出切片置于染缸中，0.01M pH7.4PBS浸泡。
9）置于37℃摇床中摇洗三次，每次15分钟。
摇床转速一般每分钟100转，摇洗过程注意避光。
4.封片1）免疫荧光技术常用封片剂：缓冲甘油封片剂。
2）将浸洗好的切片甩干，擦去多余水分。
滴加甘油封片剂，轻轻盖上盖玻片，防止出现气泡。
待干燥后在盖玻片周围涂指甲油封边5.镜下观察立即用荧光显微镜观察。
注意：一般标本在高压汞灯下照射超过3分钟，就有荧光减弱现象。
经荧光染色的标本最好在当天观察，随时间延长，荧光强度会逐渐下降。
冰冻切片漂片
免疫荧光操作步骤（漂片，冰冻切片）免疫组化步骤：1.将脑片放到，6 孔板（或12 孔板），按照二抗说明书，加3%双氧水封闭10min（如果是从切片保护液取出，则要用PBS 洗一遍）；（二抗不同，操作步骤有差别），本实验室使用的二抗试剂盒为中杉金桥超敏二步法试剂盒；2.吸去双氧水，PBS 洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；3.然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50 微升一抗稀释液，小鼠脑片为30 微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4.然后，4℃，过夜（18h 或者24h），不建议使用37℃；5.然后，PBS 洗净两遍；剩下步骤见二抗试剂盒说明书。
6.DAB 配方为：10mg DAB 固体加到20ml 0.01MPBS，临用时加100-200 微升30%双氧水，注意避光。
7.显色10min，看片子染色深浅情况适当调整显色时间。
一般3 分钟显色就比较明显，如果20 分钟仍未显色，则看下面的参考。
8.然后PBS 洗两遍，转移到载玻片，自然晾干。
干燥天气2-3h，潮湿天气3-4h。
9.脱水：70%酒精3min，95%酒精3min，100%酒精3min，100%酒精2min，二甲苯2min，二甲苯3-5min。
如果片子上盐分较多，在70%酒精前在双蒸水1min。
免疫荧光步骤及注意事项：1， 将脑片放到 6 空板的山羊血清封闭液中，封闭20-40min；（如果是从切片保护液取出，则要用PBS 洗一遍）2， 吸去山羊血清，PBS 洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；3， 然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入PBS 稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50 微升一抗稀释液，小鼠脑片为30 微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4， 4℃，过夜（18h 或者24h），不建议使用37℃，如果荧光亮度不强，可以延长孵育时间到48 或72 小时；5， 然后，PBS 洗净两——三遍，按照二抗说明书稀释的荧光二抗，室温孵育2小时。
冰冻切片免疫荧光染色流程
冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以CD4为例)（1）冰冻切片室温晾干15分钟；（2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；（3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）；（4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜；（5）PBS洗3次，每次10分钟；（6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma公司)，37℃孵育1小时；（7）PBS洗3次，每次15分钟；（8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照；（9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。
注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥（2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。
附注2：所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）：（1）pH7.40.01MPBS：配方为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl7.65g0.1MPBS配方为：Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O5.9g+NaCl 17g定容至2000ml,高压，pH 7.2-7.4（2）洗涤液：0.3%TrixtonX100－pH7.40.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存（3）封闭液：10％NGS－0.3%TrixtonX100－pH7.40.01MPBS，分装1.2ml/支－20℃保存（4）抗体稀释液：1％BSA－0.3%TrixtonX100－pH7.40.01MPBS，分装1ml/支－20℃保存。
冰冻切片的免疫荧光
免疫荧光通用操作规程冰冻切片的免疫荧光1, 动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4C过夜后，OCT包埋。
-20C保存3月，-80C长期保存。
请勿保存于液氮。
2, 冰冻切片机切片至少10um,空气干燥2分钟后，-20C储存3, 切片从-20取出后，在通风橱放10-30分钟以去除水汽，4%PFA固定15分钟，或-20 C丙酮固定15分钟置通风橱2小时4, 1XPBS清洗玻片，3X5min从此请保持玻片湿润5, 有时，抗原修复3小时会得到更好的结果。
为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压•微波修复•高压修复•隔水加热•电炉加热）… 关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液… 选择不同PH值的修复液（A液枸盐酸缓冲液PH6.0, B液EDTA-Na缓冲液PH8.0, C液枸盐酸缓冲液PH4.5）6, 室温圭寸闭1小时封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS （细胞因子，无需圭封闭的蛋白7, 一抗4C过夜请用圭寸闭液稀释一抗8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min9, 二抗，1:1000 （alexa 系列）1:300 （dyelight ）in 封闭液，避光室温1小时10, Wash,1XPBS, 3x5mi n11, DAPI 染核5min ,12, DDW Rinse13, 抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜14, 干片后4C保存石蜡切片的免疫荧光1, 动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤），制成石蜡包块2, 组织学染色切片厚度2um,免疫荧光染色切片厚度至少6um,切片复水：58 °C 20mi n-xyle ne 2x10mi n-100%EtoH2x10mi n95%EtoH2x10mi n-70%EtoH10mi n-, DDW5mi n4, Rinse玻片IxPBS,从此请保持玻片湿润5, 抗原修复过夜。
冰冻切片的免疫荧光
免疫荧光通用操作规程冰冻切片的免疫荧光1, 动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4C过夜后，OCT 包埋。
-20C保存3月，-80C长期保存。
请勿保存于液氮。
2, 冰冻切片机切片至少10um,空气干燥2分钟后，-20C储存3，切片从-20 取出后，在通风橱放10-30 分钟以去除水汽，4%PFA 固定15分钟，或-20 C 丙酮固定15分钟置通风橱2小时4, 1XPBS 清洗玻片, 3X5min 从此请保持玻片湿润5, 有时,抗原修复3 小时会得到更好的结果。
为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压•微波修复•高压修复•隔水加热•电炉加热）… 关注修复的温度 ,时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间）,抗原修复液必须遵循自然降温规律, 使用足量的抗原修复液… 选择不同PH 值的修复液（A 液枸盐酸缓冲液PH6.0, B 液EDTA-Na缓冲液PH8.0, C液枸盐酸缓冲液PH4.5）6, 室温封闭1 小时封闭液：5%BSA+1 0%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in IxPBS （细胞因子,无需封闭的蛋白7, 一抗4C过夜请用封闭液稀释一抗8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min9, 二抗，1:1000 （alexa 系列）1:300 （dyelight ）in 封闭液，避光室温1 小时10, Wash,1XPBS, 3x5min11, DAPI 染核5min，12，DDW Rinse13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜14,干片后4C保存石蜡切片的免疫荧光1 ，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤），制成石蜡包块2,组织学染色切片厚度2um,免疫荧光染色切片厚度至少6um,切片复水：58 °C 20mi n-xylene 2x10min-100%EtoH2x10min95%EtoH2x10min-70%EtoH10min-, DDW5min4, Rinse 玻片1xPBS, 从此请保持玻片湿润5，抗原修复过夜。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
免疫荧光法—冰冻切片
免疫荧光－冰冻切片间接法
免疫荧光法实验——冰冻切片
间接法
【标本】正常肝、肝癌标本冰冻切片
【抗体和试剂】
（1）荧光标记抗体：兔抗人LAPTM-4B-N端（胞浆内）一抗；羊抗兔IgG-TRITC二抗；小鼠抗人integrin α6 McAb；小鼠抗人EGFR多抗
（小鼠抗人EGFR单抗）；羊抗鼠IgG-FITC二抗（工作浓度为1:30）；
（2）0.01mol/L pH7.4 PBS
（3）2%BSA：用于配制一抗及封闭非特异性结合位点（可用正常羊血清封闭非特异性结合位点）
（4）缓冲甘油封片：1份0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液与9份甘油混合
0.2mol/L PB：X ml 0.2mol/L Na2HPO4 + Y ml 0.2mol/L NaH2PO4
pH8.0 X=94.7ml; Y=5.3ml
【染色步骤】
1．冰冻切片室温丙酮（冷丙酮）固定10min，PBS洗5min×3；
2．2％BSA37?C封闭60min或4?C过夜；
3．置切片于湿盒内，分别滴加一抗37?C 30min；
4．PBS洗5min×3；
5．分别滴加二抗37?C 30min；
6．PBS洗5min×3；
7．若染核；用1μg/ml Hoechst33342染色10min；PBS洗5min×3；
8．缓冲甘油封片；
9．荧光显微镜下观察或-20℃避光保存；。