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自身免疫性感音神经性聋基因治疗的实验研究发表时间：2009-6-5 14:45:50 浏览次数：174 来源：中国创新医学网推荐蔡文君，谭长强，李玉瑾，黄和，李霜南京医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科暨耳鼻咽喉科学研究室，江苏南京 210029；南京工业大学生物化学中心，江苏南京 210009【摘要】目的：研究以重组复制缺陷型腺病毒为载体的Fas配体（Fas Ligand，即FasL）基因和白细胞介素10（即IL10）基因治疗实验性自身免疫性感音神经性聋。

方法：采用同种内耳组织抗原加弗氏佐剂免疫豚鼠，造成自身免疫性感音神经性聋的动物模型28只，按配对设计将其分为4组，通过鼓阶微量注射的方式，A组注入携带FasL基因的腺病毒（Ad FasL），B组注入携带IL10基因的腺病毒（Ad IL10），C组单纯注入腺病毒（携带绿色荧光蛋白，即Ad GFP），D组注入等量的磷酸盐缓冲液。

基因导入7 d后行听觉脑干诱发电位（ABR）测试，后取颞骨制作石蜡切片并行HE染色和光镜观察，每组各取两耳行螺旋韧带和基底膜透射电镜观察。

每组各取3只（6耳）行免疫荧光和酶免疫组织化学试验，以检测基因产物表达和腺病毒转染情况。

结果：免疫组织化学显示携带目的基因的腺病毒可以转染血管纹、螺旋韧带、Corti器、螺旋神经节、蜗轴小血管周围及其耳蜗的骨壁等部位的细胞，并产生相应的蛋白产物（IL10和FasL）。

ABRⅢ波阈值的均值对比结果显示，A组和B组明显低于C组和D组。

内耳组织的免疫炎性反应亦明显较C组减轻。

结论：重组复制缺陷型腺病毒可以携带目的基因转导入内耳，并在内耳表达基因产物，其抑制炎症反应的作用可有效地减轻自身免疫性感音神经性聋的内耳组织免疫炎性损伤和听觉功能障碍，有望成为治疗自身免疫性感音神经性聋新的方法和途径。

【关键词】基因治疗；自身免疫性感音神经性聋；豚鼠1979年McCabe依据其临床发现，即18例听力障碍患者经过免疫抑制治疗后听力有明显改善，提出了自身免疫性感音神经性聋(autoimmune sensorineural hearing loss，ASNHL)的概念。

之后的进一步研究发现，自身免疫性损害不仅可累及耳蜗，还可波及前庭，故又提出了自身免疫性内耳病（autoimmune inner ear disease，AIED）［12］概念。

目前ASNHL的病因和发病机制尚不十分清楚，临床缺乏特异性诊断方法，对于ASNHL患者的治疗亦存在着一些问题，主要是采用皮质激素或免疫抑制剂治疗，虽然疗效较快、较好，但该类药物毒副作用多，而且还存在停药后复发率较高等问题。

近年来随着分子生物学研究的深入和基因工程技术的进展，基因治疗已成为许多相关疾病治疗研究方面的热点和新希望。

基因治疗是根据特定的治疗目的基因将DNA导入到宿主细胞中并在其中表达。

1996年Lalwani等［34］报道了将基因导入动物内耳，以后关于内耳的基因治疗成为一个热点，并在载体选择、导入方法和安全性评估等方面取得了很大的进步。

基因工程技术已能构建特异性载体，可携带治疗基因导入动物耳内，在动物内耳获得高效表达［4］，产生具有高度生物活性的稳定的基因产物，并且不产生病毒相关的耳毒性反应，这为基因治疗感音神经性聋提供了生物学证据。

目前因为复制缺陷性腺病毒载体具有病毒滴度高、转染效率高（100%）、宿主细胞范围广、外源基因容量大、稳定和无插入突变危险等特点，已经成为基因转导研究中应用最多的载体之一。

Yagi等［5］将腺病毒携带的GDNF基因从圆窗膜注射入鼓阶，GDNF基因在蜗内得到表达并发挥作用。

基于上述研究状况和现有研究工作基础，本项目组拟将利用基因治疗的独特性和内耳可行局部治疗的独特解剖特点，对自身免疫性感音神经性聋模型动物进行内耳免疫抑制或调节基因的试验性治疗研究，以探讨其治疗效果和可能发生的副反应情况。

1 材料和方法1.1 实验动物健康成熟豚鼠，白色红目，体重300 g左右，耳廓反应正常，耳镜检查排除中耳疾患，所有动物均由南京青龙山养殖场提供。

1.2 内耳组织粗制抗原（crude inner ear antigens，CIEAgs）制备豚鼠CIEAgs制取方法参考文献［4］，主要步骤：将豚鼠清醒断头，取出颞骨，快速打开听泡，在解剖显微镜下分离全膜迷路，包括基底膜、螺旋韧带、膜半规管、椭圆囊和球囊（祛除耳石器），放入0.01 mol·L-1 pH 7.4 PBS中，经研磨、冻溶、超声粉碎、匀浆、离心（1 000 r·min-1，5 min）后取上清液，采用紫外分光光度计测定蛋白含量，分装后低温干燥制成CIEAgs干粉备用，保存于-80 ℃冰箱。

1.3 ASNHL动物模型制备首次免疫每只动物采用CIEAgs 400 mg·（0.4 ml）-1，加等量完全弗氏佐剂，注射于右后足垫；2周后以CIEAgs 200 mg·（0.4 ml）-1加等量不完全弗氏佐剂，注射于背部多点皮下；间隔2周后，再同样强化免疫1次。

依据听觉诱发电位Ⅲ波的阈值升高（超过免疫前全部动物均值加2倍标准差）和出现针对CIEAgs特异性抗体（ELISA法，波长490 nm时A值超过免疫前全部动物均值加2倍标准差），判断为ASNHL模型动物制备成功［6］。

1.4 实验设计ASNHL模型动物共28只，按配对设计分为4组，每组7只：A、B和C组分别向鼓阶内注入携带FasL基因的重组腺病毒(Ad FasL)、携带IL10基因的重组腺病毒(Ad IL10)和携带绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad GFP)；D组(即对照组)用同样方法仅向鼓阶内注射磷酸盐缓冲液。

1.5 重组基因载体鼓阶内注射末次免疫后2周进行。

豚鼠用1%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（30 mg·kg-1）后，在耳廓后方作一长3～4 cm弧形切口，显露听泡，用微型电钻打开听泡，暴露耳蜗底转，用针尖轻轻磨薄耳蜗鼓阶侧壁的骨壁，钻一针尖大小的孔，用微推进器将小儿头皮针的针尖（针尖斜面已打磨变小）插入鼓阶，深度不超过1 mm，先抽取少量（约10 μl）的外淋巴液，再用微量注射机将重组腺病毒或腺病毒液缓慢（1 μl·min-1）注入鼓阶，A组给予Ad FASL（病毒滴度为2.5×10 10 pfu·ml-1）20 μl，B组给予Ad IL10（病毒滴度为1.0×108 pfu·ml-1）20 μl，C组给予AD GFP（病毒滴度为1.0×109 pfu·ml-1）20 μl，D组给予等量的磷酸盐缓冲液,骨蜡封闭耳蜗底转，抗生素冲洗中耳腔3次，部分局部放置氧氟沙星明胶海绵预防感染。

骨蜡封闭听泡骨孔，逐层缝合伤口。

所有操作应严格遵守无菌原则。

1.6 特异性免疫反应测试采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定特异性抗体。

分别于免疫前和末次免疫后2周进行。

心脏采血，分离血清。

用100 μg·ml-1的CIEAgs溶液包被ELISA板，于4 ℃过夜并封闭，加入1∶10稀释的豚鼠血清37 ℃下孵育2 h，洗板4次，加入1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein A HRP，SPA HRP）37 ℃下孵育1 h，洗板4次，以邻苯二胺过氧化氢溶液为底物显色10 min后用H2SO4终止显色，在酶标仪下测定波长为490 nm的吸光度A值。

1.7 听觉脑干诱发电位（auditory brain stem response，ABR）测试分别于免疫前、末次免疫后2周和鼓阶内注射后（1周），采用听觉诱发电位测试系统，豚鼠头顶冠状缝与矢状缝交界处插入针形电极作为测试电极，参考电极置于耳廓后方靠近乳突尖，接地电极置于对测乳突，刺激声信号采用Click，重复频率为11次·min-1，叠加2 048次，记录时程10 ms，测定Ⅲ波的阈值、潜伏期和波幅。

1.8 内耳光镜观察各组听觉测试后各取3只豚鼠，麻醉后断头，立即取出颞骨，打开听泡，放置于4%多聚甲醛固定液中，12 h后换EDTA脱钙7～10 d，修剪后流水冲洗1～2 h，常规脱水、透明、浸蜡、定向包埋。

耳蜗中轴切片，片厚5 μm，漂片、捞片、粘片，常规HE染色，封片，光镜观察。

1.9 免疫组织化学试验1.9.1 内耳石蜡包埋各组于听觉测试后各取豚鼠3只，麻醉、断头，迅速取颞骨，打开听泡，放置于4%多聚甲醛固定液中，用针挑开圆窗，在蜗尖钻一小孔，快速灌注数次，固定12 h，采用EDTA脱钙7～10 d，修剪后流水冲洗1～2 h，常规脱水、透明、浸蜡、定向包埋。

1.9.2 免疫荧光化学试验将C组2只动物的颞骨蜡块行耳蜗中轴切片，片厚5 μm，漂片、捞片、粘片后常规脱蜡至水，在倒置荧光显微镜下观察和摄片。

1.9.3 酶免疫组织化学试验按上述方法获得切片，用胰酶（0.2%）修复抗原，余具体步骤：正常山羊血清封闭10 min,加PBS稀释的第一抗体（A组加入兔抗鼠FASL，B组加入兔抗鼠IL10，C、D组加入兔抗鼠FASL和兔抗鼠IL10两种抗体），4 ℃过夜，PBS洗5 min×3次，加入HRP标记的SPA作为二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗5 min×3次，DAB染色，封片剂封片，光学显微镜观察摄片。

以上试剂均购买自武汉博士德生物工程有限公司。

1.10 内耳透射电镜观察各组听觉试验后各取1只豚鼠，麻醉后断头，迅速取出颞骨，经固定后取出全内耳膜迷路（螺旋韧带、血管纹），后固定、脱水、浸透、树脂定向包埋，聚合后修整包埋块，超薄切片，染色后透射电镜观察摄片。

2 结果2.1 特异性免疫反应试验结果见表1。

结果显示：与免疫前相比，各实验组和对照组免疫后抗体水平均明显升高，差异有显著性（配对t检验，P＜0.05）。

免疫前和免疫后的各组间对比，未显示有显著性差异（配对t检验，P＞0.05）。

表1 各组血清中针对CIEAgs特异性抗体水平2.2 听觉功能以ARB的Ⅲ波反应阈作为评定听力水平的指标，结果见表2。

与免疫前相比，免疫后各组ABR平均阈值升高，差异均有显著性（t检验，P＜0.05）。

与内耳抗原免疫后相比，A组和B组内耳局部基因治疗后ABR 平均阈值降低，差异亦均有显著性（t检验，P＜0.05）；A组平均阈值降低更为明显，但与B组相比差异无显著性（t检验，P﹥0.05）。

C组和D组内耳局部给药前后对比，差异无显著性。

各组内同期左右耳对比差异均无显著性（t检验，P﹥0.05）。

A组和B组分别以其免疫后的ABR平均阈值减2倍标准差作为判断治疗后听觉功能改善标准，A组有3只（5耳）、B组有2只（3耳）经局部基因治疗后听觉功能明显提高，治疗有效率分别为35.71%（5耳/14耳）和23.08%（3耳/13耳），B组1耳并发感染不计。