冰冻切片切片RNA FISH方法及详细步骤
冰冻切片技术各流程常用方法和试剂
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冰冻切片步骤很全面
冰冻切片步骤很全面冰冻切片是一种常用的实验技术，在生物学、医学研究、组织学观察等领域有着广泛应用。
以下是一份详细的冰冻切片步骤，旨在提供全面的指导。
注意，不同的实验目的可能会有一些差异，因此请根据实际需求调整步骤。
1.準备1.1获取你所需的样本。
这个样本可以是活体动物的组织，也可以是固定处理后的组织。
1.2准备冷冻介质。
通常使用的冷冻介质包括液氮、干冰和冷冻套。
液氮是一种非常冷的液体，可以迅速冻结样本。
干冰是固态二氧化碳，可以提供较低的温度。
冷冻套是一种装置，可以通过循环冷却剂来维持全套工具的较低温度。
1.3准备工具和设备。
这些工具和设备通常包括切片机、切片模具、刀片、显微镜片和刷子。
1.4调整工作环境。
确保实验室温度适宜、空气流通，并消毒工作台和其他工具。
2.样本取样和固定2.1根据实验目的，选择合适的样本区域。
例如，在动物研究中，你可能需要选择大脑的特定区域。
2.2切下样本。
使用手术器械，例如手术剪刀和手术刀，在样本区域周围切下足够大小的组织块。
2.3快速固定样本。
使用适当的固定液将样本固定。
常用的固定液包括10%缓冲福尔马林和4%聚乙二醇。
将样本完全浸没在固定液中，确保完全固定，避免其损伤。
3.冷冻3.1冷冻样本。
将固定的样本迅速置于冷冻介质中。
如果使用液氮，直接将样本放入液氮中。
如果使用干冰，将样本放入常温下事先准备好的干冰盒中，并立即放入冷冻套中。
3.2冷冻条件。
根据样本的性质和实验要求，选择适当的冷冻条件。
通常情况下，液氮的温度低于-150°C，而干冰的温度大约为-78°C。
3.3冷冻时间。
样本的冷冻时间取决于其大小和固定液的穿透性。
通常情况下，较小的样本需要较短的冷冻时间，而较大的组织块需要较长的冷冻时间。
一般而言，冷冻时间为几个小时到几天。
4.切片4.1为切片做准备。
在切片之前，将切片模具放在切片机上，并冷却至所需的温度。
同时，将刀片插入切片机。
4.2取出样本。
冰冻切片制片实验步骤及注意事项
冰冻切片制片实验步骤及注意事项冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。
因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。
冰冻切片制片实验步骤1、组织固定：新鲜组织固定于4%多聚甲醛24h以上。
将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整。
2、脱水：将修切好的组织放于15%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底后转入30%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底。
3、OCT包埋：将脱好水的组织取出用滤纸将表面水稍吸干后切面朝上放于包埋台上，组织周围滴上OCT包埋剂，将包埋台放在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋，OCT变白变硬后即可进行切片。
4、切片：将包埋台固定于切片机上，先粗切将组织面修切平整后即可开始切片，切片厚°8-10μm。
将干净的载玻片平放于切出的组织片上方即可将组织贴于载玻片上。
-20°保存备用。
注意事项1、组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有：① CO2气（-78℃）② 丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（-80℃）③ 液氮（-190℃）④ 液氮冷却的丙烷（-19℃）。
液氮适用于组织化学，较安全。
缺点：组织块易发生龟裂。
2、为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。
但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。
故不宜使用，低温，冷甲醛短时间固定（10分钟左右）固定，可显示琥珀酸脱氢酶。
3、电镜出现后，需要保存细胞的超微结构，以4%缓冲戊二醛（25%戊二醛16ml；0.1M二甲胂酸（pH7.）84ml；蔗糖8g）固定较好。
这些固定液主要用于水解酶，而不适于许多氧化还原酶和转移酶。
冰冻切片步骤 很全面
冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。
它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。
在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。
同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。
1.取材：应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。
2.速冻：为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需要，一般在取材后就要立刻对组织块进行速冻，使组织温度骤降，缩短降温的时间，减少冰晶的形成。
液氮速冻切片法是实验室最常用的速冻切片方法。
具体做法是将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。
在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。
若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。
3．固定：样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min 让OCT胶浸透组织。
取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。
组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。
4.切片：恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm。
切片时，低温室内温度以-15℃～-20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。
切好室温放置30min后，入4℃丙酮固定5~10min，烘箱干燥20min。
PBS洗5min×3。
进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。
可用3%H2O2孵育5~10min，消除内源性过氧化物酶的活性。
冰冻切片制作方法与注意事项
冰冻切片制作方法与注意事项冰冻切片是一种常见的制备生物组织切片的方法，其原理是将生物组织迅速冷冻并切割成极薄的切片，用于研究组织的形态结构和组织学变化。
下面是冰冻切片的制作方法和注意事项。
一、冰冻切片的制作方法：1.组织采集：选择需要研究的组织，如动物器官或植物部位，通常用组织固定剂进行固定处理，以保持组织的形态结构。
2.组织预处理：将固定的组织转移到含有蔗糖或蔗糖与聚乙二醇的冰冻液中，浸泡一定的时间使组织与冷冻液充分均匀接触，便于组织快速冷冻。
3.冰冻：使用液氮或刀片冷冻架等快速冷冻设备，将组织迅速冷冻至-20℃以下，使组织中的水分迅速形成冰晶，避免组织的形态结构变化。
4.切割：将冷冻的组织置于切片机或切片微波机上，用冷冻刀片将组织切割成薄片，通常厚度为10-30μm。
5.将切割好的切片用刷子或微型镊子移至载玻片上，通常用蛋白质固定剂或聚甲醛进行固定处理，以保持切片的形态结构。
6.干燥：将固定好的切片置于干燥器中，用适当的温度和时间干燥切片，使其充分固定在玻片上。
7.染色：根据需要可对切片进行染色处理，常见的染色方法有HE染色、银染色、免疫组化染色等。
二、冰冻切片的注意事项：1.快速冷冻：为了保持组织的形态结构和避免变形，必须采用快速冷冻的方法，将组织迅速冷冻至-20℃以下。
液氮和刀片冷冻架是常用的设备。
2.切片设备：选择适合的切片设备，如切片机或切片微波机。
刀片的选择也十分重要，常见的冰冻刀片有钢刀、玻璃刀和蜡刀，选择合适的刀片可以提高切片质量。
3.切片厚度：切割时要控制好切片的厚度，通常为10-30μm。
切片太薄容易导致组织切面不完整，切片太厚则不能得到清晰的显微镜图像。
4.切片技巧：切片技巧也很重要，需要稳定的手部技巧和耐心。
在切割时要保持刀片的稳定，避免划伤或碎裂组织。
5.切片保存：切好的切片需要妥善保存，可以用普通干燥器或冷冻干燥器进行干燥，避免切片变形和水分损失。
6.染色方法：根据需要选择合适的染色方法。
冰冻切片步骤很全面
冰冻切片步骤很全面1.标本采集：标本采集是制备冰冻切片的第一步，要确保标本的新鲜度和完整性。
采集时需注意使用无菌器械，避免受到外界污染。
对于细胞切片，可采用细胞培养技术培养的细胞；对于组织切片，采集适量的组织，尽量保持其原有结构。
2.固定：在采集后，为了防止细胞或组织的结构和形态发生变化，需要进行固定处理。
常用的固定方法有：a.4%的硫酸镁：使用4%的硫酸镁固定剂，固定15-30分钟。
b.4%的甲醛：使用4%的甲醛固定剂，固定15-30分钟。
c.10%的缓冲福尔莫林：使用10%的缓冲福尔莫林固定剂，固定4-24小时。
3.包埋：包埋是将固定的细胞或组织进行预处理，以便后续的冷冻切片。
常用的包埋方法有：a.脱水：使用不同浓度的乙醇进行脱水处理，通常有70%、80%、95%和100%四个浓度。
b.渗透剂：使用溶解在脱水剂中的渗透剂，如氯仿、苯酚、醋酸酯等，以提供组织切片的硬度和稳定性。
c.包埋剂：将脱水后的组织切片放入包埋剂中，如石蜡、冻脂等；对于细胞切片，可直接在载玻片上进行包埋。
4.冰冻：冰冻是制备冰冻切片必不可少的步骤，它能够保持细胞或组织的原有形态和结构。
常用的冰冻方法有：a.冷冻板法：将包埋好的标本放置在预冷冻的金属冷冻板上，然后放入液氮中进行快速冷冻。
b.冷冻微才法：将包埋好的标本进行逐步冷冻，在每一步冷冻前都将标本表面的水分吹干。
c.冷冻机法：使用专用的冷冻机进行冷冻，通常温度在-20至-30°C。
5.切片：切片是冰冻切片的核心步骤，需要使用显微切片机或冰冻切片机进行操作。
切片前需将冷冻的标本块取出，等待恢复到适宜切片的温度（一般为-20至-30°C）。
然后，使用坚硬的切片刀或切片刀片切取薄片，通常厚度为5-20微米。
切片时需注意保持刀片的锋利度和角度，以保证切片的质量。
总结：冰冻切片是一种常用的生物学实验和临床诊断技术，它通过对细胞和组织进行固定、包埋、冰冻和切片等步骤，帮助研究人员观察和分析样本的结构。
划重点！冰冻切片流程和注意事项都在这了！快快get起来~
划重点！冰冻切片流程和注意事项都在这了！快快get起来~冰冻切片定义冰冻切片是指新鲜组织不经过任何固定、脱水、透明等处理，不需要石蜡包埋，直接在冰冻切片机上进行切片的一种方法。
冰冻切片特点：操作简单，耗时短，对组织抗原损伤小，对环境污染小。
冰冻切片流程（10-15min内即可完成）：取材→包埋（<30s）→冷冻（1-3min）→切片（2-5min）→固定（10-15s）→染色（4-5min）→封片（<1min）1、取材（1）新鲜组织取材不能遇水，如果组织自身带水较多，可用滤纸吸干（目的是为了防止冰晶空洞等现象在切片过程中产生）；（2）取材的工具也要保持干燥，取材时所取的范围应尽量避开出血坏死区域及脂肪区域；（3）取材组织大小要合适，厚度尽量在3mm，最多不要超过5mm（组织过大切片时阻力加大，易产生刀痕和褶皱）。
2、包埋（1）包埋机一般使用OTC或普通胶水，OTC包埋剂质感细腻，对刀片损伤小，有利于切片；（2）包埋时要将包埋剂涂抹均匀，确定好组织的包埋方向，例如管腔、皮肤、囊壁等要竖立包埋；（3）包埋体积较小的组织，可以先挤压少许的包埋剂形成一个平台，再放入小组织进行包埋。
3、冰冻温度与时间（1）冰冻温度与时间是冰冻切片的关键步骤，要根据组织的类型和大小来调节；（2）冰冻温度过低，会造成组织过硬，切片碎裂；温度过高会造成组织硬度不够，难以切片；（3）不同组织冰冻切片适宜温度：4、切片（1）在组织和包埋剂冷冻到发白后即可开始切片；（2）切片时右手摇动手轮要力道均匀、柔和、缓慢，切片厚度控制在5um左右，左手持毛笔在切片形成时轻按住组织边缘，使其不发生卷曲；（3）将切片展平粘贴在干净的载玻片上，应立即放入固定液中固定，如果固定不及时，会发生细胞退变，切片中细胞核模糊不清呈雾状。
5、染色流程：固定（95%乙醇）→苏木素→水洗→盐酸乙醇分化（0.5~1%）→水洗→温水返蓝→伊红→梯度酒精→二甲苯透明→封片6、注意事项（1）纤维及结缔丰富的组织，应顺着纤维纹理切片，否则容易崩裂；（2）较硬较脆的组织应尽量切的薄一些；（3）选择合适的固定液（95%乙醇、甲醛、甲醇、丙酮），且固定液要保持新鲜，及时更换固定液；（4）组织尽量快速冷冻，组织间隙的自由水易冷冻凝结形成冰晶，组织冷冻越缓慢，冰晶形成的数量越多，体积越大。
细胞RNA FISH 方法
细胞RNA FISH1.24孔板接种细胞爬片（根据实验需求，确定RNA FISH的时间）；2.预冷PBS清洗1-2次后，用4% RNase-free PFA常温固定15分钟；3.PBS洗3×5min，0.2-0.5% Triton X-100室温通透5min；4.PBS洗3×5min，80%-90%-100%酒精梯度各2-3min；5. 50% formamide（混合后）和2×SSC（按1:1体积混合？是混合前甲酰胺是50%，混合后应该是25%？还是混合前是100%，混合后成了50%?是否可以写成“将甲酰胺和2×SSC按1:1体积混合”可以这样写）中室温下10 mins；6. PBS 洗3×5min，每孔加入25ul杂交液，50℃杂交炉中保持4-8h；7.每孔加入60 μl含有探针的变性杂交液（按每片加入30-60ng地高辛标记的lncRNA反义链探针），50℃杂交炉中过夜。
8.使用0.1×SSC+0.1% SDS +50% formamide（配10ml—5ml formamide+0.01g SDS+5ml 0.1×SSC，此处的甲酰胺是100%的？--是的，甲酰胺是100%。
加入后成了50%?）在50℃下洗2×30min；50℃下再使用0.2×SSC+50% formamide（按5ml formamide+5ml 0.2×SSC配制）洗30 mins；9. 每孔加90μl 20%绵羊血清（50μl绵羊血清+200μl B1溶液），室温下1h；10.每片加入60μl(按0.1μl抗地高辛抗体+250μl 10%绵羊血清配制）混合液，4℃过夜。
11.PBS 洗3×5min后，每片加入10μl 200μg/ml DAPI，室温下10min；12.PBS 洗3×5min，加入10ul抗猝灭剂，反盖在载玻片上并用rubber cement封片，镜检观察并拍照。
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冰冻切片切片RNA FISH方法及详细步骤
1.检测原理RNA 荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization），简称为
RNA FISH，是一种重要的非放射性原位杂交技术。
传统的RNA FISH，直接在oligos 上标记荧光素，根据碱基互补配对原则，与待检测的RNA 特异结合，通过荧光显微镜以检测荧光信号，该方法一般需要20 个oligos 以上，以便检测到较强较多的荧光信号点。
本系统中SA（链霉亲和素蛋白）是一类四聚体蛋白，大小为66 KDa，每一分子SA 能够与四分子生物素进行高度特异性的结合，且两者之间的亲和力较强。
应用该原理，我们将染料Cy3 偶联到SA 蛋白上，一分子SA 能偶联上6 个Cy3；同时在探针上标记生物素，将两者在体外进行亲和连接，大约每个SA 能与4 条oligo-Biotin 结合，每个SA 上有6 个Cy3，也就是每一条探针上连接了 6 个Cy3，因此该方法具有一定的放大信号的作用。
1.具体步骤：
1) 复水冰冻切片取出，每张切片滴加Buffer B 100 μl，室温放置15 min（使组织细胞恢复活性）；
2) 吸弃Buffer B，PBS 洗切片两次，每次5 min（建议在染缸中进行）。
2.蛋白酶K 消化
1) 蛋白酶K 工作液预热至37ºC；
2) 每张切片滴加蛋白酶K 工作液100 μl，37ºC 孵育20 min(消化时间请根
据不同样本进行调整)；
3) 吸弃蛋白酶K ，每张切片滴加100 μl 1×封闭液，37 度30 min；
4) 吸弃1×封闭液，每张切片滴加100 μl 2× Buffer C 在室温下漂洗切片3
次，每次1 min。
3.变性
1) 78 ºC 预热变性液；
2) 每张切片滴加预热变性液100 μl，78 ºC 孵育8 min；3) 梯度酒精70%、
80%、90%、100% 脱水，每次2 min，空气中干燥（建议在染缸中进行）。
4.杂交
1）Buffer E 提前在73ºC 水浴锅孵育30 min，至澄清透亮；
2）探针稀释：可参看标签或报告单上所示参数：nmole/OD260，例如：nmole/OD260= 4.17，则在每OD 探针干粉制品中加入41.7 μl 灭菌DEPC 水，混匀后即得浓度约为100 μmol/L 的储存液，建议进行分装后避光储存于-20℃，避免多次冻融操作；
3）配制探针工作液：将探针储存液稀释至1 μmol/L，放入75℃水浴锅变性
10 min，然后与SA-Cy3 按比例加入到PBS，（以10 μl 体系为例，即1 μl
1 μmol/L biotin-probe + 1 μl 1 μmol/L SA-Cy3 + 8 μl PBS），37 度孵育30 min(可
做预实验确定探针和SA-Cy3 的比例，例如1:1，2:1，4:1，8:1 等)；
4）将上述10 μl 探针工作液和90 μl Buffer E 混匀；
5）准备湿盒，水平放置切片，每张切片滴加100 μl 变性后的探针混合液，盖上盖玻片，用封片胶封片；
6）置于原位杂交仪中，37 ºC 孵育12-16 h（若无杂交仪可滴加100 μl 变性后的探针混合液，直接37 ºC 培养箱孵育12-16 h）。
5.杂交后水洗
1) 43 ºC 预热杂交后水洗溶液；
2) 轻轻去掉盖玻片，吸弃杂交溶液，每张切片滴加预热的杂交后水洗溶液
100 μl 洗切片15 min；3) 每张切片滴加2×Buffer C 100 μl ，60℃ 洗3 次，每次10 min；4) 吸弃2×Buffer C，每孔加入100 μl 的2×Buffer C，置于37℃洗涤10 min，洗涤3 次。
(如果背景深时，建议适当提高洗涤温度及次数)
6.细胞核染色
1) 每张切片加100 μl 稀释好的DAPI 工作液，在室温下避光孵育10-20
min（根据样本的种类，建议适当调整DAPI 的浓度及染色时间）；
2) 吸弃DAPI 工作液，PBS 洗切片2 次，每次2 min（建议在染缸中进行）；
3) 滴加甘油或抗淬灭剂，盖上盖玻片，封片胶封片，于荧光显微镜下观察。