生物芯片
生物芯片分析
本章提纲
生物芯片简介与沿革 生物芯片的分类 基因芯片基本原理、流程与应用 蛋白质芯片及应用 其它芯片技术
第一节 生物芯片简介与沿革
什么是生物芯片 生物芯片(Biochip)主要指
通过平面微细加工技术，在 固体芯片表面等载体上的微 型生物化学分析系统，以实 现对细胞、蛋白质、核酸以
图像处理
1. 栅格化：确定点的位置 2. 图象分割 (Segmentation)：将点从背景中分离出来。 3. 抽提亮度：各个像素亮度的平均值 (mean)或中位数
(median) 4. 背景校正：局部或全局
植根区域生长法(SRG) Fixed Circle
基因表达量的定量
对于每个点，我们可以计算 Red intensity = Rfg - Rbg
1. cDNA microarrays: 将500~5,000bp的cDNA固 载到介质上 (例如玻璃)，Stanford开发设计，通 常为双通道
2. DNA chips: 将寡核苷酸探针 (20~80-mer) 合成 到芯片上，Affymetrix开发设计，通常为单通道
(1) cDNA microarrays
按实验要求分类
1. 单通道 (Single Channel): 一次检验一种状态 2. 双通道 (Dual Channel): 差异表达基因的筛选
1 片上原位合成寡核苷酸点阵芯片（ONA） 2 微量点样技术制作的CDNA 点阵芯片（CDA） ONA特点： （1）易寻址，利用组合化学的原理安排各寡核苷
(1) 差异表达基因的分析
1.差异表达基因的分析: 寻找处理前后表达上调或者 下调的基因
2. Are the treatments different 3. 使用标准的统计学方法检验 (t-test or f-test)，发
生物芯片技术简介及应用
生物芯片技术简介及应用一、生物芯片概念生物芯片（biochip）是指通过微加工技术，将生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至细胞，组织切片等生物样品，有序地固化于支持物表面，然后与已标记的探针杂交，通过特定仪器如激光共聚焦显微扫描仪或电荷偶联元件（charge-coupled device，CCD）等对杂交信号的强度进行快速、并行、高效的检测，再经计算机分析和处理数据，从而获得相关生物信息。
由于常用玻片或硅片作为固相支持物，其与半导体芯片都有高度集成的特点，故称之为生物芯片。
生物芯片技术是20世纪90年代中期以来影响最深远的科技进展之一，是集生物学、物理学、化学、微电子学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术。
由于该技术可将大量的探针同时固定于固相支持物上，所以一次可以对大量的生物分子进行检测，从而解决了传统生物学分析方法复杂、自动化程度低、检测物数量少（通量低）等不足。
另外，通过设计不同的阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序（sequencing by hybridization，SBH）等，为“后基因组计划”时代基因功能的研究及临床检验诊断学发展提供了强有力的工具。
同一种芯片从不同的角度，可有不同的归类组别和定位。
最为通用的分类方法是根据芯片基片上固定的探针分子不同，将生物芯片分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片等。
二、生物芯片的应用生物芯片技术可广泛应用于疾病诊断和治疗、药物筛选、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防、航天等许多领域。
它将为人类认识生命的起源、遗传、发育与进化、为人类疾病的诊断、治疗和预防开辟全新的途径，为生物大分子的全新设计和药物开发中先导化合物的快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平台。
（一）疾病诊断基因芯片诊断技术以其快速、高效、灵敏、经济、平行化、自动化等特点，已成为一项现代化诊断新技术。
生物芯片
生物芯片及应用简介一、简介生物芯片（biochip)是指采用逛到原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品有序地固化于支持物（比如玻璃、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二维分子排列，然后与标记的待检测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分心，从而判断样品中靶分子的数量。
由于常用玻片/硅片作为固相支持物，且在制备过程模拟计算机芯片的制备技术，所以称之为生物芯片技术。
根据芯片上的固定的探针不同，生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片，另外根据原理还有原件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片、如果芯片上固定的是肽或蛋白，则称为肽芯片或蛋白芯片；如果芯片上固定的分子是寡核苷酸探针或DNA，就是DNA芯片。
由于基因芯片（Genechip）这一专有名词已被业界的领头羊Affymetrix公司注册专利，因而其他厂家的同类产品通常称为DNA微阵列（DNA Microarray）。
这类产品是目前最重要的一种，有寡核苷酸芯片、cDNA芯片和Genomic芯片之分，包括二种模式：一是将靶DNA固定于支持物上，适合于大量不同靶DNA的分析，二是将大量的探针分子固定于支持物上，适合于对同一靶DNA进行不同探针序列的分析。
生物芯片技术是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。
由于用该技术可以将及其大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可以对大量的生物分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交（Southern Blotting 和Northern Blotting等）技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量（low through-put）等不足。
生物芯片
化学喷射技术
将事先合成好的寡聚核苷酸探针喷射到芯片上指定
的位置 优点：定量、准确，重现性好,使用寿命长 缺点：喷印的斑点大，探针密度低（每平方厘米只 有400个探针）
4.样品制备
• 待分析基因在与芯片结合探针杂交之前必需进 行分离、扩增用标记。根据样品来源、基因含 量用检测方法和分析目的不同，采用的基因分 离、扩增及标记方法各异。 • 为了获得基因的杂交信号必须对目的基因进行 标记，目前采用的最普遍的荧光标记方法与传 统方法如体外转录、PCR、逆转录等。原理上 并无多大差异，只是采用的荧光素种类更多， 这可以满足不同来源样品的平行分析。
点样法
点样法是将合成好的探针、 cDNA或基因组DNA 通过 特定的高速点样机器人直 接点在芯片上。采用的机 器人有一套计算机控制三维移动装置；多个打印 喷印头；一个减震底座，上面可放内盛探针的多 孔板和多个芯片。
优点：探针密度高（每平方厘米2500个探针），芯片制造速 度快
缺点：探针需事先合成、纯化，定量准确性及重现性不好
目前芯片价格昂贵，实际应用受到一定限制。各 大公司正在实行技术共享以降低成本。 探针的合成与固定比较复杂，难以保证好的聚合 效果，一些新的方法正应运而生。
3.前景
• 目前国外正在致力于这些问题的解决与 研究，国内也有研究者正在积极地开展 该项研究工作。我们有理由相信，随着 该技术的不断完善与发展，在将来，无 论是基因芯片还是蛋白芯片都会作为一 种简便快捷的技术，为我们的研究工作 与临床检测带来极大的便利。
4）光刻掩膜 5）按上述步骤选择性保护、偶联、即可接上第二个
核苷酸（如C） 6） 重复 光引导固相合成芯片上寡核苷酸阵列 采用这种技术生产的DNA芯片探针阵列密度可以高达
106-1010/cm2，即在1厘米见方的片基上排列几百万个
生物芯片技术
生物芯片技术的主要类型包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片等，其中基因芯片是最 常用的生物芯片技术之一。
生物芯片的分类
基因芯片 蛋白质芯片 细胞芯片 组织芯片
生物芯片技术：微小的 大科学
,a click to unlimited possibilities
汇报人：
目录
01 生 物 芯 片 技 术 的 定 义与分类
03 生 物 芯 片 技 术 的 优
势与局限性
05 生 物 芯 片 技 术 的 挑
战与对策
02 生 物 芯 片 技 术 的 应 用领域
04 生 物 芯 片 技 术 的 发 展趋势与前景
物多样性
司法鉴定：用 于法医鉴定、 亲子鉴定和基
因图谱绘制
Part Three
生物芯片技术的优 势与局限性
优势
高通量：一次可检测大量样本 高灵敏度：能够检测低浓度的生物分子 高特异性：能够准确区分不同的生物分子 自动化程度高：减少人工操作，提高工作效率
局限性
成本高昂：生物芯片技术的研发和生产成本较高，限制了其在某些领域的应用。
生物芯片技术在 药物研发中的应 用前景
生物芯片技术在 食品安全检测中 的应用前景
生物芯片技术在 环境保护和生态 监测中的应用前 景
Part Five
生物芯片技术的挑 战与对策
技术挑战
芯片制造技术：需要高精度、高稳定性的制造技术 数据分析技术：需要高效、准确的数据分析技术 生物样本制备技术：需要标准化、自动化的生物样本制备技术 生物芯片应用拓展：需要不断拓展生物芯片技术的应用领域
《生物芯片》课件
技术挑战与解决方案
技术成熟度
生物芯片技术仍处在不断发展和 完善阶段，面临着诸多技术挑战 ，如灵敏度、特异性、可重复性
等。
解决方案
针对技术挑战，科研人员正在不断 探索和开发新的技术方法和解决方 案，如改进芯片制作工艺、优化检 测系统等。
标准化和规范化
为了提高生物芯片技术的可靠性和 可重复性，需要制定标准化的制作 和检测流程，推动技术的规范化应 用。
VS
详细描述
生物芯片技术也可应用于环境监测和食品 安全检测领域。通过检测环境样本中微生 物种类和数量，生物芯片技术能够评估环 境质量，为环境保护提供科学依据。在食 品安全方面，生物芯片技术可用于检测食 品中的有害物质、农药残留等，确保食品 质量和安全。
PART 05
生物芯片的挑战与前景
REPORTING
差异表达分析
比较不同条件下的分子表达谱 ，找出差异表达的基因或蛋白 质。
功能注释
对差异表达的基因或蛋白质进 行功能注释，揭示其在生物学 过程中的作用。
通路分析
对差异表达的基因或蛋白质进 行通路分析，揭示其在特定生
物学通路中的作用。
PART 03
生物芯片的类型与比较
REPORTING
DNA芯片
DNA芯片是一种高通量检测技术， 用于检测基因表达、基因突变和基因 组测序等方面。
详细描述
在新药研发和筛选过程中，生物芯片技术发挥着重要作用。利用生物芯片可以对大量候 选药物进行高通量筛选，快速找出具有潜在治疗作用的候选药物。同时，生物芯片技术
还可以用于研究药物作用机制和药物之间的相互作用，为新药研发提供有力支持。
环境监测与食品安全
总结词
生物芯片技术可以用于环境监测和食品 安全检测，保障公众健康和生态安全。
生物芯片的原理及应用
生物芯片的原理及应用生物芯片（Biochip）是一种具有微小尺寸的芯片，可以用于生物分析和生物诊断。
生物芯片的原理是将生物分析的技术和微电子技术相结合，通过微加工技术将生物分子携带的信息载体（例如DNA、RNA）固定在芯片表面的微小区域上，然后利用这些分子与特定的生物样品进行相互作用，通过检测分子之间的相互作用来实现对生物样品进行分析和诊断。
生物芯片可以分为两类：基于DNA的生物芯片和基于蛋白质的生物芯片。
基于DNA的生物芯片主要应用于基因分析和基因诊断，可以实现对大量基因的快速检测和分析。
而基于蛋白质的生物芯片主要应用于蛋白质相互作用的研究和蛋白质组学的高通量分析。
这两类生物芯片均适用于基因工程、生物医学研究、药物筛选等领域。
生物芯片的应用非常广泛。
在基因分析领域，生物芯片可以同步检测数万个基因，加快基因测序和基因变异的发现，为研究基因与疾病之间的关系提供了有力的工具。
例如，通过生物芯片可以对癌症患者的基因表达谱进行分析，从而帮助医生确定治疗方案。
在疾病诊断领域，生物芯片可以快速、准确地检测病原体（如细菌、病毒等）的存在，为临床医学提供了重要的辅助手段。
例如，通过生物芯片可以检测病毒的种类和数量，从而帮助医生进行感染性疾病的诊断和治疗。
除了基因分析和疾病诊断，生物芯片还可以用于药物研发和毒性测试。
生物芯片可以模拟人体器官的功能，通过外界刺激来观察药物对机体的影响，从而筛选出具有潜在药效的化合物，加快新药的开发速度。
此外，生物芯片还可以用于研究环境污染、农业育种和食品安全等领域。
然而，生物芯片的应用还面临一些挑战。
首先，生物芯片的制作需要复杂的微加工工艺，成本较高。
其次，生物芯片在与生物样品相互作用的过程中容易受到杂质的干扰，从而影响分析结果的准确性。
另外，生物芯片的数据处理和分析需要专业的知识和软件支持，对研究人员的要求较高。
综上所述，生物芯片是一种用于生物分析和生物诊断的技术工具，其原理是将生物分子固定在芯片上，并与特定样品进行相互作用来实现分析和诊断。
生物芯片实验报告
实验名称：基因表达水平检测实验目的：1. 学习和掌握生物芯片技术的基本原理和操作流程。
2. 通过基因芯片技术检测特定基因在不同样本中的表达水平。
3. 分析实验数据，验证实验结果的可靠性。
实验材料：1. 基因芯片：包含待检测基因和对照基因。
2. 样本：待检测的组织或细胞。
3. 标准品：已知表达水平的对照样本。
4. 实验试剂：包括核酸提取试剂、PCR扩增试剂、杂交试剂、洗涤液等。
5. 仪器设备：PCR仪、杂交仪、荧光显微镜、凝胶成像系统等。
实验步骤：1. 样本处理：- 提取待检测样本的总RNA。
- 使用DNase I去除DNA污染。
- 通过RNeasy Mini Kit进行纯化。
2. cDNA合成：- 使用Oligo(dT) primers进行第一链合成。
- 使用Reverse Transcriptase进行第二链合成。
3. PCR扩增：- 使用PCR试剂进行目的基因的扩增。
- 通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
4. 标记：- 将扩增产物与荧光标记的寡核苷酸探针杂交。
5. 杂交与洗涤：- 将杂交后的芯片放入杂交仪中进行杂交。
- 使用洗涤液进行洗涤。
6. 扫描与分析：- 使用荧光显微镜或凝胶成像系统扫描芯片。
- 使用软件分析杂交信号，计算基因表达水平。
实验结果：通过实验，成功地将待检测基因的cDNA与荧光标记的探针杂交，并在芯片上得到了清晰的信号。
通过比较待检测样本与标准品的结果，可以判断待检测基因在不同样本中的表达水平。
数据分析：1. 对比待检测样本与标准品的信号强度，计算基因表达水平的相对值。
2. 分析不同样本之间基因表达水平的差异。
3. 对比实验结果与已知文献报道的结果，验证实验结果的可靠性。
结论：本次实验成功利用生物芯片技术检测了待检测基因在不同样本中的表达水平。
实验结果表明，生物芯片技术在基因表达水平检测方面具有高效、准确、高通量的特点，为基因功能研究和疾病诊断提供了有力工具。
实验讨论：1. 实验过程中可能存在的误差来源，如RNA提取、PCR扩增、杂交等步骤的误差。
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Incorporation Detection Deblock; fluor removal
3’ OH free 3’ end
Next cycle
Sequencing-by-Synthesis (SBS)
3’ 5’
Cycle 1: Add sequencing reagents First base incorporated Remove unincorporated bases
• • • 高度自动化的系统 读取片段多，适合进行大量小片段的测序，如microRNA profiling 基于可逆反应，随反应轮数增加，效率降低，信号衰减，读取序列较短，给de novo sequencing 拼接带来困难
SOLiD sequencing
• • • 每个碱基读取两次非常高的准确性，特别是对于SNP的检测 灵活的系统，完善的磁珠编码系统，可以进行样品的pooling，分割测序区域 读取长度受连接反应的轮数限制，给de novo sequencing 拼接带来困难
A T G C G C A G A T G C T T A C G A T A C C C G A T C G A T
Detect signal Cycle 2-n: Add sequencing reagents and repeat
C T
1、每轮测序反应加入四种带有荧光标记的dNTP，末端带有可 以被去除的阻断基团 2、每轮反应只能整合一个核苷酸，仪器读取相应的荧光信号 3、信号读取结束，用化学方法去除阻断基团，进行下一轮测序 反应
Roche 454 焦磷酸测序 Pyrophosphate Sequencing
Illumina Solexa 合成测序 Sequence by Synthesize
ABI SOLiD 连接法测序 Sequence by Ligation
Roche 454 焦磷酸测序 Pyrophosphate Sequencing 基本原理
连接法测序 （二）
测序引物沿着Adapter移动 次，确保每个位点都被检测 移动5次 测序引物沿着 移动
连接法测序 （三）
0位置是 位置是Adapter的最后一个碱基，因此只检测一次， 的最后一个碱基， 位置是 的最后一个碱基 因此只检测一次， 该碱基是进行解码所必须的。 该碱基是进行解码所必须的。
20 microns
Reversible Terminator Chemistry 可逆终止反应
• All 4 labelled nucleotides in 1 reaction
O HN O PPP O N
cleavage fluor site
O 5’ DNA O HN O O N
X
3’
block
454 sequencing： Emulsion PCR (emPCR) ：
A
+ PCR Reagents + Emulsion Oil
B
Micro-reactors Adapter carrying library DNA Mix DNA Library & capture beads (limited dilution) Create “Water-in-oil” emulsion
454 sequencing： Deposition of DNA beads into ： the PicoTiter™Plate
Load beads into PicoTiter™Plate Load Enzyme Beads
Centrifuge Step
Illumina Solexa 合成测序 Sequence by Synthesize 基本原理
Sequenced short reads (typically 25–50 bp) from ChIP-Seq experiments are first mapped onto the reference genome. The mapped reads are then used to estimate statistical parameters, which include the estimation of the average length F of sequenced DNA fragments.
Gene Description
Ribosomal protein L29 Peroxiredoxin 2 Profilin 2 Stathmin-like 4 Cytochrome c oxidase subunit Vb Gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor, alpha 1 Ubiquitin B Ring finger protein 1 DIRAS family, GTP-binding RAS-like 2 PHD finger protein 20 Immunoglobulin J polypeptide Fibronectin 1 Nuclear factor I/X (CCAAT-binding transcription factor) Topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa Keratin 8 Integrin, beta 7 Brain abundant, membrane attached signal protein 1 Dopamine receptor D1 interacting protein Glial fibrillary acidic protein Amyloid beta (A4) precursor-like protein 2
Solexa 测序 Workflow
ABI SOLiD 连接法测序 Sequence 利用探针的连接反应读取模板的 利用探针的连接反应读取模板的DNA序列 序列
1024种8碱基探针 4色荧光，4种双核苷酸，每色荧光有256个探针(4^6)
连接法测序 （一）
测序引物与adapter退火 测序引物与adapter退火 adapter
探针连接， 探针连接，检测荧光
切除荧光基团
第二轮探针连接， 第二轮探针连接，检测荧光
切除荧光基团 每个探针进行检测的两个碱基后面有三个匹配碱基， 每个探针进行检测的两个碱基后面有三个匹配碱基，因此一条测序引物读取的序列是不完整的
5’
Base calling from the raw data TG C TAC GAT …
1 2 5 8 9
3
4
6
7
TTTTTTTGT…
The identity of each base of a cluster is read off from sequential images 根据每个点每轮反应读取的荧光信号序列， 根据每个点每轮反应读取的荧光信号序列，转换成相 应的DNA序列 应的 序列
Digital expression profiling & microRNA re-sequencing：
hESC： human embryonic stem cells ： EB： embryoid bodies ：
ChIP-seq（1）： 人一号染色体DNA-蛋白相互作用
ChIP-seq（2）：
第五部分：其他类型的芯片 第五部分：
微缩芯片实验室（Lab-on-a-chip) 微缩芯片实验室（Lab-on药物运输芯片 生理功能辅助芯片 纳米芯片
第六部分 高通量测序技术简介 Next Generation Sequencing
• • • • Sample fragmentation Library preparation Sequencing reaction Data analysis
高通量测序的应用
• • • • • • De novo 测序 基因深度测序（genome re-sequencing） 转录组深度测序（transcriptome re-sequencing） Digital expression profiling ChIP-seq Methy-seq
Transcriptome resequencing：
malignant pleural mesotheliomas (MPMs) ：恶性胸膜间皮瘤 pulmonary adenocarcinoma (ADCA)：肺腺癌
Transcriptome characteristics
Expression difference between MPM and ADCA ample compare to a lung tissue control
Advantage & disadvantage 454 sequencing
• • • 读取长度大，400bp 可以对未知基因组进行从头测序de novo sequencing 当遇到polymer时，如AAAAAA等，荧光强度和碱基个数不成线性关系，判定 重复碱基个数有困难
Solexa sequencing
118 162 85 73 91 48 266 217 91 10 0 46 41 0 8 0 240 51 716 132
UHR
861 163 35 0 96 0 271 1538 0 10 113 799 12 42 346 59 81 0 0 69
Symbol
RPL29 PRDX2 PFN2 STMN4 COX5B GABRA1 UBB RING1 DIRAS2 PHF20 IGJ FN1 NFIX TOP2A KRT8 ITGB7 BASP1 DRD1IP GFAP APLP2
Adapter complement
Enrich Anneal Seq primer “Break micro-reactors” Isolate DNA containing beads Perform emulsion PCR