生物光子学5-05
生物光子学在生物医学研究中的应用
生物光子学在生物医学研究中的应用生物光子学是一门综合性的学科，旨在研究生物体内的光学现象以及利用光学方法进行生物医学研究。
生物光子学已经被广泛应用于生物医学研究领域，可以通过光学成像、光谱分析以及光学治疗等手段实现对生物分子、细胞和组织的非侵入性、高分辨率的检测和操作。
下面将详细介绍生物光子学在生物医学研究中的应用。
首先，生物光子学在生物医学研究中的一个主要应用是光学成像技术，包括荧光成像、光声成像和光学相干断层扫描（OCT）等。
荧光成像技术可以通过标记荧光染料或融合荧光蛋白的方式，实现对生物体内特定分子的可视化观测。
例如，通过标记肿瘤细胞特异性的荧光物质，可以用来检测和跟踪肿瘤细胞的动态过程，包括研究肿瘤的生长、转移和治疗效果等。
光声成像技术则利用光声效应来实现对生物组织的高分辨率成像。
光声成像具有高灵敏度和高对比度的特点，可以提供生物组织的形态结构和功能信息。
OCT是一种非侵入性的全息断层扫描技术，利用光的干涉效应来实现对组织的高分辨率断层成像。
OCT在眼科疾病的诊断和治疗中有广泛应用，特别是在角膜和视网膜疾病的早期诊断方面。
其次，生物光子学在生物医学研究中的另一个重要应用是光学谱学分析。
光学谱学分析可以通过检测生物体内的光学信号，获得与生物分子结构和功能相关的信息。
例如，近红外光谱分析（NIRS）可以通过测量由近红外光与组织交互作用产生的光学信号，实现对脑血氧含量和脑功能活动的监测和研究。
此外，拉曼光谱分析可以通过测量样品散射光的能量和频率变化，实现对生物分子的定性和定量分析。
拉曼光谱分析具有无损伤、非侵入性的特点，可以用于生物组织和体液的检测和诊断，例如检测癌症早期生物标志物、体外精子质量评估等。
最后，生物光子学在生物医学研究中还被广泛应用于光学治疗领域。
光动力疗法是一种利用光敏剂和特定波长的光照射来杀灭肿瘤细胞的方法。
光动力疗法可以选择性地破坏肿瘤组织，并且对周围健康组织的损伤较小。
此外，生物光子学还用于光学递送药物和基因治疗等新型治疗方法的研发。
生物光子学技术
生物光子学技术生物光子学技术是将光子学技术应用于生物医学领域的一种新兴领域。
它将生物学、光学和电子科学结合起来，应用于生命科学领域、医学诊断和治疗领域，开发出一系列新的技术手段，为生物医学领域提供了更加全面、高效和精确的工具。
生物光子学技术的应用生物光子学技术的应用非常广泛，包括了生物医学、生物学、环境科学等领域。
其中，生物医学领域是生物光子学技术最主要的应用领域之一。
在生物医学领域中，生物光子学技术主要应用在生物成像、生物诊断和治疗等方面。
例如，医学成像技术中使用的CT（计算机断层扫描仪）和MRI（磁共振成像）技术中就包含了大量的光子学技术，这些技术可以帮助医生更加准确、直观地观察人体内部的结构和器官。
生物光子学技术的优势与传统手段相比，生物光子学技术具有以下优势：1.高分辨率：生物光子学技术可以实现微米级别以上的高分辨率成像，使得观察细胞、分子等微观结构更加精准。
2.非侵入性：生物光子学技术不需要侵入到人体或者细胞内部，因此可以使得医生更加轻松舒适地进行医学检测和治疗，同时也可以大大减少患者的痛苦。
3.快速：生物光子学技术可以快速获取大量信息，可在短时间内对大量样本进行分析，提高效率和精度。
生物光子学技术的发展趋势在未来的发展中，生物光子学技术将会得到更加广泛的应用。
随着技术的不断发展和进步，生物光子学技术将会日益成熟，能够更加准确地检测、诊断、治疗和预防疾病。
这可能产生重大的影响，包括增强处理信息和提高医学人员的监管能力等。
总之，生物光子学技术是一种运用光子学技术来改善生物医学领域的技术手段。
它在生物医学领域中发挥着越来越重要的作用，未来也将继续得到广泛的应用和研究，成为生物医学领域中不可替代的技术手段。
生物光子学的研究和应用
生物光子学的研究和应用生物光子学是一门奇妙的交叉学科，它将生物学与光学结合在一起，研究和探索微观世界和生命科学的新领域。
随着科技的不断进步，生物光子学应用领域越来越广泛，下面我们来看一下生物光子学的研究和应用。
一、生物光子学的研究1. 光学成像技术：光学成像技术是生物光子学领域的重要研究方向之一。
现代生物学研究需要观察细胞、组织、器官的形态和结构，而传统的显微镜成像技术受到了分辨率的限制，不能很好地解决生物学研究中的问题。
因此，研究人员不断地探索新的成像技术，如：荧光成像、干涉成像和相位成像等技术，以及将成像技术和计算机技术结合使用，以提高成像质量和分辨率，以便更好地观察生物体内的微观世界。
2. 生物光子学的激光应用：激光技术是当代科技中应用最广泛的技术之一，生物光子学近年来也开始引入激光技术。
激光可以通过单光子发射激起荧光，对活体组织建立图像，对分子运动进行跟踪研究等等。
同时，随着激光器输出功率的不断提高，激光在目前的生物医药领域中也得到了广泛应用，如：激光治疗、生物标记和光动力学等方面的研究。
3. 生物光子学的光谱学研究：光谱学是生物光子学领域中一项非常重要的研究方向。
它利用光的不同频率来研究生物体内分子的结构与功能，使用荧光光谱学、拉曼光谱学以及表面等离子共振光谱学等光谱学技术，探索生物基质的分子结构、信息转导以及分子交互作用等方面的研究。
4. 生物光子学的超分辨率成像研究：生物聚变显微镜、单分子成像技术以及结构光学等技术已经被广泛应用于生物光子学领域的成像研究，然而仍有一些限制，其中一个重要的限制就是分辨率。
因此，超分辨率成像技术的研究就成为生物光子学研究领域中另一个重要方向。
超分辨率成像技术通过光学探针，利用原子力显微镜、光学共焦成像等技术实现了非常高的分辨率。
二、生物光子学的应用1. 生物医学应用：光学成像技术在生物医学领域成为了一个非常热门的研究领域。
其中包括手术成像、疾病监测与诊断、生物材料评估以及生物模拟器件的监测等等领域。
生物医学工程概论 第三章 生物医学光子学
流式细胞仪
心脏动作电位实时测量
小动物荧光成像
光学相干层析成像
(Optical Coherence tomography, OCT)
速度快 分辨率高
血红蛋光吸收曲线
660nm
940nm
指套式血氧测量仪
红外脑成像示意图
光遗传技术
神经科学的主要挑战是如何调控一种细胞而 不影响其它细胞（Francis Crick,1979)
叶绿体的自发荧光
二次荧光（荧光探针）
非荧光性的物质（蛋白 质、炭水化合物）用荧光色 素染色，由荧光色素产生荧 光（二次荧光），以便进行 观察。对特定物体选择合适 的荧光色素，该物体就能和 周围的组织或细胞区别出来 而可以观察到。
抗体荧光技术（用免疫染色）
利用特定抗原必然和特定抗体相结合的 事实，使带荧光标记的抗体和标本中的抗原 进行抗原、抗体反应，这样两者的结合体就 能通过抗体的荧光观察。
Channelrhodophin-2等是光敏感的非特异阳离子通道
基因重组构建模式动物
将光敏感的离子通道 转录到老鼠的多巴胺 能神经元，完成任务 是刺激即可产生愉悦 感，一次刺激老鼠主 动完成任务
四、生物发光
化学发光 物理激发光 热辐射 生物超微弱发光
化学发光
化学发光是物质在进行化学反应过程中伴 随的一种光辐射现象（不需要光、热或电 场等激发）； 直接发光：A、B两种物质发生化学反应生 成C物质，反应释放的能量被C物质的分子 吸收并跃迁至激发态C*； 间接发光：A和B反应生成激发态中间体C* ，C*分解时释放出能量使F变到激发态F*， 当F*跃迁回基态时，产生发光。
共聚焦扫描显微镜光学原理
生物光子学的理论与实践
生物光子学的理论与实践生物光子学是应用光学技术研究生命科学问题的交叉学科。
光子学在这里的应用主要涉及到光学成像、光谱学、光操控与检测等方面，在基础研究和应用领域发展迅速，为生命科学领域带来了重大影响。
一、生物光子学的理论基础生物光子学的基础理论有光学、生物学和光子学三个方面，其中光学是最主要的一个方面，主要应用的知识有光学成像、光谱学、光谱分析等。
与此同时，光子学涉及到光的物理学、量子力学和电磁学等基础领域。
生物光子学的光谱学应用比较广泛，主要包括荧光光谱、吸收光谱、拉曼光谱等。
其中，荧光光谱分析是生物光子学中最常用的技术之一，可以用于探测分子的分布、构象和电荷状态等。
另外，生物光子学的光学成像技术也是其重要的理论基础之一。
光学成像主要是通过对样品表面反射、折射和散射的光进行收集与分析，以获得样品拓扑结构、表面纹理、化学成分等信息。
二、生物光子学的应用实践1.生物分子成像生物分子成像是生物光子学的重要应用领域之一，主要用于研究生物分子的含量和分布、蛋白质交互作用、酶动力学、代谢过程等。
常用的方法包括荧光显微镜技术、拉曼光谱成像技术等。
荧光显微镜技术可以在分子尺度下实现成像，实现了对生物分子的可视化，通过针对特定荧光探针或荧光蛋白的标记，生物分子的空间位置和分布可以在细胞和组织水平上被探测和研究。
拉曼成像技术非常适合在低信噪比条件下对样品进行成像，检测到的信号与样品本身的化学成分和结构相关。
2.三维成像生物光子学的三维成像技术是对生物组织体积结构和生命过程的研究提供了新的手段。
其主要应用领域包括生物医学、药物研发等。
通过三维成像技术，可以精确确定生物样品的三维结构，实现对生物组织的生命过程和机制进行全面分析，为药物研发和生物医学研究提供了更加完整的数据。
基于光学成像的三维成像技术涉及到构建三维体积图像和分析三维心电图像两大方面。
其中体积图像的构建主要有多光谱成像、光切片显微镜、光学相干断层扫描等技术，而分析三维心电图像则需要深入研究生物电生理学领域。
生物光子学研究
生物光子学研究生物光子学是一门综合性学科，它研究的是生物系统中的光的相互作用及其产生的效应。
通过对光与生物体之间相互作用的研究，生物光子学在医学、生物学和化学等领域中具有广泛的应用前景。
一、光的生物效应光在生物体内的作用机制一直是研究的热点之一。
生物光子学研究发现，光能调节生物体的生长发育、光合作用以及光信号传导等诸多生理过程，这为揭示生物体的生物功能以及环境对生物体的影响提供了新的途径。
例如，光的荧光技术可以用于细胞成像和药物的释放控制等方面的研究。
二、纳米材料在生物光子学中的应用纳米材料是生物光子学研究的重要工具之一。
金纳米颗粒、量子点等纳米材料在生物体内具有较大的比表面积和光学性能，可以被用于生物成像、生物传感以及药物释放等方面。
此外，研究人员通过改变纳米材料的形状和组成，可以调控其光学性质，进而实现对生物体的定向治疗和诊断。
三、生物光子学在医学领域中的应用生物光子学的应用在医学领域中具有重大的潜力。
光学成像技术可以用于癌细胞的早期诊断和监测治疗效果等方面。
激光治疗技术可以用于光动力疗法，通过光敏剂与光源的结合，实现对肿瘤细胞的有选择性破坏。
此外，光学传感器在药物控释、细胞检测和基因治疗等方面也有广泛的应用。
四、生物光子学在生物学和化学领域中的应用生物光子学对于生物学和化学领域的研究也有着重要的推动作用。
例如，通过光学方法可以实现对生物体内分子和细胞的瞬态过程的观测和控制。
光电转换技术可以应用于光合作用的研究，从而更深入地理解光合机制。
此外，生物光子学与化学传感器的结合，可以用于检测环境中的重金属离子、有机物质等分子的浓度。
五、生物光子学的前景和挑战生物光子学作为一个新兴的学科，具有广阔的发展前景。
然而，目前生物光子学仍然面临一些挑战，如光源的稳定性、生物组织的光学散射和吸收等。
因此，需要进一步深入研究光与生物体的相互作用，探索更多有效的方法和技术，促进生物光子学的发展。
光子学作为一门交叉学科，与生物学、医学、化学等学科紧密结合，为研究生命科学提供了新的方法和工具。
生物光子学光子学与光谱学基础课件PPT
掺铒钇铝石榴石激光器（Er:YAG）
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2.5 分子能级结构与光谱
另外一些描述吸收衰减的参量：
• 振动能级光谱
– 拉曼光谱的缺点： • 拉曼散射的效率很低：一般来说，在105个光子中，只有一个 光子可以产生散射。（因此使用激光作为光源） • 拉曼光谱比IR光谱的灵敏度低，因而在固态、液态或者不含 水的有机分子研究中，经常使用IR光谱来获得关于结构的详 细信息； • 如果被测样品中具有自体荧光，则荧光信号强度要比Raman 散射信号大许多数量级，因而背景荧光会淹没Raman谱带。
• 振动能级光谱
– 拉曼散射：入射和散射光子的能量差为分子振动 能级差； • Stokes拉曼散射：散射光子的频率低于入射 光子（v>v） ，分子从低振动能级跃迁到高振 动能级； • 反Stokes拉曼散射：散射光子的频率高于入 射光子（v<v），分子从较高振动能级跃迁到 较低振动能级；
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2.5 分子能级结构与光谱
吸收率：
透射率： 光学密度：
T和OD考虑了光通过介质时由于吸收和散射而造成的总的强度 损失；如果吸收占主导地位，则OD=A。
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2.5 分子能级结构与光谱
• 电子能级吸收光谱
– 典型的吸收光谱表示为T相对于v或的曲线，或A相对
于v的曲线; – v定义为吸收谱带最大吸收值一半处的宽带。
吸收光谱的两种表示
• 荧光激发光谱（吸收光谱）
– 激发光谱给出关于激发分子到一个产生最大荧光的能 态的信息；
生物光子学与其应用领域
生物光子学与其应用领域生物光子学以光子与生命体系相互作用为基础，研究光对生命体系的影响及其在医学、生物、化学等相关领域的应用，是交叉学科的一种新兴科学。
生物光子学的产生，不仅开拓了新的研究方向，而且在众多领域拥有广泛的应用，如医学诊断、生物分子分析、新型药物研究等。
本文将结合实例，详细阐述生物光子学的概念、原理以及应用领域。
一、概念及原理1.生物光子学的定义生物光子学是指将光与生物物质相互作用的过程及其原理、方法、技术应用研究的学科，是生物、医学、光学、物理等多学科交叉的新兴学科。
生物光子学研究的内容，包括光的生物效应、光谱分析、激光检测、光学成像、光声成像、生物光学计量学等方面。
2.生物光子学的原理生物体内的许多化学反应能够吸收、散射和发射光，从而形成了不同的光学特性，这些特性可以用来测定其组成和结构的变化。
生物光子学研究的主要基础是生物体中的荧光、散射、吸收等光学效应。
例如，荧光可以用来研究分子结构、代谢等方面的问题，吸收可以用来研究药物分析等问题，散射则是研究细胞、组织甚至生物体的形态、大小、密度等问题的重要手段。
3.生物光子学的主要技术近年来，生物光子学的研究方法和技术愈加多样化和高精准。
常见的生物光子学技术包括：激光荧光探针技术、激光共聚焦显微技术、拉曼光谱技术、红外显微成像技术以及光声成像技术等。
这些技术不仅在生化分析、细胞成像、生物组织诊断等领域有广泛应用，而且在药物研究、生物传感、肿瘤治疗等方面也显示出巨大潜力。
二、生物光子学的应用1.生物光子学在医学诊断中的应用生物光子学技术在医学诊断方面的应用具有十分广泛的前景。
例如，激光诱导荧光技术和跃迁态吸收技术可用于肿瘤诊断，能够提高肿瘤活动细胞、分子的检测灵敏度。
此外，光声成像技术、近红外光谱技术以及超声光子学诊断技术等，也已被广泛应用于医学诊断的多个领域。
在这些医学诊断中，生物光子学技术的独特优势在于，它能够对活体组织进行高分辨率成像，而不对生物体造成损伤。
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5.10 非线性光学成像技术
三次谐波产生
E ( ) E ( ) E ( )
m e d i u m
( 3 )
E ( 3 )
THG 是三阶非线性过程，与光强立方成正比，频率为 v 的 输入光束会产生频率为 3v的新的光束，同样也是非共振的 过程（在此过程中介质既不吸收能量，也不发射能量）； 三阶效应对物质没有对称要求的限制。
C. L. Evans, et al，“Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti25 Stokes Raman scattering microscopy”，PNAS， 2005, Vol. 102
5.10 非线性光学成像技术
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5.10 非线性光学成像技术
• THG的优点：
– THG是物质固有的物理效应，是一种光和物质相互作用的多光子过 程（但与三光子吸收不同，不包含介质对光的吸收）；
– THG没有对称性要求，可以在表面及大块组织内产生；
– 空间分辨率高，无需标记、没有光漂白，不会导致细胞的生理变化 及细胞死亡；
– 信号蓝移，容易与激发光分离，信噪比高，容易与自体荧光分离； – 具有单层敏感性（可用于对单分子薄膜的构象性研究）。
SHG只发生在非对称介质中；
SHG信号是泵浦波长的一半，并很容易从泵浦光和荧 光中区分开；
SHG显微可用于非荧光样品和组织。
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5.10 非线性光学成像技术
SHG vs.双光子荧光
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5.10 非线性光学成像技术
二次谐波与双光子荧光不同： 1）二次谐波产生不需要光吸收、不存在热损伤和光漂 白（如果激发光位于组织吸收带以外）； 2）只有非对称性组织才能产生二次谐波； 3）二次谐波波长是准确的激发波长的1/2，而双光子荧 光是宽的荧光谱； 4）二次谐波不需要荧光标记物标记。
J.-X. Cheng, Y. K. Jia, et al. Laser-Scanning Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy and Applications to Cell Biology. Biophysical Journal, 2002, Vol. 83, 50224 509
利用CARS显微成像研 究鱼油对脂代谢的影响
X. Sunney Xie, Ji Yu, Wei Yuan Yang. Living Cells as Test Tubes. SCIENCE, 2006，Vol. 312
(A) Raman spectra of EPA and deuterated OA. (B to F) Live liver cells were treated with 0.4 mM EPA and 0.2 mM deuterated OA for 7.5 hours and labeled with monodansylcadaverine, a dye for staining degradative organelles. (B) CARS image tuned to –CD2 (blue, deuterated OA). (C) CARS image tuned to –CH2 (red, EPA). (D) Composite image of wellmixed –CO2 and –CH2 (purple) and two-photon fluorescence from monodansylcadaverine (green). [(E) and (F)] Zoomed-in 26 by regions in the cell where triglycerides rich in –CH2 and –CD2 are colocalized within degradative compartments (stained monodansylcadaverine and indicated by arrows).
1999 1999
1982 1982
1974 1974
1965
Maker和Terhune首次发现了相干 反斯托克斯拉曼散射（CARS）；
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5.10 非线性光学成像技术
CARS显微成像技术 的典型光路配置
（a）前向探测CARS（FCARS）光路； （b）前向探测偏振CARS （P-CARS）光路； （c）背向探测CARS（ECARS）光路； （d）相对传输激发CARS （C-CARS）光路。
(F) 2D projection of 60 depth-resolved slices separated by 2μm. Panels to the right and under F show the yz and xz cross sections taken at the white lines, respectively.
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5.10 非线性光学成像技术
1、谐波成像
二次谐波是二阶非线性光学过程，利用波长为λ（频率 为v）激光激发非中心对称生物组织，产生波长为λ/2（ 频率为2v）的二次谐波。
5
5.10 非线性光学成像技术
• SHG的特点：
光源的光谱（近红外到红外）在样品的吸收谱（蓝紫 光）之外，样品没有热损伤或光致漂白；
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5.10 非线性光学成像技术
人体皮肤胶原束的非线性三维成像（SHG、AUTOfl），激发波长880 nm, 垂 直和水平偏振，带通滤光片：440/20 (SHG)和515/30 (autofluorescence)，标 13 尺：Bar = 20 µ m.
5.10 非线性光学成像技术
荧光多参量和二次谐波复合成像
... ... ...
荧光团的光致漂白损伤 毒性
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5.10 非线性光学成像技术
1930年诺贝尔物理奖
拉曼散射
优点 基于分子固有的 振动或转动；能 够反映分子所有 振动信息；对样 品无需标记
缺点
信号弱，平均入射 105个光子才能产生1 个拉曼光子；采集信 号时间长；激发光功 率高。
C. V. Raman
主讲人：刘立新
lxliu@ 西安电子科技大学
第5章
生物光子学成像技术
2
本章内容
5.1 光学成像 5.2 光学显微技术 5.3 荧光显微技术 5.4 激光扫描共聚焦显微技术 5.5 多光子激发荧光显微技术 5.6 全内反射荧光显微技术 5.7 荧光共振能量转移成像技术 5.8 荧光寿命成像显微技术 5.9 光学相干层析成像技术 5.10 非线性光学成像技术 5.11 生物光子学成像技术的发展趋势
5.10 非线性光学成像技术
• 利用CARS成像对活细胞内细胞器运动进行动态监测
前70秒不动或小范围内动，接下来40秒与马达蛋白相连，移动8m，Scale 27 bar:2m
5.10 非线性光学成像技术
τ
窄带通 滤光片
光隔离器 钛宝石飞 秒激光器
( 3 )
相干反斯托克斯（ CARS ）是一种光学非线性频率转换的 过程。当两束输入光的频率差 v1-v2 和分子的拉曼动态振动 频率一致时，两个频率分别为 v1 和 v2 的输入光会产生频率 为2v1-v2的输出光。 20
5.10 非线性光学成像技术
相干反斯托克斯拉曼散射是一种类似于激光的相干辐射过程，是由于 介质分子振动状态的锁定而产生的。所谓振动状态的锁定是指频率为v1 和v2的两束相干光共同作用于介质，而使介质分子振动状态的位相之间 有确定的关系，辐射的激光束有确定的方向，而且必须满足相位匹配 条件才能产生的。 利用CARS光谱进行显微成像即是CARS显微成像。
CARS信号的特点:
无需标记，非侵入式探测； 波长蓝移，频率较高，能够在较强的荧光背景条件下检测到； 信号强度大、方向性好，具有高的灵敏度； 高空间分辨率和三维层析能力，横向分辨率高于0.5μm，纵向分 辨率高于0.75μm。
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5.10 非线性光学成像技术
近年来，研究人员对CARS光谱分析和显微成像技术在理论 和实验方面进行了系统的研究工作，特别是美国哈佛大学谢 晓亮，美国普渡大学程继新课题组，打开了单键CARS显微 成像技术进入生物、医学研究领域的大门。 Zumbusch等首次实现了对活细胞进行 了高质量的CARS层析成像； M. D. Duncan 等首次实现了CARS显微 成像； Begley、Harvey和Byer首先提出了 CARS光谱研究技术的设想；
15
5.10 非线性光学成像技术
2、CARS显微成像 • 背景
• 发展现状 • 应用
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5.10 非线性光学成像技术
高时间和空 间分辨率 高 灵 敏 度
现代生命 科学研究 手段
荧光染料标记技术
高化 学特 异性
实时三维 显微成像
...
荧光技术的缺陷
自体荧光信号弱
外源标记的影响
非侵入光谱和显微成像技术 拉曼散射
5.10 非线性光学成像技术
无毛小鼠耳朵图像，平均速度2秒/幅。 表征脂CH2对称拉伸振动的拉曼位 移在 2,845 cm-1 。 (A) Stratum corneum with bright signals from the lamellar lipid intercellular space that surrounds the polygonal corneocytes. Bright punctuated dots are ducts of sebaceous glands. (B) Sebaceous glands at ≈30μm from skin surface. (C) Individual cells of the gland compartment can be recognized, with nuclei visible as dark holes (arrow). (D) Adipocytes of the dermis at ≈ 60μm from skin surface. (E) Adipocytes of the subcutaneous layer at a depth of ≈ 100μm.