6细胞核和线粒体的分离和观察
细胞组分的分级分离
离心机机型 低速离心机 高速离心机 超速离心机
转速 8 000转/分 8 000~25 000转/分 25 000 ~ 80 000转/分
分离方法
❖ 差速离心分离法：利用不同离心速度产生的不同离 心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。
❖ 密度梯度离心分离法：将要分离的细胞组分铺放在密 度逐渐增加的介质表面，在超速离心力的作用下， 不同的组分以不同的沉降速率沉降，形成不同的 沉降带。
线粒体含量较多；长度适合观察，约5μm；肝脏较软，易 于破碎，并且适于快速提取，因而利于保持线粒体活性。
细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其 他微体、核糖体和大分子。
詹纳斯绿B可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线 粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使詹纳斯绿B染料始终保持 氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中詹 纳斯绿B被还原成无色的化合物。
一半肝组织，0.25M蔗糖洗3次，加3ml 0.25M蔗糖，剪碎
匀浆（5-8次），6层纱布过滤至10ml离心管 取出1ml至dorf管（A），3000rpm，10min
沉淀加入1ml 1M蔗糖，悬
上清入dorf管(B)
涂片1 涂片2
3800rpm,10min
12000rpm,20min
弃上清，沉淀加少量 0.25M蔗糖，悬
❖ 离心技术：
1. 是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基 本手段。
2. 转速为10-25kr/min的离心机称为高速离心机。
3. 转速>25kr/min，离心力>89Kｇ者称为超速离心机。
4. 目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500Kg。
颗粒直径 103nm 102~104nm 102nm
分离线粒体
从细胞、组织中分离线粒体——差速离心法所需缓冲液：RSB（使细胞膨胀的低渗缓冲液）10mM NaCl（Mr=58.44）2.5mM MgCl2（Mr=203.3）10mM Tris-Cl（PH8.0）调PH值至7.4配法：0.5844g NaCl，0.5083g MgCl2·6H2O，10ml 1M Tris-Cl（PH8.0），调PH值至7.4，加水定容至1000ml。
2.5×MS缓冲液（MS缓冲液是用来保持细胞器张力的等渗缓冲液）525mM甘露醇（Mr=182.17）175mM 蔗糖（Mr=342.3）12.5mM Tris-Cl（PH8.0）2.5mM EDTA（PH8.0）调PH值至7.4配法：19.13g甘露醇，11.98g蔗糖，加150ml水溶解，加2.5ml 1M Tris-Cl（PH8.0），1ml 0.5M EDTA（PH8.0），用1M HCl调PH值至7.4，加水定容至200ml。
1×MS缓冲液210mM甘露醇70mM 蔗糖5mM Tris-Cl（PH8.0）1mM EDTA（PH8.0）调PH值至7.4配法：38.26g甘露醇，23.96g蔗糖，加800ml水溶解，加5ml 1M Tris-Cl（PH8.0），2ml 0.5M EDTA（PH8.0），用1M HCl调PH值至7.4，加水定容至1000ml。
注意事项：溶液、离心管应在冰上预冷，所有离心步骤都要在40C进行。
从细胞中分离线粒体：1．消化贴壁细胞，加5ml培液，转入10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加5ml PBS，1000rpm离心5min，弃上清；悬浮细胞直接转入10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加5ml PBS，1000rpm离心5min，弃上清。
2．用3ml冰上预冷的RSB重悬细胞，让细胞膨胀10min，加3×61uL PMSF贮液，在冰上匀浆，转速不宜过快。
动物离心实验报告总结
细胞离心技术是生物学研究中常用的技术之一，通过对细胞或细胞器进行离心分离，可以实现对细胞器结构和功能的深入研究。
本实验旨在通过动物细胞离心技术，分离细胞核、线粒体等亚细胞器，并对其结构和功能进行初步观察。
二、实验目的1. 掌握动物细胞离心技术的基本原理和操作方法。
2. 分离细胞核、线粒体等亚细胞器。
3. 观察分离得到的亚细胞器的形态和结构。
三、实验原理细胞离心技术是利用细胞器在一定介质中的沉降速度差异，通过差速离心法将细胞器逐级分离。
细胞器在离心过程中，由于密度、半径和悬浮介质的黏度不同，其沉降速度也不同，从而在离心管底部形成不同大小的沉淀层。
四、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜动物组织、缓冲液、蔗糖溶液、詹纳斯绿B染料等。
2. 实验仪器：离心机、匀浆器、显微镜、离心管、烧杯等。
五、实验步骤1. 制备匀浆：将新鲜动物组织剪碎，加入适量缓冲液，用匀浆器制成匀浆。
2. 离心分离：将匀浆按照一定比例加入缓冲液和蔗糖溶液，进行差速离心，分离细胞核、线粒体等亚细胞器。
3. 观察与鉴定：将分离得到的亚细胞器进行染色，用显微镜观察其形态和结构。
4. 记录与分析：记录实验结果，分析分离得到的亚细胞器的结构和功能。
六、实验结果1. 成功分离出细胞核、线粒体等亚细胞器。
2. 观察到细胞核呈圆形，线粒体呈椭圆形，具有明显的双层膜结构。
3. 通过染色观察到线粒体内膜上的细胞色素氧化酶，进一步证实了线粒体的分离。
1. 实验结果表明，动物细胞离心技术能够有效地分离细胞核、线粒体等亚细胞器，为后续研究亚细胞器的结构和功能提供了基础。
2. 在实验过程中，要注意以下几点：a. 离心速度和时间的控制：离心速度和时间的长短会影响细胞器的分离效果，需要根据实验目的和细胞器的密度进行选择。
b. 缓冲液和蔗糖溶液的配置：缓冲液和蔗糖溶液的浓度、pH值等参数会影响细胞器的分离效果，需要根据实验要求进行配置。
c. 染色剂的选择：染色剂的选择要考虑到对细胞器的特异性和染色效果，本实验采用詹纳斯绿B染料对线粒体进行染色，取得了较好的效果。
核质分离实验报告
一、实验目的1. 理解核质分离的原理和方法。
2. 掌握使用差速离心法进行细胞核和细胞质分离的操作步骤。
3. 熟悉显微镜观察细胞核和细胞质的结构。
二、实验原理细胞是生命活动的基本单位，细胞内的各种细胞器具有不同的结构和功能。
细胞核是细胞的控制中心，含有遗传物质DNA；细胞质是细胞核以外的所有细胞结构的总称。
核质分离实验是细胞生物学实验中的一个基本操作，通过差速离心法将细胞核和细胞质分离，便于对细胞核和细胞质进行进一步的研究。
三、实验用品1. 细胞悬液：取新鲜动物细胞或植物细胞，用生理盐水洗涤后制成细胞悬液。
2. 差速离心机：用于进行差速离心操作。
3. 显微镜：用于观察细胞核和细胞质的结构。
4. 试管：用于盛装细胞悬液和离心后的沉淀物。
5. 移液器：用于移取细胞悬液。
6. 离心管：用于盛装细胞悬液和离心后的沉淀物。
7. 生理盐水、缓冲液、蔗糖等试剂。
四、实验步骤1. 取适量细胞悬液，加入离心管中，充分混匀。
2. 将离心管置于差速离心机中，进行差速离心。
具体操作如下：a. 首先进行低速离心（例如1000g，10分钟），以去除细胞碎片和细胞膜等杂质。
b. 然后进行中速离心（例如3000g，10分钟），以分离细胞核和细胞质。
c. 最后进行高速离心（例如10000g，10分钟），以进一步纯化细胞核。
3. 离心完成后，取出离心管，轻轻倒掉上清液，保留沉淀物。
4. 将沉淀物加入适量的生理盐水，混匀后制成细胞核悬液。
5. 取适量细胞核悬液，滴加于载玻片上，用盖玻片封片。
6. 将载玻片置于显微镜下观察细胞核的结构。
7. 取适量细胞质沉淀物，加入适量的生理盐水，混匀后制成细胞质悬液。
8. 将细胞质悬液滴加于载玻片上，用盖玻片封片。
9. 将载玻片置于显微镜下观察细胞质的结构。
五、实验结果与分析1. 显微镜下观察细胞核，可见细胞核呈圆形或椭圆形，核膜清晰，染色质分布均匀。
2. 显微镜下观察细胞质，可见细胞质呈均匀的透明状，含有细胞器、线粒体等结构。
细胞生物学之笔记--第6章
第六章 线粒体mitochondion与细胞的能量转换 第一节 线粒体的基本特征 一、线粒体的形态、数量&结构 （一）线粒体的形态、数量与细胞的类型和生理状态有关 线状、粒状、杆状etc 直径0.5~1.0μm。 （二）线粒体是由双层单位膜套叠而成的封闭性膜囊结构 1. 外膜是线粒体外层单位膜 outer membrane 5~7nm厚，50%脂类、50%蛋白（重量） 外膜蛋白 多为 转运蛋白，形成跨膜水相通道（直径2~3μm），允许分子量10kD以下分子通过，包括 小分子多肽（氨基酸平均分子量128D） 2. 内膜的内表面附着许多颗粒 inner membrane 4.5nm厚，20%脂类、80%蛋白 内腔/基质腔（matrix space） 由内膜包裹的空间 外腔/膜间腔（intermembrane space） 内、外膜之间的空间 嵴（cristae） 内膜大量向内腔突起性折叠形成 嵴间腔（intercristae space） 嵴与嵴之间的内腔部分 嵴内空间（intracristae space） 由于嵴向内腔突起，造成的外腔向内伸入的部分 内膜通透性很小，分子量大于150D，就不能通过 内膜有高度的选择通透性，膜上转运蛋白控制内外腔的物质交换 内膜内表面附着许多颗粒，数目：104~105个/线粒体，称 基粒elementary particle =ATP合酶复合体（ATP synthase complex） 3. 内外膜相互接近所形成的转位接触点是物质转运到线粒体的临时性结构 转位接触点 translocation contact site 电镜观察揭示内外膜有些接触点 转位接触点分布有蛋白质等物质进出线粒体的通道蛋白和特异性受体，称内膜转位子translocon of the inner membrane, Tim; 和外膜转位子translocon of the outer membrane, Tom 4. 基质是氧化代谢的场所 基质matrix 内腔中充满的电子密度较低的可溶性蛋白质和脂肪等成分 基质中含各种酶：三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸分解、蛋白质合成 基质中含有 双链环状DNA、70S核糖体 有1~多个DNA拷贝，有独立 遗传物质复制、转录、翻译 5. 基质的化学本质是ATP合酶 基粒，又称 ATP合酶复合体，头部 直径9nm，柄部 长5nm，宽4nm 二、线粒体的化学组成 三、线粒体的遗传体系 （一）线粒体DNA构成了线粒体基因组 mtDNA(mitochondrial DNA) 裸露、不与组蛋白结合，基质内 一个线粒体 平均5~10个DNA分子，编码线粒体的tRNA、rRNA及一些线粒体蛋白质 但大多数酶和蛋白质仍由细胞核DNA编码，在细胞质中合成，转送到线粒体中 线粒体基因组 共16 569 bp，双链环状DNA，一条重链，一条轻链。只含少量非编码序列 两条链编码物不同，共编码37个基因 （线粒体中约有1000个基因产物） 13个蛋白质 均以ATG（甲硫氨酸）为起始密码，有终止密码 37个基因 24个其他：2种 rRNA分子（12S& 16S 重链） & 22种tRNA分子（14个重链 8个轻链）
第六章 线粒体和质体 北大陈建国细胞生物学(共59张PPT)
红藻分裂环的分离及蛋白质鉴定。参见Yoshida et al. 2009 Curr Biol
Conclusion
The morphology and number of mitochondria in cells are regulated by well-balanced mitochondrial fusions and divisions;
为近圆形。此外，经DAPI染色后的叶绿体中可以观察到叶绿体DNA颗粒状荧光（大箭头）。同时，细胞质中可以观察到线粒体DNA的 荧光信号（小箭头）。N：细胞核。Bars = 10微米。图片由北京大学胡迎春博士提供。
CRUMPLED LEAF (CRL)编码一个质体外膜蛋白，突变影响质体
分裂，形成超大的叶绿体。参见Asano et al. 2004 Plant J
线粒体的融合与分裂。（a）洋葱表皮细胞内线粒体在51秒和69秒时间段内相继发生融合和分裂的荧光显微照片。实验使用可变色荧光蛋白（Kaede） 标记线粒体。红色和绿色的颗粒为不同的线粒体。当它们融合后颜色叠加成为黄色。箭头指示融合发生。（b）烟草悬浮培养细胞中的 线粒体以及90秒和40秒时间段内线粒体发生分裂的荧光显微照片。实验使用MitoTracker (red) 标记线粒体，同时用SybrGreen标记线粒体DNA。在重合的照片 中，红色和绿色两种荧光叠加出现的黄色荧光区域为线粒体拟核（DNA）所在的位置。注意在线粒体分裂过程中，线粒体DNA并不 被均等分配。箭头指示没有拟核荧光的线粒体。Bar = 2微米。图片来自Arimura et al. 2004中的Fig. 2和Fig. 4，有改动。 。
SG Nawaschen (1898)
Bull Acad Imp Sci St Petersburg
液泡系线粒体的超活染色与观察及叶绿体的分离与观察课件
熟酸性强且液泡
液泡系线粒体的超活染色与观察及叶绿体的分离与观察
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•2、分离出的线粒体立即用詹纳斯绿B染色和放置2h后再染色，比 较
两者着色的差异。
液泡系线粒体的超活染色与观察及叶绿体的分离与观察
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线粒体不会亮得那么明显. 因为詹纳斯绿B染色,利用的是氧化线粒体,使得线粒体的能量表现出 来。使得化学能转化成光能,让你发现.放置一段时间后,由于线粒体 失去的活性,所以氧化效果不明显,因而不会亮得那么明显.
液泡系线粒体的超活染色与观察及叶绿体的分离与观察
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•3、分离叶绿体时应注意什么问题？
液泡系线粒体的超活染色与观察及叶绿体的分离与观察
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分离过程最好在0～4℃的条件下进行；如果 在室温下,要迅速分离和观察
液泡系线粒体的超活染色与观察及叶绿体的分离与观察
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液泡系线粒体的超活染色与观察及叶绿体的分离与观察
液泡系、线粒体的超活染色与观察 叶绿体的分离与观察
液泡系线粒体的超活染色与观察及叶绿体的分离与观察
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一、实验目的
• 1、观察植物活细胞内液泡系的形态、数量、分布及演进过程 • 2、观察线粒体的形态 • 3、学习超活染色技术 • 4、掌握叶绿体的离心方法以及离心机的使用 • 5、观察叶绿体的形态
液泡系线粒体的超活染色与观察及叶绿体的分离与观察
液泡系线粒体的超活染色与观察及叶绿体的分离与观察
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• 二、线粒体的超活染色
• 取洋葱鳞茎内表皮细胞和人口腔黏膜上皮细胞，用1/5000的詹那 斯绿B染色15min(注意不可使染液干燥，必要时可再滴加几滴染 液），吸去染液，加一滴Ringer液，盖片观察。
液泡系线粒体的超活染色与观察及叶绿体的分离与观察
荧光显微镜观察线粒体融合和裂变
荧光显微镜观察线粒体融合和裂变荧光显微镜下观察线粒体融合和裂变线粒体是存在于大多数真核细胞中的细胞器，负责能量产生和细胞凋亡等重要功能。
它们具有动态形态，不断融合和裂变，以维持细胞健康和适应环境变化。
荧光显微镜技术为研究线粒体融合和裂变过程提供了宝贵的工具。
荧光标记为了在荧光显微镜下可视化线粒体，需要对它们进行荧光标记。
常用的标记方法包括使用线粒体靶向的荧光染料，如米托追踪红(MitoTracker Red) 或透肌红 (Rhodamine 123)。
这些染料选择性地积累在线粒体基质中，发出荧光信号，使研究人员能够追踪个体线粒体的运动和形态变化。
荧光显微镜成像荧光显微镜利用荧光激发和发射的原理成像荧光标记的线粒体。
光源发射特定波长的光，被荧光染料吸收。
激发的染料分子随后发射出更长波长的光，可被显微镜检测器捕捉。
通过调节激发波长和发射滤光片，可以针对特定荧光染料进行优化成像。
线粒体融合线粒体融合是两个或多个线粒体融合形成单个线粒体。
这一过程对于维持线粒体功能和细胞健康至关重要。
荧光显微镜可用于动态监测线粒体融合。
通过时间推移成像，研究人员可以观察标记的线粒体逐渐接近、接触和融合，形成一个更大的线粒体。
线粒体裂变线粒体裂变是单个线粒体分裂成两个或多个较小线粒体。
这一过程对于线粒体分布、质量控制和细胞凋亡至关重要。
荧光显微镜可用于监测线粒体裂变。
通过时间推移成像，研究人员可以观察标记的线粒体逐渐变长、变细，最终在中央区域裂开，形成两个独立的线粒体。
应用荧光显微镜观察线粒体融合和裂变的应用广泛，包括：研究线粒体动力学与细胞功能之间的关系确定影响线粒体融合和裂变的因素探索线粒体动力学在疾病中的作用，例如神经退行性疾病和心血管疾病开发靶向线粒体融合和裂变的治疗策略结论荧光显微镜是研究线粒体融合和裂变的宝贵工具。
通过使用荧光标记和特定的成像技术，研究人员可以动态监测这些过程，深入了解线粒体动力学在细胞健康和疾病中的作用。