芯片数据预处理方法-19页PPT

在样品中呈高表达的基因其杂交点呈红色，相反，在对照组中高表达的 基因其杂交点呈绿色，在两组中表达水平相当的显黄色， 这些信号就代表了样品中基因的转录表达情况。
数据预处理分析流程：算法 （以cDNA芯片为例）
探针水平数据获得（计算机扫描图像）
数据预处理：背景处理、数据清洗、提取表达值、标准化、汇总
获取基因表达数据：判断差异基因表达
2 预处理 2.1 背景（background）处理
背景处理即过滤芯片杂交信号中属于非特异性的背景噪音部分。一 般以图像处理软件对芯片划格后，每个杂交点周围区域各像素吸光度的 平均值作为背景，但此法存在芯片不同区域背景扣减不均匀的缺点。也 可利用芯片最低信号强度的点（代表非特异性的样本与探针结合值）或 综合整个芯片非杂交点背景所得的平均吸光值做为背景。
列向量mj=(m1j,m2j,…,mGj)表示在第j个条件下各基因的表达水平 （即一张芯片的数据）；
元素mij表示第基因i在第j个条件下（绝对）基因表达数据。m可以 是R（红色，Cy5，代表样品组）。也可以是G（绿色，Cy3,代表对照 组）。
2.2 数据清洗（data cleaning）
经过背景校正后的芯片数据中可能会产生负值，还有一些单个异常大（或小）的 峰（谷）信号（随机噪声）。对于负值和噪声信号，通常的处理方法就是将其去除， 常见数据经验型舍弃方法有：标准值或奇异值舍弃法；变异系数法；前景值＜200； 前景值-平均数/前景值-中位数＜80%等等。然而，数据的缺失对后续的统计分析（尤 其是层式聚类和主成分分析）有致命的影响。Affy公司的芯片分析系统会直接将负值 修正为一个固定值。
以下的数据处理都是对log2R/G的形式进行分析。
2.4 归一化
经过背景处理和数据清洗处理后的修正值反映了基因表达的水平。然而在芯片试验中， 各个芯片的绝对光密度值是不一样的，在比较各个试验结果之前必需将其归一化 （normalization，也称作标准化）。
2.3 提取表达值
由于芯片数据的小样本和大变量的特点，导致数据分布呈偏态、标准差大。 对数转换能使上调、下调的基因连续分布在0的周围，更加符合正态分布，同时 对数转换使荧光信号Biblioteka 度的标准差减少，利于进一步的数据分析。
cDNA芯片：对双通道数据使用Cy5（红）和Cys3（绿）两种荧光标记分别标记 case和control样本的cDNA序列。扫描仪采用两种波长对基因芯片的图像进行扫 描，根据每个点的光密度值计算相对应的绝对表达量(intensity)；然后图像分 析软件通过芯片的背景噪音以及杂交点的光密度分析，对每个点的intensity校 准，利用Cy5/Cy3的值获取case与control组不同基因的表达值ratio（（R/G ratio）；一般选择以2为底的对数转化数据，比如R/G=1，则 log2R/G=0，即认 为表达量没有发生变化，当R/G=2 或者，R/G=0.5，则log值为1 或–1，这是可 以认为表达量都发生两倍的变化。
基因芯片（gene chip），又称DNA微阵列（microarray），是 由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列，其工作的基 本原理是通过碱基互补配对检测生物信息。
4个技 术环节
分类
基因芯片制备 样品制备mRNA提取等
杂交反应
实验要求：单通道—— 一张芯片检验一种状态 ； 双通道——差异表达基 因的筛选 储存的生物信息：寡核 苷酸芯片（常为单通 道）、cDNA芯片（常为 双通道）
背景处理之后，我们可以将芯片数据放入一个矩阵中：
m11
M
=
m21
M mG1
m12 L m22 L M mG2 L
m1N
m2 N
M
mGN
其中，各字母的意义如下：
N：条件数； G：基因数目（一般情况下，G>>N）； 行向量mi=(mi1,mi2,…,miN)表示基因i在N个条件下的表达水平（这里 指绝对表达水平，亦即荧光强度值）；
聚类和分析
1 探针水平数据（probe-level data）的获得
提取生物样品的mRNA并反转录成cDNA，同时用荧光素或同位素标记。在液 相中与基因芯片上的探针杂交，经洗膜后用图像扫描仪捕获芯片上的荧光或同位 素信号，由此获得的图像就是基因芯片的原始数据（raw data），也叫探针水平 数据。
探针 荧光值
基因 表达值
计算机“读片”机理
将样品中的DNA/RNA标上荧光标记，则可 以定量检验基因的表达水平。
cDNA芯片、载有较长片段的寡核苷酸芯片采用双色荧光系统：目前常用 Cy3一dUTP（绿色）标记对照组mRNA，Cy5一dUTP（红色）标记样品组 mRNA
用不同波长的荧光扫描芯片，将扫描所得每一点荧光信号值自动输入计 算机并进行信息处理，给出每个点在不同波长下的荧光强度值及其比值，同 时计算机还给出直观的显色图。
对数据的删除，通常是删去所在的列向量或行向量。一个比较常用的做法是，事 先定义个阈值M。若行（列）向量中的缺失数据量达到阈值M，则删去该向量。若未 达到M，有两种方法处理，一是以0或者用基因表达谱中的平均值或中值代替，另一 个是分析基因表达谱的模式，从中得到相邻数据点之间的关系，据此利用相邻数据点 估算得到缺失值（类似于插值）。填补缺失值（ k临近法）：利用与待补缺基因距离 最近的k个临近基因的表达值来预测待填补基因的表达值。根据邻居基因在样本中的 加权平均估计缺失值。
信号检测与分析
基因芯片的实验流程（双通道）
单通道/双通道基因芯片实例
基因芯片数据分析：对从基因芯片高密度杂交点阵图中提取 的杂交点荧光信号进行定量分析，通过有效数据筛选和相关基因 表达谱聚类，发现基因的表达谱和功能之间的联系。
杂交完成后，要对基因芯片进行“读片”，即应用激光共聚焦荧光扫 描显微镜，对基因芯片表面的每个位点进行检测。
获取探针水平的数据是芯片数据处理的第一步，然后需要对其进行预处理（ pre-processing），以获得基因表达数据（gene expression data）。基因表达数据 是芯片数据处理的基础。
基因芯片探针水平数据处理的R软件包有affy, affyPLM, affycomp, gcrma等。