2016下生物分离工程复习题

分配系数：一定的温度和压力下，溶质在两个互不相溶的溶剂中分配，达到平衡后溶质在

两相中浓度之比为常数（K,或A，分配系数）

双水相萃取：利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。

吸附作用：把物质从流动相（气、液相）浓缩到固体表面从而达到分离的过程称为吸附作用。

电渗析：利用半透膜的选择透过性来分离不同的溶质粒子（如离子）的方法称为渗析。在电场作用下进行渗析时，溶液中的带电溶质粒子（如离子）通过膜而迁移的现象称为电渗析。膜分离法：膜分离过程是用具选择透过性的天然或合成薄膜为分离介质，在膜两侧的推动力作用下，原料液体混合物或气体混合物中的某个组分选择性地透过膜，使混合物达到分离、分级、提纯、富集和浓缩目的的过程。

离子交换树脂的交换容量：总交换容量是表征树脂活性基团数量交换能力的重要参数。表示方法有质量交换容量（mmol/g干树脂）和体积交换容量（mmol/ml湿树脂）：用单位质量干树脂或单位体积湿树脂所能吸附一价离子的毫摩尔数来表示。

超滤：（Ultrafiltration,UF）以多孔细小薄膜为过滤介质，压力为推动力，使不溶性物质得以分离的操作，孔径分布范围为0.001~ 0.02 μm，适合于分离酶、蛋白质等生物大分子物质。

盐析法：蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象称为盐析。

亲和层析：(affinity chromatograp hy , AC)是专门用于纯化生物大分子的色谱分离技术。是基于固定相的配基与生物分子间的特殊生物亲和能力的不同来进行相互分离的。

结晶：(Crytallization)是指溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新相的过程。这一过程不仅包括溶质分子凝聚成固体，还包括这些分子有规律的排列在一定晶格中。

发酵液预处理：以细胞培养液或发酵液为出发点，设法使目标产物转移到液相中，同时除去其它悬浮颗粒以及改善滤液性状以利于后续操作的过程称为发酵液的预处理。

离子交换法：树脂法）：是应用合成的离子交换树脂作为吸着剂，将溶液中的物质，依靠库仑力吸附在树脂上，然后用合适的洗脱剂，将吸附物从树脂上洗脱下来，达到分离、浓缩、提纯的目的。

表面活性剂的HLB数:（hydrophile-lipophile balance）表面活性剂上亲水和亲油基团的相对强弱称为HLB值。

生物分离工程的一般步骤及各步骤中的主要单元操作

答：1、发酵液的预处理与固液分离

目的：除去发酵液中杂蛋白质、高价无机离子，同时增大不溶性杂质颗粒，使被分离的物质转入到液相中，再用固液分离方法除去杂质颗粒和菌体细胞。

固液分离方法：过滤和离心是最基本的方法。过滤是首选。预处理方法：酸化、加热、凝聚和絮凝技术等。固液分离设备和技术：鼓式真空过滤机和错流膜过滤技术。

2.产物的提取（初步纯化）没有特定的方法，主要是除去与目标产物性质有很大差异的物质，一般会发生显著的浓缩和产品质量的增加。典型的分离方法有：吸附法、沉淀法、离子交换法、萃取法（溶剂萃取、超临界流体萃取、逆胶束萃取等）、膜过滤法（超滤、微滤等）。

3.产物的精制（高度纯化）这类过程技术对产物有高度的选择性。主要目的除去与被纯化物有类似化学功能和物理性质的不纯物。典型的方法有：色谱分离(离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等)、电泳、结晶等。

4、成品的加工处理（最后纯化）产物的最终用途决定了产品最终的加工方法，常用的方

法是浓缩、无菌过滤和去热原、结晶、干燥。

硫酸铵作为盐析操作中最主要的盐类有什么突出的特点

优点：价廉、溶解度大，且能使蛋白质稳定，盐的浓度高，可防止蛋白酶和细菌作用

缺点：水解后变酸，在高pH下会释放出氨；腐蚀性强；残留的硫酸铵在食品中虽然量少，也会影响其味，在医疗上有毒，因此必须除去。

盐析法为什么能用于分离蛋白质混合物？一般用于生物分离的哪个阶段？

（1）高浓度盐离子使蛋白质表面双电层厚度降低，静电排斥作用减弱.在布朗运动的互相碰撞下容易发生凝聚，进而沉淀析出。（2）中性盐比蛋白质具更强的亲水性，因此将与蛋白质争夺水分子，使蛋白质水化膜破坏。蛋白质溶液中加入中性盐后会压缩双电层，降低ζ电位，即中性盐既会使蛋白质脱水，又会中和蛋白质所带的电荷，使颗粒间的相互排斥力减小，在布朗运动的互相碰撞下，蛋白质分子结合成聚集物而沉淀析出。由于其浓缩作用常大于纯化作用，因而沉淀法通常作为初步分离的一种方法，用于从去除了菌体或细胞碎片的发酵液中沉淀出生物物质。

什么是盐析公式？根据盐析公式，有哪两种盐析方法，各有何特点？

cohn经验方程式

Ks分级盐析法:在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法，用于蛋白质粗提。β分级盐析法:在一定离子强度下改变pH和温度进行盐析的方法，用于蛋白质初步纯化。Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。而β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化

几种层析分离（吸附、离子交换、凝胶、亲和）方法的原理和应用。

吸附层析（吸附色谱）是利用固定相吸附物中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附层析的层析过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附物的过程。分为吸附柱层析、薄层层析、薄膜层析三类。

应用：作为纯化和鉴定各种化合物的一种重要手段。

亲和层析(affinity chromatograp hy , AC)。是基于固定相的配基与生物分子间的特殊生物亲和能力的不同来进行相互分离的。

应用：是专门用于纯化生物大分子的色谱分离技术

离子交换层析基本原理：依据不同酶所带电荷量的不同来进行分离的。将解离基团引入到惰性支持物上形成离子交换层析中的固定相。如果解离基团（带电配体）带负电，则能结合阳离子，称为阳离子交换剂；如果解离基团带正电，则能结合阴离子，称为阴离子交换剂。适应于离子和在溶剂中可发生电离的物质的分离。

应用：大多数生物大分子都是极性的。离子交换色谱广泛适用于生物大分子的分离纯化，特别是在蛋白质、多肽、核酸等生物物质的分离纯化中，占主导地位。

凝胶过滤层析法（gel filtration chromatography）凝胶层析又称凝胶过滤层析、凝胶排阻层析，分子筛层析等。它主要用于分离分子大小不同的的样品。凝胶层析设备简单，操作简便，每次层析后无需再生处理，应用：因此在生化研究中应用极其广泛。

层析操作中进行目标物的洗脱时有哪些洗脱方法

恒定洗脱：始终用同一种洗脱液，将目标产物一次性洗脱下来。如果样品纯度比较高，洗脱方便，采用这种方法较为适宜。凝胶层析多采用这种洗脱方式。

分步洗脱：该方法按照洗脱能力递增的顺序排列，用不同的洗脱液逐级洗脱。它主要对样品含杂质较多、各组分性质差异较大或需快速分离的物质适用。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。

梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，应梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH等。常用的是浓度梯度，在溶液中也就是离子强度梯度。

就双水相萃取法的优缺点及将来可能的发展方向，谈谈你的理解

优点：可以直接从细胞破碎匀浆中萃取蛋白质而不需要将细胞碎片分离，一步操作可达到固液分离和纯化两个目的。含水量高（70%-90%）；分相时间短（5-15分钟）；界面张力小，有利于物质传递；无有机溶剂残留；杂质可与固体一同除去；投资小易操作；较高的收率（K 表一般大于3）直接从cell碎片匀浆中萃取蛋白质、无需提前分离细胞碎片；

两种主要双水相体系的比较优点缺点

发展方向：①开发廉价的新型双水相体系。尝试用变性淀粉PPT代替昂贵的葡聚糖，形成PPT-PEG体系②使双水相分配与相关其他技术相结合，比如1.利用磁场、温度诱导相分离、超声波、实现高聚物的回收，缩短相分离时间，强化分离，加强转化，解决双水相分离的难点。2.利用胶状液、亲和沉淀、气相色谱等方法，强化分离效率。3.利用生物转化、电泳、化学渗透等技术与双水相萃取相结合，提供双水相萃取新的方法。

设计一套实验方案从发酵液中提取链霉素

链霉素的提取：str—链霉素在中性溶液为三价正离子，可用阳离子交换树脂提取。由于弱酸性树脂洗脱比较容易，故采用弱酸性阳离子交换树脂提取。弱酸性阳离子交换树脂在中性和碱性条件下才能发挥交换作用，而Str在碱性条件下不稳定，故str的提取应在中性条件下进行。而且采用Na型弱酸性阳离子树脂。发酵液适当稀释，使树脂利于吸附链霉素（它是str3+）不易吸附杂质离子。洗脱时用0.1~1mol/L酸梯度洗脱，可完全将str3+洗脱下来，洗脱曲线高峰比较集中。

工业上常用的细胞破碎方法

答：机械破碎法高压匀浆法（High pressure homogenization）由高压泵和匀浆阀组成。从高压室（几百个大气压）压出的细胞悬浮液经过阀座的中心孔道从阀座和阀杆之间的小环隙喷出，速度可达几百米每秒，这种高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出，细胞在高速造成的剪切力、碰撞力和高压到常压的变化等作用下，造成细胞破碎。珠磨法细胞悬浮液与极细的研磨剂（D＜1mm的无铅玻璃珠）在搅拌浆作用下充分混合，珠子之间，珠子与细胞之间互相剪切、碰撞，促使细胞壁破裂，释出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作，破碎中产生的热量由夹套中的冷却液带走。

预处理中去除几种主要的金属离子的方法

答：调节pH值和去除高价无机离子的方法

控制pH 一般采用草酸酸化，从而改变发酵液的胶体状态或使产物转入到液相中。（但草酸溶解度小，用量大时，可用其盐，如草酸钠。草酸的回收：四环类抗生素废液中，加入硫酸铅，在60℃下生成草酸铅。后者在90-95℃下用硫酸分解经过滤、冷却、结晶后可回收草酸。）

（1）、去除钙离子：一般用草酸的钠盐生成草酸钙↓，草酸钙能促进蛋白质凝固，提高滤液的质量。（2）、除去镁离子 加入三聚磷酸钠，它和镁离子形成沉淀（3）、除去铁离子：可加入黄血盐，使形成普鲁士蓝沉淀。

用于固液分离的方法有哪几种

过滤和离心是固液分离最基本的单元操作。由于发酵液的粘度高，所以分离之前要对发酵液进行预处理，主要采用凝聚和絮凝等技术来加速固、液相分离。在固液分离的方法、设备上，除可用鼓式真空过滤机外，较好的方法是采用错流膜过滤技术。

改善发酵液的过滤性能的方法有哪些？

①加入助滤剂：加适当百分率的助滤剂,一般为液体体积的0.5～1.0%(硅藻土是百年前水生植物沉淀下来的遗骸,珍珠岩是处理过的膨胀火山岩)。加助滤剂有利于改善过滤性能，利于固液分离。常用的助滤剂有硅藻土，纸浆、珍珠岩（成分SiO2）等，它们是不可压缩的多孔微粒，能使滤饼疏松，过滤速度增大。

②添加填充凝固剂：直接在发酵液中形成填充凝固剂，加入一些反应剂，它们能相互作用或和某些溶解性盐类发生沉淀，生成的沉淀可作为填充—凝固剂，沉淀本身可作为助剂，另一方面还可使胶状物和悬浮物、某些prot 凝固，从而改善过滤性能。

③ 加入降解酶：

④ 改进过滤设备等。 不同性状的发酵液应选择不同的固—液分离设备。 常用分离设备：板框压滤机，鼓式真空过滤机等

⑤过滤：根据实际选择常规过滤和错流过滤

⑥衡量过滤特性的主要指标是滤饼的质量比阻rB (或α).它表示单位滤饼厚度的阻力系数，与滤饼的结构特性有关，rB(或α)越小，则发酵液越易过滤。单位：(m/kg) 。根据滤饼的rB(或α)值，可衡量各不同发酵液过滤的难易程度。选择常规过滤法或错流过滤法。

有机溶剂沉淀蛋白质的原理

（1）降低了溶剂的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。

（2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，从而降低溶质的亲水性，导致脱水凝聚。

等电点沉淀法的原理

利用蛋白质在其等电点时溶解度下降的原理进行沉淀分离的方法。

阴、阳离子交换树脂和阴、阳离子交换层析剂的常见功能基团

离子交换层析剂：1.离子交换纤维素

阳离子型离子交换纤维素包括羧甲基纤维素（CM 纤维素）等

阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE 纤维素）

2.常用的离子交换葡聚糖：阳离子交换剂 CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex C-50

阴离子交换剂 DEAE-Sephadex A-25，DEAE- Sephadex A-50

QAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-50

3.离子交换琼脂糖：DEAE-Sepharose （阴离子型）和CM-Sepharose （阳离子型）的离子交换介质具有硬度大、性质稳定、流速好、分离能力强等优点。

离子交换树脂 阳离子交换树脂 强酸型：—SO3H 弱酸型：—COOH 、—OH

阴离子交换树脂。强碱型：—N+(CH3)3Cl 弱碱型：—N+H3 OH 、—N+H2R OH 、—N+HR2 OH 弱酸或弱碱性电解质做有机溶剂萃取时为了获得更好的萃取效果要怎样调节pH 对于弱酸性抗生素 AH =A-+H+ 表观分配系数定义为：K 表=[]

[][]-

+A AH AH

K 表=pKa pH K -+10

10

pH 增大，k 表减小，[AH]更多进入水相，pH 减小，k 表增大，[AH]

更多进入有机相。 对于弱碱性抗生素K 表=p H p Kb K -+10

10

pH 增大，k 表增大，[B]更多进入有机相，

pH 减小，k 表减小，[B]更多进入水相。 简述膜过滤法的五种应用 分别对应哪些膜分离过程

①发酵液的过滤与细胞的收集→超滤UF ，微滤MF

②纯化 1.小分子产品的生产：对于大多数抗生素、AA 、动物疫苗、柠檬酸、醋酸等产品的分子量小于1000，而通常超滤膜的截留分子量为10000～30000；因此抗生素等能透过UF ，而prot 、多肽、多糖等杂质被截留，以致抗生素与大分子杂质达到一定程度的分离，这对后续的提取操作是很有利的。但UF 后浓度变稀，故常用RO 进行浓缩。

2、大分子产品的生产：最主要是酶，酶分子量在20000～200000之间，因此可用MWCO 为10000的膜进行浓缩和去除低分子量杂质,UF 、MF 可用于收集细胞以及将酶与细胞碎片分离用UF 也比较有效。

③浓缩 用RO 法进行浓缩和除去相对分子量更小的杂质。用于除去水中热原，热原分子量范围从20000Da ～0.1μm 聚集体，它不能通过高温消毒来去除。如果产品的相对分子质量在1000以下，使用MWCO 为1×104的UF 可有效地除去热原，并且不影响产品的回收率。 UF 可用于蛋白质类物质的浓缩和精制，多糖类物质的精制等。

④去热原用于除去水中热原，热原分子量范围从20000Da ～0.1μm 聚集体，它不能通过高温消毒来去除。如果产品的相对分子质量在1000以下，使用MWCO 为1×104的UF 可有效地除去热原，并且不影响产品的回收率。

⑤缓冲液变换 在蛋白质纯化中，用透析过滤法变更缓冲液

按膜的结构可以将膜分为哪三类

对称膜(Symmetric Membrane) 非对称膜(Asymmetric Membrane)表面为活性皮层:孔隙直径=10×10-10m ,厚为0.1～1um （起过滤作用）下面是大孔支撑层:孔隙直径:D=0.1～1.0um ,厚为100～200um(起支持活性层作用) 复合膜，底层用相转变法制造，上面再覆盖一层很薄的表皮层，含极性基团。

如何获得过饱和溶液

1、热饱和溶液冷却（等溶剂结晶）适用于溶解度随温度降低而显著减小的体系

自然冷却、间壁冷却（冷却剂与溶液隔开）、直接接触冷却（在溶液中通入冷却剂）

2、部分溶剂蒸发法（等温结晶法）适用于溶解度随温度降低变化不大的体系

加压、减压或常压蒸馏

3、真空蒸发冷却法 使溶剂在真空下迅速蒸发，并结合绝热冷却，是结合冷却和部分溶剂蒸发两种方法的一种结晶方法。 设备简单、操作稳定

4、化学反应结晶 加入反应剂或调节pH 值产生新物质，当该新物质的溶解度超过饱和溶解度时，即有晶体析出；该方法的实质是利用化学反应，对待结晶的物质进行修饰，一方面可以调节其溶解特性，同时也可以进行适当的保护。

5、盐析法 加一种物质于溶液中，使溶质的溶解度降低，形成过饱和溶液而结晶的方法。 加入的物质可以是另一种溶剂或另一种溶质，和原溶剂能互溶。 常用的盐析剂：固体氯化钠、甲醇、乙醇、丙酮

晶体的质量包括哪几方面，如何获得粗大而均匀的晶体

答：晶体质量包括三个方面的内容：晶体大小、形状和纯度

①缓慢的冷却②适当升高温度，较低温度下，得到的晶体较细小③适当缓慢搅拌④加入有一定形状、大小而且比较均匀的晶种。

晶体的大小决定于晶核形成速度和晶体生长速度的对比关系。控制晶核生长速度超过晶核生成速度，会得到较粗大的晶体。

影响晶体大小的因素

晶体的大小决定于晶核形成速度和晶体生长速度的对比关系

决定大小的主要因素有过饱和度、温度、晶核质量、搅拌速度、杂质等

结晶的步骤

①形成过饱和溶液；②晶核形成；③晶体生长。溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过饱和度是结晶的推动力。

饱和曲线与过饱和曲线中三个区域的特点

介稳区，没有新的晶核形成结晶不能自动进行。但若加入晶种，则能诱导产生结晶。

稳定区，不会发生结晶

不稳定区，自发形成晶核，结晶马上开始。