细胞核的分离与鉴定设计型实验设计报告_(2)
实验3 细胞核的分离与核酸的鉴定
实验3 细胞核的分离与核酸的鉴定【实验目的】1.掌握细胞核及细胞质的分离和纯化的一般原理和操作方法。
2.了解DNA在细胞中的分布和核酸鉴定的原理。
3.进一步掌握离心机的工作原理及正确使用方法。
【实验原理】1.DNA主要存在于细胞核， RNA主要存在于细胞质。
2.细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各组分分级分离出来。
肝组织破碎后，柠檬酸能抑制脱氧核糖核酸酶的活性，维持染色质的正常结构和活性。
如将此种细胞核保存在等渗（0.25M）蔗糖溶液中（内含微量钙离子，防止核聚集和脆性），可以比较好地保存其完整的正常结构。
在此条件下离心分离得到的是细胞核的粗制品，如离心时通过0.88M蔗糖的高渗溶液。
适当调整离心力，可得到纯化的细胞核沉淀。
3.脱氧核糖核酸的鉴定：【操作步骤】1、0.5g肝组织＋5ml的1.5%柠檬酸溶液，研磨2、肝匀浆，倾入离心管，离心：3000r/min；15′3、离心结束后，上清液移入另外一个试管中备用（此为细胞质液）4、沉淀中加入1ml的0.25mol/L 蔗糖-柠檬酸溶液，玻棒搅匀后，为核悬液。
5、另外取离心管一只，加9ml 的0.88mol/L蔗糖-柠檬酸液。
用滴管吸取核悬液。
沿管壁缓慢铺于液面上。
6、离心：2000r/min；10′.上层液，弃去；沉淀为初步纯化的细胞核。
7、核洗液5ml洗涤沉淀，离心：2000r/min，10 ′白色沉淀为纯化的细胞核。
8、加10ml 0.02mol/L NaOH溶解细胞核，即为待测的核液。
9、脱氧核糖核酸的鉴定（1）水解：取离心管二支，编号，按下表操作混合各管沸水浴(10’)离心3000r/min;5′上清液(2)鉴定：取试管三支，编号，按下表操作:混合各管沸水浴(15’)冷却比较各管颜色(595nm) 编号 1 2细胞质（ml） 2.0 -核液（ml）- 2.01M过氯酸(ml） 2.0 2.0[结果分析]标准曲线法：分别计算细胞质和细胞核中的含量。
细胞核的分离和鉴定
细胞核的分离和鉴定细胞核的分离和鉴定是生物学实验中的一项重要技术，用于研究细胞核的结构和功能。
以下是细胞核的分离和鉴定的实验步骤和注意事项。
一、实验步骤1.准备实验材料：动物细胞、低速离心机、离心管、磷酸缓冲液（PBS）、生理盐水、DAPI染色液、荧光显微镜、紫外分光光度计等。
2.制备细胞核悬液：将动物细胞在低速离心机中进行离心，去除细胞质和细胞器，得到细胞核悬液。
3.分离细胞核：将细胞核悬液在离心管中进一步离心，去除细胞质和细胞器，得到纯净的细胞核。
4.鉴定细胞核：将分离到的细胞核进行染色，使用DAPI染色液将DNA染色，在荧光显微镜下观察细胞核的形态和染色体的分布。
同时，也可以使用紫外分光光度计检测细胞核中的DNA含量。
二、注意事项1.实验前需要熟悉实验步骤和操作流程，确保实验的准确性和安全性。
2.在制备细胞核悬液时，需要控制离心速度和时间，避免对细胞核造成损伤。
3.在分离细胞核时，需要保证细胞的纯净度，避免其他细胞器和细胞的污染。
4.在鉴定细胞核时，需要选择合适的染色方法和观察条件，确保实验结果的准确性和可靠性。
5.实验结束后需要妥善处理实验材料，保证实验室的安全和卫生。
三、结论细胞核的分离和鉴定是研究细胞核结构和功能的重要技术之一。
通过该技术，我们可以获得高纯度的细胞核样本，进一步研究细胞核内染色体的分布、DNA的含量和基因表达等生物过程。
同时，该技术也可以应用于临床诊断和治疗中，如检测肿瘤细胞的恶性程度和治疗效果等。
因此，掌握细胞核的分离和鉴定技术对于生物医学领域的研究和应用具有重要意义。
四、建议与展望在未来的研究中，可以进一步探索细胞核的分离和鉴定技术的新方法和新技术。
例如，使用新型的分离介质和设备提高细胞核的纯度和提取效率；开发新的染色方法和荧光探针，提高细胞核鉴定的准确性和灵敏度；利用人工智能和机器学习等技术对细胞核图像进行分析和处理，提高实验数据的可重复性和准确性等。
此外，还需要加强对于细胞核结构和功能的深入研究，为临床诊断和治疗提供更多有用的信息和技术支持。
细胞核的分离与核酸的鉴定
冷却 离心
2000r/min;5′
上清液 2．鉴定：取试管三支，编号，按下表操作: ．鉴定： 试管三支，编号，按下表操作 三支 1 2 3 编 号 细胞质水解液（滴） 细胞质水解液（ 核水解液（ 核水解液（滴） 1mol/L过氯酸（滴） 过氯酸（ 过氯酸 二苯胺试剂（ 二苯胺试剂（滴） 20 20 20 20 20 20 比较各管颜色 立即混合各管 冷却
表1.核糖核酸的鉴定 核糖核酸的鉴定
试管编号 现 象
1
2
3
表2.脱氧核糖核酸的鉴定 脱氧核糖核酸的鉴定
试管编号 现 象
1
2
3
1．规范操作，防止滴管、试剂的污染。 ．规范操作，防止滴管、试剂的污染。 2. 细核悬液的平铺要轻柔。 细核悬液的平铺要轻柔。 3. 本次实验要使用很多酸性较强的溶液，取用要 本次实验要使用很多酸性较强的溶液， 小心。 小心。 4. 各项混匀的工作，要充分，并且要注意安全， 各项混匀的工作，要充分，并且要注意安全， 防止液体溢出。 防止液体溢出。 5. 实验中多次用到离心机，注意配平原则；转速 实验中多次用到离心机，注意配平原则； 从低到高。 从低到高。 6. 沸水浴操作时，要注意自己和别人的安全，防 沸水浴操作时，要注意自己和别人的安全， 止液体溅出。 止液体溅出。
H N
蓝色化合物
ω －羟基－γ－酮基戊醛 羟基－ －
（1）分离细胞质与细胞核 ） （2） 核酸的鉴定 ）
（1 ） 分 离 细 胞 实 质 和 验 细 流 胞 程 核
0.5g肝组织 ＋ 少许石英砂研磨 肝组织 柠檬酸溶液， 加5ml的1.5%柠檬酸溶液，研磨，双层纱布过滤 的 柠檬酸溶液 研磨， 肝匀浆， 肝匀浆，倾入离心管
细胞核分离与鉴定
医学细胞生物学设计型实验设计报告姓名吴远依班级医检12-1班学号1210850116 评分实验项目：细胞核的分离与鉴定实验原理：1.细胞是由膜包围着含细胞核、线粒体、核糖体、内质网等结构及其细胞质构成。
细胞内的这些结构的比重和大小等不相同，同一离心场内其沉降速度也不同。
根据这一原理，常用不同介质和转速离心，将细胞各组分分级分离出来，即细胞的分级分离。
2.常用的分级分离法有差速离心法和密度梯度离心法。
差速离心法是指由低速到告诉逐级沉降分离，当离心力低、离心时间短时，较大的颗粒如细胞核先沉淀到管底。
密度梯度离心是用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。
本实验只需把细胞核沉降下来即可，因此不需要使用密度梯度离心法。
然而，差速离心法的使用，必须要把细胞裂解使细胞器暴露出来。
3.细胞核的结构由核膜、染色质、核仁和核基质构成。
本实验采用鸡血细胞，因为鸡血细胞容易吸水胀破。
加入蒸馏水是低渗环境，所以可以使得细胞膜低渗破裂，而由于核膜的组成（蛋白质及脂类的种类、数量、比例）与细胞膜有差别，因此核膜在低渗环境下破裂需要更长的时间，所以控制相对较短的时间，可使细胞核暴露出来。
实验步骤：一、原料的准备取新鲜鸡血5ml加入已经配置好的5g/L的柠檬酸钠抗凝剂5ml 置于烧杯中（柠檬酸钠抗凝剂的制备0.1g加入20ml的蒸馏水）。
二、裂解细胞向烧杯中加入5ml蒸馏水，用玻璃棒沿着同一个方向搅拌1min。
离心取已经处理过的鸡血细胞5ml置于离心管中，以2000r/min离心5min。
涂片取上清液制成一张涂片，标记为①。
将原离心管中剩余上清液吹打沉淀成悬液（如果上清液多，可以倒掉些），标志为②。
染色分别在涂片①②上滴加甲苯胺蓝染液，染色5~7min。
洗涤冲去染液，晾干显微镜下观察注意事项：1.取到鸡血时不能过较长时间才加入抗凝剂；2.裂解鸡血细胞时，一定要严格控制时间，否则时间过长细胞核也会裂解；3.制片过程中要把握涂片的力度，以免涂片过厚；洗涤切片时，时间不要太长，以免把染料全部冲去，观察不到细胞核。
细胞核分离纯化和核酸含量的测定2
是非题
RNA都存在于细胞浆中。 （NO） RNA在过氯酸溶液中加热水解后，其核糖部分可脱水形成
糠醛。 （NO） 在DNA双链结构中，碱基位于内侧，两条链的碱基之间以
氢键相接触。 （YES）
单选题
1.——可用于测定DNA的浓度。（B）
A.OD280 B.OD260 C. OD240 D.OD220 2. Tm值与DNA的分子大小和所含碱基中的————比例成
管号
1
2
ห้องสมุดไป่ตู้
3
2.0
—
—
—
2.0
—
—
—
2.0
2.0
3.0
2.0
3. DNA标准曲线的制作： 标准曲线在墙上。
四、结果与计算
1. 样品中RNA含量（g/mL）=碱水解液中RNA含 量（g/管）稀释倍数（细胞质稀释6倍，核液稀释 3倍）。 2. 样品中DNA含量（mg/ml）=酸水解液中DNA含 量（mg/管）稀释倍数（细胞质与核液均稀释2倍） 细胞质与核液的实际用量（均为2ml） 3. 分别计算出细胞质和细胞核中RNA：DNA的比值。
2. 显色及比色： 取试管3支，编号。按表10-1加入试剂立 即混匀，置沸水浴中10min，取出冷却，在660nm波长 处比色。以第3管作空白，读取光密度，查RNA标准曲 线，获得细胞质和细胞核水解液中RNA的含量。
表中 RNA含量测定显色及比色时试剂加入方法
试剂（ml）
细胞质水解液 核水解液 0.3 mol/L三氯乙酸 苔黑酚液
管号
1
2
3
1.0
—
—
—
2.0
—
1.0
—
2.0
3.0
细胞的分离与鉴定
可以利用分离细胞核所需要的离心力将 细胞核分离出来， 细胞核分离出来，再运用细胞化学法 进行鉴定。 进行鉴定。分离细胞核最常用的方法 是将组织制成匀浆， 是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介 质中用特定的离心力进行离心、分离， 质中用特定的离心力进行离心、分离， 然后进一步分析鉴定。其基本过程包 然后进一步分析鉴定。 括组织匀浆、分级分离和分析3个步骤。 括组织匀浆、分级分离和分析3个步骤。
三、实验步骤
断 头
开腹 取肝
生理盐水 10ml
洗涤 2-3次
称取约 1g肝 1g肝 离心
预冷蔗糖预冷蔗糖-CaCl2 8ml
剪碎 低温匀浆
过滤 配平 涂片① 涂片① 涂片② 涂片②
2500rpm 15min 甲苯胺蓝 5-7min
上清液 沉淀制成悬液
染色
冲洗、晾干、 冲洗、晾干、镜检
四、结果观察
高倍镜下可见肝细胞核已游离 出来，被染成蓝紫色，圆形， 出来，被染成蓝紫色，圆形，中央 有2-4个甚至更多个深蓝色的核仁。 个甚至更多个深蓝色的核仁。
五、注意事项
1 匀浆的规范操作 2 离心机的正确使用 3 涂片技巧 保持实验台的卫生（ 4 保持实验台的卫生（纱布清洗 干净等） 干净等）
细胞生物学实验
细胞核的分离与鉴定
一、实验目的
1 2 3 掌握分离细胞核的原理 熟悉细胞核的鉴定方法 了解细胞核的分离过程
二、实验原理
细胞核的比重和大小与细胞内其他组 分不同， 分不同，在同一离心场内其沉降速度也 不同，所以，常用不同介质和不同的离 不同，所以， 心力离心（即差速离心）， ），将细胞内各 心力离心（即差速离心），将细胞内各 细胞器 和组分分级分离 出来。 出来。
实验仪器
细胞核的分离和鉴定 (2)
• •
镜检
四、注意事项
• 1.用三氯醋酸处理时，时间不能过长或过短，过长 会使核膜裂解，过短会使抽取的核酸不足。 • 2.在染色时时间一定要足够，否则染色不完全得不 到理想的结果。 • 3.去掉胞质的核体贴附能力弱，应注意在固定、三 氯醋酸处理、染色时尽量避免胞核的脱落。
五、预期结果
• 在低、高倍镜下 ，可观察到经 1﹪碱性固绿染 色的肝细胞涂片 b的细胞核体被 染成绿色。说明 这是碱性蛋白， 即细胞核已游离 出来。
三、操作流程
• 颈椎脱臼法处死小白鼠 剪碎置于盛有0.9﹪NaCl烧杯中，反复洗涤，用 滤纸吸去表面的液体 • 取鼠肝1g • 去污 • • • 量取8ml预冷的0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液 先加入少量，加入肝组织后全部加入 匀浆过滤 研磨3~5次，用3层纱布过滤，制作涂片a，自然干燥 •
三、操作流程
•
离心
2500r/min离心15min ，离去上清液
•
•
悬浮
• • • • • •
• 涂片放入1﹪碱性固绿中染色10min，冲洗，晾干
6ml0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液悬浮沉淀物， 再以2500r/min离心15min ，离去上清液 ，制成悬液制作涂片b，自然干燥 固定 涂片a、b放入70﹪乙醇溶液固定5min，晾干 处理 固定好的涂片浸入90℃ 5﹪三氯醋酸溶液2min，冲洗，滤纸吸干多余水分 染色
二、实验用品
• ⑴材料：小白鼠肝脏 • ⑵试剂：0.9﹪NaCl溶液、0.25mol/L蔗糖0.003mol/L氯化钙溶液、70﹪乙醇溶液、 5﹪三氯醋酸溶液、1﹪碱性固绿。 • ⑶仪器设备：显微镜、普通离心机、天平 、离心管、滴管、玻璃漏斗、量筒、25毫 升烧杯、解剖剪、镊子、冲洗瓶、纱布、 玻璃匀浆器、载玻片、盖玻片、染色盘架 、气管。
细胞核的分离与鉴定
细胞核的分离与鉴定
细胞核是细胞中的重要组成部分，它包含了细胞所有的遗传信息。
因此，分离和鉴定细胞核对于研究细胞生物学极为重要。
本文将介绍细胞核的分离和鉴定的方法。
1. 利用离心法分离细胞核
离心法是将混合物沉淀分离出不同密度组分的方法。
分离细胞核的常见离心法有两种：
(1) 不同速度离心分离法：此方法中，首先将细胞用生理盐水洗涤后，用一定浓度的卵白酶消化除了细胞表面的蛋白质。
接下来，用卵白酶抑制剂中和卵白酶的作用，以避免对细胞核的影响。
然后，将细胞用离心管离心，分离出胞浆和细胞核，离心速度根据细胞类型和实验目的来定。
(2) 密度梯度离心分离法：此方法中，首先制备密度梯度液，将细胞悬液添加到密度梯度液上层，离心分离，从而得到不同密度的细胞组分。
具体实验步骤可参考文献。
染色质是细胞核中的主要成分，其中包括染色体。
因此，利用染色体分离技术可以鉴定细胞核。
常见的染色体分离方法有两种：
(1) 干切片染色体分离法：此方法中，将细胞用生理盐水洗涤，再用一定比例的低渗盐溶液或isotonic KCl溶液处理，使其肿胀和膨胀，然后涂在玻璃片上，用过的废染液或乙醇固定。
接着，将涂有细胞的玻片在高温下加热，使其变薄，再进行染色和观察。
(2) 体外染色体分离法：此方法中，取同种细胞制备成细胞核悬液，再加入5倍体积的低渗盐溶液，使染色质膨胀，不同染色体在离心过程中分离。
然后，制备成干片，进行染色和观察。
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实验项目：细胞核的分离与鉴定
实验原理：
分离细胞核的可用方法有吸出法、原生质体破裂法、差速离心法排和排除法。
差速离心法是根据细胞内各种细胞结构的比重和大小不同，因而在同一离心场内的沉降速率不同从而将细胞内的结构分级分离出来。
本实验就采用差速离心法。
细胞核的鉴定，因为细胞核中主要含DNA，而DNA是碱性蛋白，可用甲苯胺蓝染液可使细胞核内碱性蛋白呈现出来。
实验器材：显微镜，普通离心机，离心管，滴管，玻璃漏斗，纱布，烧杯，解剖剪，镊子，玻璃匀浆器，载玻片/盖玻片，染色盘架，小白鼠肝脏。
实验试剂：甲苯胺蓝染液，蒸馏水，0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液，生理盐水
实验步骤：
（1）、用颈椎脱臼法处死小白鼠，迅速解开其腹腔取出肝脏，去出结缔组织，剪成小块，尽快置于盛有0.9%NaCl的烧杯中。
反复洗涤尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。
（2）、将湿重为1g的肝组织放入烧杯中，用量筒取8ml预冷的0.25mol/L 蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液，先加少量溶液于烧杯中，尽量剪碎肝组织后全部加入。
（3）、将剪碎的肝组织导入匀浆管中，使匀浆器下端侵入盛有冰块的器血
中，左手持，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3-5次。
用3层纱布过滤于匀浆管中，然后制备一张涂片①，自然干燥。
（4）、将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机以2500r/min离心15min,弃去上清液。
（5）、用6mol 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液悬浮沉淀物，以2500r/min离心15min 弃去上清液，将残留液体用气管吹成悬液，滴一滴于干净的载盖玻片上，制成涂片②，自然干燥。
（6）在①·②上滴加甲苯胺蓝染液，染色5-7min，洗涤干燥后镜检。
⑺记录观察结果
注意事项：
（1）尽可能充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。
（2）将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离心，以防止浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层效果。
（3）涂片制作过程中把握好涂片的力度，不可太厚。
（4）染色后的洗涤要注意时间，不可过长，避免将染色洗去，观察不到细胞核。
（5）开腹取出肝后，用生理盐水反复冲洗，避免血细胞对食盐的影响。
预期结果：
在低、高倍镜下，可以观察到经.0.1%碱性固绿染色的小白鼠肝细胞的细胞核体被染成绿色。
说明这是碱性蛋白，即细胞核已游离出来。
涂片在高倍镜下可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色、圆形、中央有
2—4个甚至更多个深蓝色的核仁。
细胞核呈紫红色，上面附着少量胞质及浅蓝色碎片。