关于冰冻切片的若干问题
冷冻切片方法及注意事项
冷冻切片方法及注意事项一、实验前准备清理实验台及仪器。
开启冷冻切片机并将冷冻切片机预降至所需温度（- 15~-20 ℃*）。
准备好处理好的载玻片、刀片、胶水以及药品。
二、取材解剖之后迅速取出所需的新鲜组织，用干纱布或滤纸擦干后不需固定直接取材（24×24×2mm*）,以防形成冰晶造成切片中形成形状不一的空泡,使细胞内结构移位。
（注：取材中目的标本既要明确也要确保其结构的完整性，应避免不必要的脂肪及坏死组织附着;要尽量剔除毛发、硬骨或钙化物;保乳手术切缘由于脂肪组织较多,取材厚度最好不要超过3mm，厚者冰冻费时，大者难以切完整。
甲状腺及淋巴结组织要带全组织被膜并除去多余的脂肪组织。
）三、冷冻切片1、取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻，用吸热器压住组织，至包埋剂与组织冻结成白色冰体即可切片（1~3分种）。
2、将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。
3、调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10μm间。
4、调好防卷板。
制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。
切片时，以切出完整、平滑的切片为准。
切好的组织在干净的玻片上黏附时顺着一个方向稍微用力轻轻一带,可避免组织摊片过程中皱折,保证组织结构的完整及切片的美观。
注：①包埋剂的选用：包埋剂是对冷冻切片质量一重要影响因素，包埋剂用量要适宜，过多或过少都会影响标本冷冻质量。
常用的有三种包埋剂OCT剂、B超藕合剂以及普通胶水。
B超藕合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织,普通胶水或OCT剂适用于纤维丰富质地偏硬组织。
（OCT包埋剂骤冷时固化，其冷冻速度和软硬韧度与组织相近，其还具有水溶性，不影响染色等优点。
）②组织块过小：先将少量胶挤在托架上预先放在冰冻机中冷冻,约30秒钟左右待胶凝固时将小组织放上,组织周围再加一些胶,再次置于冷冻机中冷冻,这样组织被垫高,就能快速切出高质量的切片。
冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理
• 切片判读正确-反映真实的科学现象
• 知识结构背景
• 组织学结构的熟悉…… • 认识病理改变：炎细胞侵润、坏死、水肿、蛋白变性、纤维化、增 生、凋亡…… • 审美观、拍照角度、视野、曝光时间、对比度……
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– 常规HE染色 – 特殊染色
• 如：Masson(Thichrome staining)，油红O，尼氏染色， 台盼蓝（肥大细胞）染色
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(1) 所有切片呈阴性
1）染色未完全严格按照操作步骤进行 2）漏加一种抗体，或抗体失活 3）缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性 4）底物中所加H2O2 量少或失活 5）复染或脱水剂使用不当
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（2）所有切片呈阳性反应，其原因：
①切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。 ②缓冲液PH值不准确，洗涤不彻底。 ③使用已变色的显色底物溶液，或显色反 应时间过长。 ④抗体温育的时间过长。
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ห้องสมุดไป่ตู้
4. 染色：抗体孵育和选择: 免疫组化最关 键环节
试剂公司提供标准化的试剂
• 组织固定时
– 固定液要有足够的量(固定液是组织体积的8-10倍) – 保持一定时间，快速灌注固定后，相同的固定剂再固定 2-4h（ 4℃冰箱）
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减少冰晶的形成
• 公认：未经固定的组织切片冰晶较多 • 固定后的组织切片仍然会有一定的冰晶， 为防止冰晶的形成 • 采取如下方法
冷冻切片常见问题分析与预防
冷冻切片常见问题分析与预防骆新兰收稿日期:1998 03 30作者单位:广东省人民医院病理科,广州 510080作者简介:骆新兰,男,30岁,技师冷冻切片是借助低温使组织冻结达到一定的硬度进行切片的一种方法。
它是术中诊断的一种重要方法。
但由于各种原因,影响冷冻切片的质量,拖延病理报告发出的时间,直接影响着病理诊断的及时性、准确性,间接影响着病人的预后。
归结起来有以下几方面。
1 切片不全或不能切片切片不全是指切出的切片组织切面不完整、有缺损现象;不能切片是指组织块的温度过高或过低不能制作一张完整的切片。
切片不全直接影响着冷冻报告切片的准确性。
导致切片不全或不能切片的常见的原因有几下几方面。
1 1 组织内含过多的脂肪或坏死组织 脂肪或坏死组织较一般的组织冷冻的温度要低些,当活组织达到所需的温度时,其还比较软,从而影响切片的完整性和拖延冷冻报告发出的时间。
1 2 组织块过冷 组织冷冻过度易致切片破碎或呈粉沫状,不能制作一张完整的切片。
1 3 组织块冷冻不均匀 在配合使用液氮时,组织块放入液氮时不能保持水平状态且液氮量不足的情况下,可产生此现象。
1 4 冻头的温度不足 冷冻切片时要求冻头的温度保持在-25 ~-30 左右,冻头的温度达不到要求时,组织很快回软,也不能保证切片的完整。
1 5 组织块过大 预防与处理: 注意组织的性质。
冷冻切片的组织除了要保持新鲜外,还应注意避免组织内含过多的脂肪(脂肪组织除外)及坏死组织。
!组织大小要适中。
冷冻切片机内切片刀移动的范围有一定的限制,超出其范围时,易致切片不全。
一般情况下,冷冻切片的组织块大小1cm ∀1cm ∀0 3cm,但卵巢肿瘤及脂肪组织可稍为大些。
另外,包埋时,应将组织平放在冻头的中央。
#掌握好冷冻时间。
根据组织块的大小、性质,确定冷冻时间,一般13~17s(使用液氮者),若组织较大或脂肪组织时间可适当长些,而甲状腺、脑组织和淋巴结等冷冻的时间相对要短些。
冰冻切片制作及染色过程中常见问题及处理
举例：不同实验时间和条件下同种一染 色方法结果差异
A
B
C
Masson staining
2. 标本固定应充分
• 固定的标准
– 切片冰晶少，细胞挤压变形小，切片完整，染色清晰
• 一般较多采用组织固定后再行切片 • 浸入法和灌注法
– 浸入法：活检、手术标本，不能进行灌注的组织固定 – 灌注法：动物实验研究
样易粘、易碎 – 组织块带有皮肤、包膜、过大或冰晶过多 – 切片刀钝或较脏，切片出现刮痕，使切片不完整 – 操作手法不当，如速度不适宜
防止切片卷缩
• 常见原因
– 切片刀钝或粘有组织碎屑 – 防卷板位置不正确或防卷板较脏 – 静电或者气流作用 – 防卷板温度高、室温高
• 采取对策：
– 保持防卷板干净、平整、无缺损、无刮伤 – 戴口罩，以避免呼出的气流直接吹到防卷板 – 切片时间过长时，应注意间隔一会儿，盖上冷冻室
(1)所染的全部切片均为阴性结
果，包括阳性对照在内。 染
色
(2)所有切片均呈阳性反应
失
败
(3)所有切片背景过深
(4)阳性对照染色良好，检测的 阳性标本呈阴性反应
(1) 所有切片呈阴性
1）染色未完全严格按照操作步骤进行 2）漏加一种抗体，或抗体失活
3）缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性 4）底物中所加H2O2 量少或失活 5）复染或脱水剂使用不当
• 好的切片制作和染色成功的关键
– 细节决定成败
• 固定、漂洗溶液PH值，成分；切片厚度、手感；抗体效价、特 异性；切片孵育时间，湿度、温度；
• 切片判读正确-反映真实的科学现象
• 知识结构背景
冷冻切片常遇到的问题及解决对策
3 冻切片机工作室温度的设置 根据器官组织形态结构和 组成成分的 不同, 切片时 要相应 调 整切片机工作室温度, 我们在进行冷 冻切片 时得到 的经验 见 表 1:
表 1 没有固定的冰冻组织适合切片的温度如下
组织
标本的切片温度
脑 肝 淋巴结 肾 脾 肌肉 甲状腺 皮肤 乳腺 含脂肪乳腺 脂肪组织
- 12 - 14 - 14 - 16 - 16 - 20 - 20 - 25 - 25 - 30 - 30以下
组织冷冻切片 是借 助低 温使组 织达 到一 定的 硬度 然后 收稿日期: 2006- 04- 10
进行切片的一 种技 术方法 [ 1]。因 其制 作过 程较 传统 的石 蜡 切片相对简便、快捷, 不需经过 固定、包埋和 切片后 温箱中 烤 干处理等实验步骤, 且能很好地保存 组织抗 原和酶 的活性 而
另外, 在切片前 修整 冷 冻组 织块 最容 易损 伤刀 刃, 最好 在急冻组织块稍冻硬以后立刻修 整, 以 减少冻 硬的包 埋剂对 刀刃的损害。组织 块冷冻 时可 根据 组织 块大 小加 入适 量的 包埋剂, 我们 用市售液 体胶 水替 代进 口包 埋剂, 切 片效 果良 好, 且经济简 便。切片后 组 织要 进行 及时 固定, 固 定的 作用 在于使蛋白变性、凝固 、沉淀, 终止或 抑制酶 活性, 保持细 胞、 组织原有的形态结构和抗原性, 此外固 定还兼 有硬化 和媒染 组织切片的效果。对于不同的组 织和抗 原成分的 组织切 片, 需选择合适的固 定剂 及适宜 的温 度和 时间。 蛋白 类抗 原用 丙酮固定, 多 糖类抗原用乙醇固定效 果比较好 [ 6] 。切 片一般 在 4 固定液 5分 钟左右。
2 切片机的温度调试 高质 量 的冷 冻切 片 机一 般有 三 个设 置温 度, 工 作 室温
常规冰冻制片常见问题分析 ppt课件
每台冰冻切片机都有 一个速冻台，好的冰 冻切片机可以在几分 钟内将速冻台的温度 下 降 至 -50℃ ～ -60℃ 度之间。
冷冻锤从上面压在组 织上，可以使组织上 下两面同时冷冻
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一台冰冻切片机有多个冷冻锤
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6、液氮和急冻剂
使用液氮和急冻 剂来快速冷冻组织
7、专用冷冻机
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我
笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
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一、冰冻切片制片中冰晶的问题
冰晶的产生：当组织缓慢冷冻时，组织间隙的 水份凝固形成的，这时由于电解质析出，渗透压 升高，细胞内的水分子渗透到细胞外，使组织间 隙的冰晶变得更大，挤压周围组织，使组织细胞 的形态发生明显的改变，严重影响病理诊断。
1、正确选择染色试剂苏木素、伊红的配方 2、注意染色过程中的细节问题
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1、苏木素、伊红配方的选择
（1）改良Gill苏木素液：
苏木2.5克溶于乙二醇250ml中。硫酸铝铵17.6克溶于蒸馏水 730ml,以上二液充分溶调后混合，加碘酸钠0.2克，使用前加 冰醋酸20ml.
（2）酸化沉淀伊红液 贮 备 液 ： 伊 红 20 克 ， 蒸 馏 水 500ml, 经 充 分 溶 解 后 加 浓 盐 酸
5、购置专用冷冻机、急冻剂、专用液氮灌
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二、常规与冰冻制片中常见问题
切片染色的问题
冰冻切片的局限性
冰冻切片的局限性：
1、冰冻切片因急于快速诊断，取材局限，致使取材不足，有时可能误诊、漏诊；有时局部小标本不能代表整个标本，或根本没有取到病变组织。
因此，有时某些病例冰冻切片组织与手术切除的大标本的石蜡切片组织像差异比较大，造成冰冻切片的诊断与石蜡切片的诊断不一致。
2、对于某些疑难病例、交界性病变，有时难以确诊，如勉强诊断则易误诊，故应该等待常规石蜡诊断结果，以决定是否行二次手术。
3、冰冻切片质量多不如常规石蜡切片，且常有人工假像，导致诊断困难，则有时造成假阴性或假阳性病例出现，故此冰冻切片诊断的准确性一般为95％左右，有时误诊是难以避免的，临床决定手术方案时，一定要综合考虑后实施。
4、部分组织不宜做冰冻切片，如骨、脂肪、钙化组织、脑组织、淋巴组织及部分软组织肿瘤等，该切片主要针对乳腺、甲状腺、子宫及双附件、食管、胃肠及部分肺肝肾部位肿瘤做出病理诊断，故此有其局限性，不是所有组织都行冰冻诊断，因此，冰冻切片诊断一定要与病理科预约，征询病理医生能否行冰冻切片诊断。
5、在实际工作中，手术中病理诊断也确实对临床手术方案的制定起到了重要的指导作用，但是必须说明的是，因为诸多因素的局限，手术中病理诊断并不是最后的病理诊断，冰冻切片与手术后石蜡切片的诊断有可能不相符合，最终以石蜡切片病理诊断为最后诊断。
冰冻切片检查注意事项
手术中冰冻切片检查规范一、手术中冰冻切片检查注意事项(一) 手术中冰冻切片检查是临床医师在实施手术过程中，就与手术方案有关的疾病诊断问题，尤其需要临床医师与病理医师间的密切合作。
(二) 手术中冰冻切片检查要求病理医师在很短时间内，根据对切除标本的巨检和组织块快速冷冻切片的观察，向手术医师提供参考性病理诊断意见，由于组织未得到充分有效的固定、脱水以及切片较厚等等，与石蜡切片病理诊断的准确率有一定的差距，一般仅限于良、恶性的鉴别。
与常规石蜡切片的病理诊断相比，手术中冰冻切片检查具有更多的局限性和误诊的可能性，误诊率5%以上。
有的病例难以快速诊断，需要等待常规石蜡切片进一步明确诊断。
(三) 有关临床医师应于手术前向患者和／或患者授权人说明手术中冰冻切片检查的意义和局限性等，取得患者和／或患方的知情和理解。
患者和／或患者授权人应在由医院制定的《手术中冰冻切片检查知情同意书》签署意见和签名。
(四) 主持手术的临床医师应在手术前一天向病理科递交手术中冰冻切片检查申请单，填写患者的病史，重要的影象学、实验室检查结果和提请病理医师特别关注的问题等。
一般不接受电话预约和临时申请手术中冰冻切片检查。
（五） 手术中冰冻切片检查的手术标本在切除后应立即送到病理科，并注明手术的部位，重点部位应做标记或加以说明。
同时手术标本应保持新鲜，不要加用固定液或用含水溶液清洗，以免影响制片和诊断。
（六） 手术中冰冻切片检查诊断报告一般在手术标本送达病理科后30分钟内做出。
并以书面文字形式通知临床手术科室。
特殊情况（如标本过大，取材过多，或多个冰冻标本同时送检等），报告时间可以超过30分钟。
（七） 工作开展时间：手术中冰冻切片检查的开展时间为周一至周五，周六和周日如有需要可提前预约。
（八） 手术医师应在手术后及时填写常规石蜡病理检查申请单到病理科，以便病理科及时发出常规病理报告。
二、手术中冰冻切片检查适用范围(一) 需要确定病变性质（如肿瘤或非肿瘤／良性肿瘤或恶性肿瘤等），以决定手术方案的标本。
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创作编号：
GB8878185555334563BT9125XW
创作者：凤呜大王*
1.
问：本人将样品固定过后冲洗过后，放入蔗糖溶液，因有事耽搁，放了一个星期了，不知是否还可切片．还有固定过后冲洗用普通蒸馏水冲洗可以吗？我是做免疫组化答：1、不知道你放置的蔗糖浓度是多少，如果是30%最好是三天之内，50%的浓度可以方久一点，一两个月应该没什么问题。
因为蔗糖是高渗环境，不会影响实验结果。
祝好运吧！
2、我认为组织在20％蔗糖放一周还是可以切片的，至于固定后的冲洗，可以免掉，也可用0.01MPBS涮洗一下，蔗糖液的量要多加一些
2
问：请拟准备做免疫荧光的标本,经前固定灌注后取全脑,后固定4小时后,30%的蔗糖脱水过夜,再用OCT包埋后保存在-80的冰箱,冰冻切片后HE染色,发现整个视野都是大小
不等的圆形洞洞,不知道是什么原因.
答:1、个人认为可能是以下几个方面的问题: 30%的蔗糖脱水过夜---- 一般我所采取的是灌注固定后取脑,然后放入30%蔗糖的多聚甲醛溶液中,待脑下沉到底后(大约2天)再切片,用这样的高渗糖既可以防止冰晶又可以继续后固定.单纯的蔗糖过夜应该是不够
的. 从30%蔗糖的多聚甲醛溶液中捞出脑后应放入液氮迅速冷冻然后进行切片,不建议用-80度冰箱,曾经用过-80度冰箱结果脑片出现许多冰晶孔.
2、用0.01M的PBS配置的4%多聚甲醛灌注固定后，20%蔗糖（沉底）→30%蔗糖（沉底），然后直接进冰冻切片机急冻15~20min，我们实验室的技术员曾说过，脑标本千万不能用OCT包埋、液氮冷冻。
只要蔗糖脱水彻底，是不会形成冰晶的；而用OCT包埋、液氮冷冻，你没做过，时间不好把握——时间长了，组织会冻裂；时间不够，冷冻效果不好，切片不好切。
3、这个就是实验室和实验室操作方法有所区别了,我说的方法肯定是没有问题的,我们都是这样操作没有出现过冰晶,不用OCT包埋,但确实用液氮,冻10秒,不会冻裂,效果良好.
4、液氮速冻可以防止组织冰晶的形成
冰冻切片心得
1. 取脑一定要在冰上操作,液体也一定用冷的
2. 30%蔗糖一定要充分,最好中间换液一次, 20%的可以不做
3. 沉淀后冻存,一定要快冻, 最好在干冰上操作.
4. 最重要的一点, 灌注的时候, 不要用0.1M PB, 用0.01M PBS. 以前不知道,很多书上写的都是0.1M PB,后来自己用了发现还是有洞. 为了这个,我还专门作了对照实验,结果0.01M PBS更好一些, 原因不知道为什么, 但是事实如此. (理论上高浓度液体更利于保护细胞不会因为冰冻损伤)
5. 如果做磷酸化的抗体,一定记得在灌注液里加一定的抑制剂,如NaF等.
如果是全脑的话，放在30%蔗糖（PBS或PB配）中沉底会很慢，我们都用双蒸水配，先20%沉底，再30%沉底，想要沉底快可将脑先切成小块。
其实我做过很多次只用20%沉底，30%泡过感到有点粘粘的，切出的片子容易卷，不好展开。
要切片没有洞关键要速冻，切片机闲时一般温度较高，使用时把温度调到切片温度，先不将脑块放入，待温度降低后再放入以达到速冻的效果。
我做切片的时候，先用20％蔗糖（PB配）沉底，再用30％蔗糖沉底，这样脱水比较充分。
一般是等切片机温度达到-22度之后，再将包埋好的脑组织放入。
脱水不充分也会导致切片有洞，而且片子容易向内卷，很不好贴。
一直这样做了很久，效果都还不错。
防止脑袋冻碎办法：
先准备好一个保温杯，倒入适量的液氮，然后在杯身中放一个纸杯（塑料或玻璃杯禁用），再在杯中放一金属片，以防止纸杯翻倒，动物脑袋取好后，先放在一张小锡箔纸上，然后连锡箔纸一起转移至杯中的金属片上面，盖上保温杯盖，3-5分钟后，见大脑表片颜色变白，表示冷冻完全，随即将大脑用锡箔纸包好，转入-80度冰箱长期保存。
脑片切好后保存方法：
1、先用手指在玻片（已挂好胶）后均匀轻轻过一下，将脑片组织贴在玻片上。
2、37度干燥箱中烘干。
3、放入切片盒中，盖紧盒盖，并用胶带将切片盒封严，外用样品袋包扎严实，即可防止水汽进入。
于-20度可保存半年以上，于-80度可保存一年以
上。
切忌经常打开盒子。
0.01M PBS配方（pH7.2～7.4）（500 ml）
Na2HPO4•12H2O2（分子量358.14） 2.9g
NaH2PO4•2H2O2 （分子量156.01） 0.295g
NaCl 4.5g
ddH2O 500 ml
混匀，完全溶解后，用H3PO4调PH值至pH7.2～7.4。
用前配制或者于4度短期保存。
创作编号：
GB8878185555334563BT9125XW
创作者：凤呜大王*。