冰冻切片实验步骤
冰冻切片操作流程
冰冻切片操作流程
1.包埋切片
将组织置于20%-30%蔗糖溶液1～3天沉底，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。
取出组织，预冷PBS清洗后平放于软塑瓶盖或特制小盒内（比如用铝箔纸折成有口的方盒），加入适量OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。
取出组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。
2.固定
在冰冻切片机上切片，完成后用预冷的4%多聚甲醛室温固定
20-30min，冷水清洗3-5次，-20度保存。
3.冰冻切片机切片，厚度3-5微米
4.切片后固定
将切好的冰冻片用预冷的组织固定液固定30min，蒸馏水洗3-5次，洗干净固定液，自然晾干后进行下一步实验或-20℃保存
冰冻片免疫荧光实验步骤
热修复抗原:将切片浸入修复缓冲液（柠檬酸盐或EDTA修复液）,电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔5-10 min后，反复1-2 次。
室温自然冷却后水洗一次
滴加封闭液（5%BSA或二抗同源血清）, 37℃孵育30 分钟。
甩去多余液体, 不洗。
滴加适当稀释的一抗，4℃过夜后37℃复温30min，也可37 ℃孵育2 h。
PBS洗5min×3 次。
滴加生物素化山羊抗小鼠IgG(或兔IgG)，37℃30 min。
PBS洗5min×3 次。
滴加试剂SABC-FITC，37℃孵育30 min。
PBS洗5 min×4 次。
DAPI复染2-3min，充分水洗，封片观察。
实验八 冰冻切片法
一 、实验目的• 学习冰冻切 Nhomakorabea法 • 了解组织染色原理
二、实验原理
• 用包埋剂包埋并冷冻固化组织； • 用碱性染料如苏木精、碱性品红等，使细 胞核着色； • 用酸性染料如伊红、酸性品红等，使细胞 中的嗜酸性成分着色，如蛋白质。
三 、实验用品
• 1、器材： • 切片机、染色缸、玻片、显微镜、试剂瓶、剪刀、镊子、 烘箱或酒精灯。 • 2、试剂 • 苏木色精、伊红、二甲苯、中性树胶、酒精、氨水、盐酸。 • 3、材料 • 各类你感兴趣的新鲜或固定标本。
四、实验步骤
• • • • • 1、取材：将材料切成5-8mm³的小块。 2、包埋：包埋剂包埋。 3、冷冻：放入冷冻切片机标本冷冻台。 4、切片：厚度7-8µm。 5、烘片、固定：烘箱烘片20-30min，甲醛 固定液固定；或直接酒精灯烘片。 • 6、染色与观察：（见下页）。
染色与观察
• 1%苏木色精（5min）——水洗——0.5%盐 酸分色（数秒）——水洗——0.4%氨水蓝 化——水洗（ 5min ）——70%酒精—— 80%酒精——1%伊红（95%酒精溶解）— —95%酒精——95%酒精——100%酒精— —100%酒精——酒精/二甲苯——二甲苯— —二甲苯——中性树胶封片。 • 未注明时间的一律处理2-3min。
五、作业
• 简述冰冻切片过程，绘制你所观察到的细 胞形态。 • 提交一张你认为制作较好的玻片。
冰冻切片步骤2010.6
1.速冻组织：冰冻切片机的使用需要加强！！将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾?，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。
取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。
冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。
2．组织固定与切片：样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织。
取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。
组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。
修片，切片。
重点步骤室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定5~10min，烘箱干燥20min。
PBS洗，5分钟×3。
进行抗原热修复（7-1-5-1-5）微波热修复可以吗，室温自然冷却。
（选做：用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性）。
3．组织切片免疫荧光染色：冰冻切片室温晾干15min,用组化油笔将待染组织圈好，圈不可太小，太小时若阻水胶粘到组织上，组织便不能染上色。
圈也不宜太大，太大则浪费抗体。
选做：用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1 小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液(抗体的量视组织大小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸，我们的胰腺组织一般是加10-20μl)，将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜。
第二天早上，先将湿盒放到37℃回温1h（37℃环境可用二氧化碳培养箱或者分子杂交箱提供），然后吸取片上的一抗进行回收，将切片插入到小染缸PBS冲洗，。
滴加用PBS稀释好的二抗（从此开始所有步骤都在暗房进行）置于分子杂交箱中37℃孵育1小时。
冰冻切片步骤很全面
冰冻切片步骤很全面冰冻切片是一种常用的实验技术，在生物学、医学研究、组织学观察等领域有着广泛应用。
以下是一份详细的冰冻切片步骤，旨在提供全面的指导。
注意，不同的实验目的可能会有一些差异，因此请根据实际需求调整步骤。
1.準备1.1获取你所需的样本。
这个样本可以是活体动物的组织，也可以是固定处理后的组织。
1.2准备冷冻介质。
通常使用的冷冻介质包括液氮、干冰和冷冻套。
液氮是一种非常冷的液体，可以迅速冻结样本。
干冰是固态二氧化碳，可以提供较低的温度。
冷冻套是一种装置，可以通过循环冷却剂来维持全套工具的较低温度。
1.3准备工具和设备。
这些工具和设备通常包括切片机、切片模具、刀片、显微镜片和刷子。
1.4调整工作环境。
确保实验室温度适宜、空气流通，并消毒工作台和其他工具。
2.样本取样和固定2.1根据实验目的，选择合适的样本区域。
例如，在动物研究中，你可能需要选择大脑的特定区域。
2.2切下样本。
使用手术器械，例如手术剪刀和手术刀，在样本区域周围切下足够大小的组织块。
2.3快速固定样本。
使用适当的固定液将样本固定。
常用的固定液包括10%缓冲福尔马林和4%聚乙二醇。
将样本完全浸没在固定液中，确保完全固定，避免其损伤。
3.冷冻3.1冷冻样本。
将固定的样本迅速置于冷冻介质中。
如果使用液氮，直接将样本放入液氮中。
如果使用干冰，将样本放入常温下事先准备好的干冰盒中，并立即放入冷冻套中。
3.2冷冻条件。
根据样本的性质和实验要求，选择适当的冷冻条件。
通常情况下，液氮的温度低于-150°C，而干冰的温度大约为-78°C。
3.3冷冻时间。
样本的冷冻时间取决于其大小和固定液的穿透性。
通常情况下，较小的样本需要较短的冷冻时间，而较大的组织块需要较长的冷冻时间。
一般而言，冷冻时间为几个小时到几天。
4.切片4.1为切片做准备。
在切片之前，将切片模具放在切片机上，并冷却至所需的温度。
同时，将刀片插入切片机。
4.2取出样本。
冰冻切片制片实验步骤及注意事项
冰冻切片制片实验步骤及注意事项冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。
因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。
冰冻切片制片实验步骤1、组织固定：新鲜组织固定于4%多聚甲醛24h以上。
将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整。
2、脱水：将修切好的组织放于15%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底后转入30%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底。
3、OCT包埋：将脱好水的组织取出用滤纸将表面水稍吸干后切面朝上放于包埋台上，组织周围滴上OCT包埋剂，将包埋台放在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋，OCT变白变硬后即可进行切片。
4、切片：将包埋台固定于切片机上，先粗切将组织面修切平整后即可开始切片，切片厚°8-10μm。
将干净的载玻片平放于切出的组织片上方即可将组织贴于载玻片上。
-20°保存备用。
注意事项1、组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有：① CO2气（-78℃）② 丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（-80℃）③ 液氮（-190℃）④ 液氮冷却的丙烷（-19℃）。
液氮适用于组织化学，较安全。
缺点：组织块易发生龟裂。
2、为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。
但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。
故不宜使用，低温，冷甲醛短时间固定（10分钟左右）固定，可显示琥珀酸脱氢酶。
3、电镜出现后，需要保存细胞的超微结构，以4%缓冲戊二醛（25%戊二醛16ml；0.1M二甲胂酸（pH7.）84ml；蔗糖8g）固定较好。
这些固定液主要用于水解酶，而不适于许多氧化还原酶和转移酶。
冰冻切片步骤很全面
冰冻切片步骤很全面1.标本采集：标本采集是制备冰冻切片的第一步，要确保标本的新鲜度和完整性。
采集时需注意使用无菌器械，避免受到外界污染。
对于细胞切片，可采用细胞培养技术培养的细胞；对于组织切片，采集适量的组织，尽量保持其原有结构。
2.固定：在采集后，为了防止细胞或组织的结构和形态发生变化，需要进行固定处理。
常用的固定方法有：a.4%的硫酸镁：使用4%的硫酸镁固定剂，固定15-30分钟。
b.4%的甲醛：使用4%的甲醛固定剂，固定15-30分钟。
c.10%的缓冲福尔莫林：使用10%的缓冲福尔莫林固定剂，固定4-24小时。
3.包埋：包埋是将固定的细胞或组织进行预处理，以便后续的冷冻切片。
常用的包埋方法有：a.脱水：使用不同浓度的乙醇进行脱水处理，通常有70%、80%、95%和100%四个浓度。
b.渗透剂：使用溶解在脱水剂中的渗透剂，如氯仿、苯酚、醋酸酯等，以提供组织切片的硬度和稳定性。
c.包埋剂：将脱水后的组织切片放入包埋剂中，如石蜡、冻脂等；对于细胞切片，可直接在载玻片上进行包埋。
4.冰冻：冰冻是制备冰冻切片必不可少的步骤，它能够保持细胞或组织的原有形态和结构。
常用的冰冻方法有：a.冷冻板法：将包埋好的标本放置在预冷冻的金属冷冻板上，然后放入液氮中进行快速冷冻。
b.冷冻微才法：将包埋好的标本进行逐步冷冻，在每一步冷冻前都将标本表面的水分吹干。
c.冷冻机法：使用专用的冷冻机进行冷冻，通常温度在-20至-30°C。
5.切片：切片是冰冻切片的核心步骤，需要使用显微切片机或冰冻切片机进行操作。
切片前需将冷冻的标本块取出，等待恢复到适宜切片的温度（一般为-20至-30°C）。
然后，使用坚硬的切片刀或切片刀片切取薄片，通常厚度为5-20微米。
切片时需注意保持刀片的锋利度和角度，以保证切片的质量。
总结：冰冻切片是一种常用的生物学实验和临床诊断技术，它通过对细胞和组织进行固定、包埋、冰冻和切片等步骤，帮助研究人员观察和分析样本的结构。
冰冻切片免疫组化染色步骤
冰冻切片免疫组化染色步骤引言冰冻切片免疫组化染色是一种常用的实验方法，用于研究细胞和组织的分子表达。
它结合了冷冻样本的切片技术和免疫组织化学染色的原理，能够可视化特定分子在组织中的位置，从而帮助我们理解生物过程和疾病机制。
本文将介绍冰冻切片免疫组化染色的步骤和注意事项。
步骤一：样本制备1.收集组织样本，根据需要进行切割和处理。
2.快速冷冻组织样本，可用液氮或乙醚等方法冷冻，并保存在低温环境中。
步骤二：切片制备1.取出冷冻样本，将其置于切片机或切片冷冻器中。
2.进行组织切片，通常厚度为5-10微米，利用切片刀或者切片冷冻器的微调装置。
3.将切片收集在清洁的载玻片上，可以使用专门的载玻片来增强切片与载玻片间的附着力。
步骤三：固定和脱水1.将载玻片上的切片放入4%的中性缓冲福尔马林缓冲液中固定细胞和蛋白质。
2.固定15-30分钟后，用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将福尔马林去除。
3.将切片脱水，使用逐渐浓度的乙醇和脱水溶液，如70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇。
步骤四：抗原修复1.对于有些抗原，如细胞核抗原，需要进行抗原修复。
这可以通过热、酸或酶消化等方法进行。
2.一种常用的抗原修复方法是将切片置于高温或高压下进行热诱导抗原修复。
步骤五：阻断和孵育1.使用蛋白质阻断剂，如牛血清蛋白、BSA等，在切片上进行孵育，以防止非特异性结合。
2.孵育时间通常为30分钟至1小时。
步骤六：一抗孵育1.加入一抗，即特异性抗体，与切片上的靶分子结合。
2.一抗浓度和孵育时间根据实验需要和抗体质量进行优化。
步骤七：洗涤1.使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的一抗去除。
2.洗涤时间和次数根据实验要求和抗体特性进行优化。
步骤八：二抗孵育1.加入荧光标记的二抗，与一抗结合形成复合物。
2.二抗可以识别一抗的种类，常见的二抗有荧光标记的抗鼠IgG、抗兔IgG等。
步骤九：洗涤1.使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的二抗去除。
冷冻切片sop操作流程
冷冻切片sop操作流程SOP（Standard Operating Procedure，标准操作规程）是一份详细说明操作步骤的文件，有助于确保在特定任务或过程中的一致性和可重复性。
以下是冷冻切片的一般SOP操作流程，具体操作可能因实验室设备和需求而有所不同：1. **准备样本：**- 确保样本已经被适当地冷冻，并且处于适当的保存温度。
准备好冷冻切片所需的样本。
2. **设备准备：**- 检查和准备切片机或微切机。
确保刀片是锋利的，并进行必要的清洁和消毒。
3. **切片机设置：**- 设置切片机的参数，包括切片的厚度、速度和刀片的温度等。
确保所有设置符合实验需求。
4. **刀片安装：**- 安装刀片到切片机上，并进行校准。
确保刀片的位置和角度是正确的。
5. **样本固定：**- 使用合适的固定剂或嵌入剂，将样本固定在切片机的支架上。
确保样本被均匀地固定。
6. **切片过程：**- 启动切片机，开始切割样本。
根据需要，可以选择手动或自动模式。
确保切片的质量和厚度符合实验要求。
7. **切片收集：**- 收集切片并放置在适当的载玻片或其他支持材料上。
确保切片的顺序和标记是清晰可辨认的。
8. **切片处理：**- 根据实验需要，可能需要对切片进行后续处理，如染色、包埋等。
确保处理步骤符合实验要求。
9. **数据记录：**- 记录切片的相关信息，包括切片序号、厚度、样本来源等。
这有助于后续数据分析和实验结果的追溯。
10. **清理和维护：**- 清理切片机和工作区域，确保所有工具和设备得到适当的维护。
这有助于保持切片机的性能和延长使用寿命。
11. **文档归档：**- 将整个操作流程和相关数据归档，以备将来的查阅和验证。
这个流程是一般性的冷冻切片的SOP操作流程，具体实验室可能有特殊要求，需要根据具体情况进行调整。
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全部实验步骤1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时2 30%蔗糖脱水48小时以上3 -250C包埋（冰冻切片机内）4冰冻切片冰冻切片步骤冰冻切片免疫组化染色步骤：冰冻切片4~8μm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。
用3%过氧化氢孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS冲洗，5分钟×2次。
下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。
(见我发的前面的帖子)你确定你是冰冻切片吗冰冻切片不能用热修复啊！！！以下是我的步骤：1 冰冻切片室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。
用3％过氧化氢孵育5~10分钟，PBS洗，5分钟×2。
2 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
3 PBS冲洗，5分钟×3次。
4 滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟。
PBS冲洗，5分钟×3次。
5 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
6 PBS冲洗，5分钟×3次。
7 显色剂显色（DAB）。
8 自来水充分冲洗，复染，封片。
冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20分钟。
此配方不易产生脱片。
配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次新鲜配制。
冰冻切片免疫组化染色步骤冰冻切片4~8mm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。
用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×2。
下接免疫组化染色操作步骤。
免疫组化染色步骤：（SP试剂盒为例)1 冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。
用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×2。
2 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
3 PBS冲洗，5分钟×3次。
4 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
PBS冲洗，5分钟×3次。
5 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
6 PBS冲洗，5分钟×3次。
7 显色剂显色（DAB或AEC）。
8 自来水充分冲洗，复染，封片。
1.冰冻切片4um左右，室温25°C复温30min，浸入4°C预冷的丙酮固定10min，2.PBS（PH为7.2-7.4）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换）3.用3%过氧化氢一份，纯甲醇50份（需要现配，避光条件封闭，可以用纸盒盖住皿）30min。
4.PBS（PH为7.2-7.4，酸性）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换），甩去PBS，擦干切片周围的水分，用免疫组化笔或蜡笔在组织周围画一适当大小的圈，距离组织不宜太近，与切片组织保持5mm左右距离，太近会导致边缘效应。
5.5%BSA，室温孵育20min，期间注意观察，以免BSA干燥而导致背景太高，请注意在皿内玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。
6.甩去血清，PBS洗1min，擦干周边水分，圈内可不擦，但尽量要甩干，以免导致抗体浓度不均。
7.配置一抗工作液用5%BSA（抗体浓度为1:100），悬空加入一抗工作液50-100ul，枪头不要触及组织，以免损伤组织结构，滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡，混匀一抗，否则抗体可能附着不匀。
8.放入湿盒内，置于4°C冰箱过夜（最长不可超过48h），注意盖盖，放入后观察玻片是否处于水平位（否则抗体可能流失，导致玻片组织干掉，出现背景高和假阳性），孵育期间观察抗体是否干，若干了赶快用PBS清洗浸泡。
9.第二天上午取出玻片，置常温复温30min，后PBS冲洗1+5+5+5min，10.滴加1:100生物素标记的二抗（注意选择核对一抗来源，抗体加入稀释后在EP管内弹匀，掌上离心机离心）室温孵育30min-1h，后PBS冲洗1+5+5+5min。
11.滴加1:100比例稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素PBS稀释液（SABC）室温1h，后PBS冲洗1+5+5+5min，甩干，以免显色不均。
12.DAB显色，显色时放置在白色纸上，观察显色程度以终止DAB反应，最好把玻片置于显微镜上找到可能的阳性显色区域滴加DAB，观察到阳性区和阴性区差异后终止，此时最好有计时，以便于今后重复试验控制显色时间（一般显色时间2s-10min，显色时间过长背景高，且可靠性低）13.终止DAB显色可将玻片置于染色缸内，用自来水流水稀释终止5min，后在显微镜下观察是否有DAB颗粒附着。
14.甩干水分，苏木素复染（如为加汞的苏木素，显色时间为6-10s，可不用酒精分化，直接用PBS返蓝，如为非加汞苏木素，需在盐酸酒精分化），苏木素终止亦可用自来水冲洗终止反应。
15.水洗后梯度酒精脱水二甲苯透明（75%-85%-95%-100%-100%-二甲苯1-二甲苯2）个3min，滴加中性树胶封片，中性树胶浓度以不拉丝为宜16.封片后干燥1h(或者在通风橱吹风的情况下15min)，用棉球沾湿二甲苯擦去溢出的树胶。
观察照相。
针对脱片问题，我做了如下处理。
但仍存在脱片现象，麻烦您给我提一些相关的建议。
自来水冲洗玻片，晾干后，多聚赖氨酸的涂胶以下两种方法我都试过1.单涂胶：往一张玻片上加0.01%的多聚赖氨酸80ul，用另一张玻片推片，然后叠加其上，停留5分钟，中间推动玻片数次，使液体涂抹均匀，分开两张玻片，滤纸吸干玻片下缘，置玻片架上600C烤干1h备用。
2.双涂胶：往一张玻片上加0.01%多聚赖氨酸80ul,单涂胶600C烤干,同样方法重复涂胶1次"600C烤干,备用。
我用过的尼氏染色的方法，效果不错。
1．溶液配制：(1) 溶液A：焦油固紫0.2g, 纯水500ml(2) 溶液B：0.1M冰醋酸冰醋酸3ml，纯水500ml(3) 溶液C：0.1M无水醋酸钠无水醋酸钠4.1g，纯水500ml(4) 溶液D：PH3.5~4.5醋酸缓冲液B液94ml＋C液6ml(5) 工作液：A液10ml＋D液90ml 过滤后使用，避光保存注：焦油固紫遇光分解，整个过程应避光操作，可以用黑色塑料袋罩着。
2．具体步骤：⑴如果为石蜡切片，先进行脱蜡处理，然后从步骤⑵开始；如果为冰冻切片，从步骤⑵开始。
⑵将凉干的切片放入纯水中3～5min。
⑶切片放入焦油固紫染色液中1～1.5h。
⑷切片放入纯水中洗去浮色。
⑸切片放入70％－80％－95％的酒精分色，各几秒钟，时间自己掌握，以不见掉色为好。
⑹切片放入特殊分色液中褪背底（1：1：1的无水乙醇，氯仿，乙醚）。
⑺切片放入100％乙醇，5min×3次；二甲苯5min×3次，透明封固。
整个过程要保证切片不能干掉。
3、结果尼氏小体：深蓝紫色；核、核仁：浅紫色；背底：洁白无色。
我个人觉得特殊分色液挺重要的Highman甲醇刚果红染色法（类淀粉染色）1、试剂配制：甲醇刚果红染液: 刚果红0.5 g 甲醇80 ml 甘油20 ml碱性乙醇分化液: 氢氧化钾0.2 g 80%乙醇100 ml2、染色步骤:（1）切片脱蜡至水（2）甲醇刚果红染液染10～20分钟（3）用碱性乙醇分化液分化数秒（4）水洗（5）苏木素复染2分钟（6）水洗（7）脱水,透明,封固3、结果：淀粉样物呈桔红色。
4、类淀粉染色的应用：确定淀粉样变性及玻璃样变性的胶原组织，后者在刚果红法染色后呈淡桔色，冰冻切片脱脂问题：0.5盐酸乙醇分化液配置直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
试剂与仪器λ磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4λ荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释λ缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制λ搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）λ有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）λ荧光显微镜λ玻片架λ滤纸λ 37℃温箱等。
实验步骤1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS 三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。
观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30min已足够。
染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。
低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。
3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。
（1）标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。
（2）特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。