DNA连接试验复习课程

D N A连接试验DNA连接试验当我们已经获得目的基因片段，选择好适当的克隆（或表达，转化）质粒载体，并确定重组方案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段之间的体外连接，从而获得重组子。

此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因工程药物的生产），还可用于序列分析和转基因等重要生物技术的研究中。

DNA连接实验原理：ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下，由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程，ＤＮＡ分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。

带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。

因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA 的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。

利用T4 DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA 5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。

如载体的两条链都带有5’磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA 带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。

不对称粘性末端：两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA可以定向插入到载体中。

对称性粘性末端；线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理；载体与外源DNA 连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载体中。

3、平端：要求高浓度的DNA和连接酶；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；非重组克隆的背景较高。

粘性末端连接：实验试剂：用适当的限制酶消化质粒和外源ＤＮＡ。

如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒ＤＮＡ。

通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化ＤＮＡ，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。

10×T4DNA连接酶buffer（该缓冲液应分装成小份，贮存于－20℃。

）：200mMTris-HCl(pH7.6)；50mMMgCl2；50mM二硫苄糖醇500μl/ml BSA（可用可不用）T4DNA连接酶%5mM ATP实验步骤：1、在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：1) 10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1-1∶5），补足ddH2O 至8μl。

2) 轻轻混匀，稍加离心，于45℃水浴５分钟使重新退火的粘端解链，迅速将混合物转入冰浴。

3) 加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位，用ddH2O 补至10μl。

2、盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心５秒。

3、１２℃下过夜连接反应。

4、反应结束后于－２０℃保存。

5、再设立两个对照反应，其中含有（１）只有质粒载体；（２）只有外源ＤＮＡ片段。

如果外源ＤＮＡ量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒ＤＮＡ，并尽可能多加外源ＤＮＡ，同时保持连接反应体积不超过10μl。

可用至少３种不同方法来测定Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶的活性。

注意事项：1、连接反应的温度：ＤＮＡ连接酶的最适反应温度为３７℃，但在此温度下，粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是１２℃过夜。

2、 DNA的平未端和粘性末端：由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。

二者连接效率不同。

粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的。

3、碱性磷酸酶处理质粒载体：为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的浓度，增加重组子比例。

这样就会出现ＤＮＡ自生连接问题，为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化，通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。

4、连接反应的检测：连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌，阳性克隆的筛选来确定。

5、如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效，可重新连接酶切后的λDNA。

若连接成功，则说明有效。

平端DNA连接：Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶不同于大肠杆菌ＤＮＡ连接酶，它可以催化平端ＤＮＡ片段的连接（Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978），由于ＤＮＡ很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。

有了这样的物性，才能使任何ＤＮＡ分子彼此相连。

优点：1、没有连不上的，只有切不开的。

平末端连接不牵扯到粘性末端的碱基突出问题，所以，理论上任何两条DNA序列都能连接在一起，当然需要ligase 的酶学作用。

这个不同DNA分子之间的连接带来了极大地便利，因为平末端自然是这样，而如果遇到5‘或者3’突出的粘性末端，也可以经过处理成为平末端。

2、有时候，两个平末端连接在一起以后，可以产生另一种内切酶的识别序列，为后续的克隆工作提供了一种机会。

缺点：1、连接效率比粘性末端低：连接效率之所以比较低，原因之一是在连接过程中只有连接酶的作用，缺乏粘性末端那样突出碱基的互补作用；原因之二是常用的T4DNAligase对于平末端的Km值比粘性末端高1000倍。

2、可能产生双向插入：由于平端连接的末端没有特异性，连接的时候不能定向，所以两种方向的插入都有可能。

这个时候就需要有一种有效的鉴定方法。

一般分别在载体和目的片段选择一个酶切位点进行酶切鉴定，当然，具体的鉴定方法要根据具体的实验而定。

3、可能多拷贝插入：平端连接时，可能目的片段多个插入，并且在多个插入的时候还有可能每个插入子以不同方向连接，导致有时候结果难以解释。

一般目的片段越大，多拷贝插入的可能就越小。

平端连接要求的条件：1、低浓度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981）。

2、不存在亚精胺一类的多胺。

3、极高浓度的连接酶（50Weiss单位．ml）。

4、高浓度的平端实验试剂：凝聚剂：在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致ＤＮＡ分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT Ｈarrison,1985)或氯化六氨全高钴（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得适当浓度的平端ＤＮＡ的总是迎刃而解。

在连接反应中，这些物质具有两作用：1、它们可使平端ＤＮＡ的连接速率加大１－３个数量级，因此可使连接反应在酶ＤＮＡ浓度不高的条件下进行2、它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。

这样，即使在有利于自身环化（j:i=10）的ＤＮＡ浓度下，所有的ＤＮＡ产物也将是线状多聚体聚乙二醇（PEG8000）：1、用去离子水配制的ＰＥＧ8000贮存液（40％）分装成小份，冰冻保存，但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。

在含15％PEG 8000的连接反应混合物中，对连接反刺激效应最为显著。

除PEG 800和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶以外，其他所有连接混合物的组分应于０℃混合，然后加适当体积的PEG 8000（处于室温），混匀，加酶后于20℃进行温育。

2、连接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2时对连接反应的刺激效应最为显著，甚至ATP浓度略有增加或ＭgCl2浓度略有降低，都会严重降低刺激的强度（Pheiffer和Zimmerman,1983）。

3、浓度为15％的PEG 8000可刺激带粘端的ＤＮＡ分子的连接效率提高至原来的10-100倍，反应的主产物是串联的多联体。

4、 PEG 8000可刺激短至８个核苷酸的合成寡聚物的平端连接，在这一方面，它与氯化六氨合高钴有所不同。

氯化六氨合高钴：1、氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20℃，它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。

当连接反应混合物中盐深度为1.0-1.5μmol/L时，其刺激作用最大。

氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50W部，但只能使端连接的效率提高到原来的５倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。

2、在单价阳离子（30mmol/L KCl）存在下，它对平端连接仍有一定的刺激作用，但此时连接产物的分布有所改变。

连接产物不再是清一色的分子间连接产物，相反，环状ＤＮＡ将点尽优势。

3、与ＰＥＧ 8000不同，氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。

实验步骤：(以20ul 酶切完后的体系为例）1、如果要补平或切平,先将样品置于70度水浴10min,将体系放大到50ul，其中按照说明书加入所需klenow buffer和酶，以及BSA等。

2、常温反应10min后将反应物置于37度水浴，再加入T4聚合酶，反应5min。

3、凝胶回收处理的载体或片断。

4、 CIAP处理。

5、苯酚氯仿纯化，最后乙醇回收。

6、连接反应。

注意事项：1、插入片断和载体片断的比例要高。

2、连接酶要加的多点，最好用高浓度的酶。

3、载体片断要做去磷酸化处理。

4、也可以用15％的PEG8000来增加连接效率和减少载体自联。

5、反应体系10UL，不要太大。

6、载体片断不要加多了，一般酶切跑賋并割胶纯化并去磷酸化后加0。

5微升就可以了。

7、去磷酸化的步骤要根据自己酶的性质而定，一般要反应一个小时，在反应半小时后再补充酶再反应半小时。

8、插入片断和载体片断要酶切良好。