CD59与CD3在T细胞活化信号转导中的协同作用

第４８卷　第４期２０１２年８月青岛大学医学院学报ＡＣＴＡ　ＡＣＡＤＥＭＩＡＥ　ＭＥＤＩＣＩＮＡＥ　ＱＩＮＧＤＡＯ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＴＩＳＶｏｌ．４８，Ｎｏ．４Ａｕｇｕｓｔ　２０１２［收稿日期］２０１１－１１－２７；　［修订日期］２０１２－０２－２８［基金项目］国家自然科学基金资助项目（３０９７２６７７）［作者简介］王娟（１９８５－），女，硕士研究生。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｕｎｎｙｗａｎｇｊ－ｕａｎ＠１６３．ｃｏｍ。

［通讯作者］高美华（１９５３－），女，教授，博士生导师。

Ｅ－ｍａｉｌ：Ｍｅｉ－ｈｕａｇａｏ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ。

ＣＤ５９与ＣＤ３在Ｔ细胞活化信号转导中的协同作用王娟，高美华，张蓓（青岛大学医学院免疫学教研室，山东青岛　２６６０７１）［摘要］　目的　前期构建的真核表达载体ｐＳＵＰＥＲ－ＣＤ３ζＲＮＡｉ和ｐＳＵＰＥＲ－ＣＤ５９ＲＮＡｉ在Ｊｕｒｋａｔ细胞中稳定表达，研究ＣＤ５９与ＣＤ３分子在Ｔ细胞活化信号转导中的相互作用，进一步探讨ＣＤ５９向Ｔ细胞内传递信号的相关机制。

方法　酶切鉴定构建的ｐＳＵＰＥＲ－ＣＤ３ζＲＮＡｉ和ｐＳＵＰＥＲ－ＣＤ５９ＲＮＡｉ；脂质体法将两种载体分别转染Ｊｕｒ－ｋａｔ细胞，经Ｇ４１８筛选建立稳定转染细胞系；ＲＴ－ＰＣＲ技术检测转染后ＣＤ５９和ＣＤ３ζ在ｍＲＮＡ水平的表达抑制效果；采用噻唑蓝比色法检测转染前后各组Ｊｕｒｋａｔ细胞的增殖效应，Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ技术检测各组细胞ＺＡＰ－７０酪氨酸磷酸化的水平，激光共聚焦扫描显微镜检测各组细胞内Ｃａ２＋变化，ＥＬＩＳＡ法检测细胞上清液中白细胞介素２（ＩＬ－２）的变化。

结果　重组载体转染后ＲＴ－ＰＣＲ结果表明，转染ｐＳＵＰＥＲ－ＣＤ３ζＲＮＡｉ和ｐＳＵＰＥＲ－ＣＤ５９ＲＮＡｉ质粒的细胞组ＣＤ３ζ分子和ＣＤ５９分子的表达分别受到抑制。

转染干扰质粒的细胞组细胞增殖能力、ＺＡＰ－７０酪氨酸磷酸化水平、Ｃａ２＋浓度及ＩＬ－２水平均明显低于未转染组和空质粒组，差异有显著性（Ｆ＝９６．１３～３２８．６０，ｑ＝６．２７～３２．６６４，Ｐ＜０．０１）。

结论　ＣＤ５９和ＣＤ３在Ｔ细胞活化信号转导中具有协同作用。

［关键词］　抗原，ＣＤ５９；抗原，ＣＤ３；真核表达载体；Ｊｕｒｋａｔ细胞；信号转导［中图分类号］　Ｒ３９２．１２ ［文献标志码］　Ａ ［文章编号］　１６７２－４４８８（２０１２）０４－０２８７－０４ＴＨＥ　ＳＹＮＥＲＧＩＳＴＩＣ　ＥＦＦＥＣＴ　ＯＦ　ＣＤ５９ＡＮＤ　ＣＤ３ＩＮ　Ｔ　ＣＥＬＬ　ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ　ＳＩＧＮＡＬＳ　ＴＲＡＮＳＤＵＣＴＩＯＮ　ＷＡＮＧ　Ｊｕａｎ，ＧＡＯＭｅｉｈｕａ，ＺＨＡＮＧ　Ｂｅｉ　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｑｉｎｇｄａｏ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｑｉｎｇｄａｏ　２６６０７１，Ｃｈｉｎａ）［ＡＢＳＴＲＡＣＴ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＣＤ５９ａｎｄ　ＣＤ３ｉｎ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｆｕｒ－ｔｈｅｒ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇ　ＣＤ５９ｔｒａｎｓｍｉｔｔｉｎｇ　ｓｉｇｎａｌｓ　ｔｏ　Ｔ　ｃｅｌｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｃｏｎｔａｉ－ｎｉｎｇ　ＣＤ３ζＲＮＡｉ　ａｎｄ　ＣＤ５９ＲＮＡｉ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｊｕｒｋａｔ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｌｉｐｏｓｏｍｅ，ｗｈｉｌｅ　ｓｔｅａｄｙ　ｃｅｌｌｓｃｌｏｎｅｄ　ｃｏｕｌｄ　ｇｅｔ　ｔｈｒｏｕｇｈ　Ｇ４１８ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．ＣＤ５９ａｎｄ　ＣＤ３ζｍＲＮＡ　ｌｅｖｅｌ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＲＴ－ＰＣＲ．Ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ＭＴＴ　ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ　ａｆｔｅｒ　ａｎｔｉ－ＣＤ３ｍＡｂ　ａｎｄ　ａｎｔｉ－ＣＤ５９ｍＡｂ．Ｔｈｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＺＡＰ－７０ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｙｒｏ－ｓｉｎｅ　ｗｅｒｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ，ｔｈｅ　ｋｉｎｅｔｉｃ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ［Ｃａ２＋］ｉｎ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｌａｓｅｒ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｃｏｎｆｏｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ｉｍａｇｉｎｇ，ｗｈｉｌｅ　ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　２（ＩＬ－２）ｉｎ　ｃｅｌｌ　ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ　ｆｌｕｉｄ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＥＬＩＳＡ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＣＤ５９ａｎｄ　ＣＤ３ζｅｘ－ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｉＲＮＡ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｇｒｏｕｐ　ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆＺＡＰ－７０，ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ［Ｃａ２＋］ａｎｄ　ＩＬ－２ｉｎ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｓｉＲＮＡ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｇｒｏｕｐ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ａｎｄＪｕｒｋａｔ　ｃｅｌｌｓ　ａｆｔｅｒ　ａｎｔｉ－ＣＤ３ｍＡｂ　ａｎｄ　ａｎｔｉ－ＣＤ５９ｍＡｂ，ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（Ｆ＝９６．１３－３２８．６０，ｑ＝６．２７－３２．６６４，Ｐ＜０．０１）．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅｒｅ　ｉｓ　ａ　ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＣＤ５９ａｎｄ　ＣＤ３ｉｎ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．［ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ］　ａｎｔｉｇｅｎ　ＣＤ５９；ａｎｔｉｇｅｎ　ＣＤ３；ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ；Ｊｕｒｋａｔ　ｃｅｌｌ；ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ＣＤ５９分子是一种广泛分布于多种组织细胞表面的ＧＰＩ锚固蛋白，除了已被广泛认知的通过抑制ＭＡＣ的形成而发挥补体调节能力［１－２］外，ＣＤ５９还具有细胞信号转导的功能［３］。

ＣＤ５９分子本身不含胞内段，但与其单克隆抗体结合并发生交联后，可将信号传入胞内介导一系列细胞活化事件，如脂筏相关的信号分子酪氨酸激酶的活化及钙离子的释放等［２］。

有关研究结果显示，在Ｔ细胞的ＣＤ５９被激活后可导致ＴＣＲζ／ＺＡＰ－７０亚单位的磷酸化［４］。

在Ｔ细胞活化信号转导过程中，ＴＣＲ－ＣＤ３复合物识别并呈递抗原，提供Ｔ细胞活化途径的第一信号，其中ＣＤ３ζ链在Ｔ细胞活化信号转导过程中发挥重要作用，即ＣＤ３ζ可活化相关激酶，将识别信号转入Ｔ细胞内，前期的研究已构建了ＣＤ３ζＲＮＡｉ逆转录病毒载体，并沉默细胞ＣＤ３ζ的表达［５］。

本实验通过测定相关信号转导分子的变化，揭示ＣＤ５９是否可通过ＣＤ３ζ向细胞内传递活化信号，为进一步探讨ＣＤ５９在Ｔ细胞内传递活化信号的机制奠定基础。

１　材料和方法１．１　材料Ｊｕｒｋａｔ细胞株及大肠杆菌（ＪＭ１０９）由本教研室２８８青　岛　大　学　医　学　院　学　报４８卷保存；限制性核酸内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司；转染试剂Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００和Ｔｒｉｚｏｌ均购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；Ａｃｃｅｓｓ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ａ１２５０试剂盒购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；四甲基偶氮唑蓝（ＭＴＴ）购自中国医学科学院血液科研究所；鼠抗人ＣＤ５９单克隆抗体（ｍＡｂ）购自Ｓａｎｔａ公司；兔抗人ＺＡＰ－７０磷酸化ｍＡｂ购自上海生工生物工程有限公司；Ｗｅｓｔｅｒｎ及ＩＰ裂解液和钙离子荧光探针（Ｆｌｕｏ－３／ＡＭ）购自北京碧云天生物试剂公司；辣根过氧化酶（ＨＲＰ）标记山羊抗兔ＩｇＧ和兔抗β－肌动蛋白（ａｃｔｉｎ）购自北京博奥森生物公司；Ｎｉｋｏｎ　Ｃ１Ｐｌｕｓ共聚焦激光扫描显微镜为Ｎｉｋｏｎ公司产品；ＩＬ－２（ＥＬＩＳＡ）检测试剂购自美国ＲＤ公司。

１．２　方法１．２．１　质粒的扩增及酶切鉴定　将质粒ｐＳＵＰＥＲ－ｓｉＣＤ５９和ｐＳＵＰＥＲ－ｓｉＣＤ３ζ及空质粒ｐＳＵＰＥＲ转化ＪＭ１０９细菌，选择ＡＬＢ平板上的转化菌落，加入到５ｍＬ　ＡＬＢ液体培养基中，于３７℃过夜摇菌，碱裂解法小提质粒。

采用内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ对重组载体行双酶切，酶切产物在１５ｇ／Ｌ的琼脂糖凝胶上电泳。

１．２．２　Ｊｕｒｋａｔ细胞系的培养和传代　Ｊｕｒｋａｔ细胞接种于含体积分数０．１胎牛血清的ＲＰＭＩ　１６４０培养液（内含１０５Ｕ／Ｌ青霉素、１０５Ｕ／Ｌ链霉素），于３７℃、体积分数０．０５ＣＯ２培养箱中培养，２～３ｄ传代１次，调整细胞密度５×１０８／Ｌ，据其生长状态适时换液或传代。

１．２．３　重组质粒的转染与筛选　按Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎｅ２０００说明书操作，将ｐＳＵＰＥＲ－ｓｉＣＤ５９和ｐＳＵＰＥＲ－ｓｉＣＤ３ζ分别转染细胞，实验分未转染组（Ａ组）、转染空质粒组（Ｂ组）、转染ｐＳＵＰＥＲ－ｓｉＣＤ５９组（Ｃ组）和转染ｐＳＵＰＥＲ－ｓｉＣＤ３ζ组（Ｄ组），采用Ｇ４１８筛选稳定转染细胞系并扩大培养。

１．２．４　ＲＴ－ＰＣＲ技术检测ＣＤ５９和ＣＤ３ζｍＲＮＡ水平的表达　提取各组细胞的总ＲＮＡ，进行ＲＴ－ＰＣＲ合成ｃＤＮＡ。

利用Ｐｒｉｍｅｒ　５．０软件设计扩增ＣＤ３ζ基因上游引物序列为：５′－ＴＣＣＴＡＡＣＡＣＣＡＡ－ＣＴＣＡＴＧ－３′，下游引物序列为：５′－ＧＡＧＧＣＡＧＴＣＡ－ＣＣＧＡＡＧＡＡ－３′，扩增片段的长度为２８２ｂｐ。

ＣＤ５９基因上游引物序列为：５′－ＡＣＡＡＣＴＧＴＣＣＴＡＡＣＣＣ－ＡＡ－３′，下游引物序列为：５′－ＧＡＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＡ－ＡＧＡＡ－３′，扩增片段长度为２６７ｂｐ。

内参ＧＡＰＤＨ上游引物序列为：５′－ＣＧＴＧＧＡＡＧＧＡＣＴＣＡＴＧＡＣ－ＣＡ－３′，下游引物序列为：５′－ＴＣＣＡＧＧＧＧＴＣＴ－ＴＡＣＴＣＣＴＴＧ－３′，扩增片段的长度为５０９ｂｐ。

ＰＣＲ扩增条件：９５℃预变性３ｍｉｎ；９５℃３０ｓ，４７℃１ｍｉｎ，６８℃２ｍｉｎ，３５个循环；６８℃延伸８ｍｉｎ。

扩增产物在１５ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶上电泳。

１．２．５　ＭＴＴ比色法检测Ｊｕｒｋａｔ细胞的增殖活性ＣＤ３刺激孔将ＣＤ３ｍＡｂ（１０ｍｇ／Ｌ）预先包被于９６孔培养板，４℃过夜包被。