植物查尔酮异构酶的生物信息学分析
不同植物查尔酮合成酶CHS基因的生物信息学分析(1)
Bioinformatics Analysis of Chalcone Synzyme （ CHS） Genes in Different Plants
ZHANG Tao （ College of Life Science，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China） Abstract： In this paper，the nucleic acid sequences and the conjectural amino acid sequences of chalcone synthase （ CHS） genes registered in GenBank in 10 plant species were analyzed by using bioinformatics method． Several parameters of these sequences，including physicochemical property，signal peptide，transmembrane regions，hydrophobicity or hydrophilicity，functional domains and secondary structures，were detailedly analyzed，and the phylogenetic tree was constructed for CHS amino acid sequences． The results showed that the full － length of ORF of 10 CHS genes was about 1． 2 kb and encoded 399 amino acids． All amino acid sequences of CHS in different plant species contained 1 potential N － glycosylation site （ 32NMSS） ，4 protein kinase c phosphorylation sites （ 69TIR，158SVK，202TFR，359SAK） and 1 chalcone synthase active position （ 161RLMMYQQGCFAGGTVLR） ． All the amino acid sequences were hydrophobicity protein，without signal peptide and transmembrane regions． Key words： Chalcone synzyme； Bioinformatics； Function analysis； Structure prediction
植物查尔酮合成酶分子生物学研究进展
植物查尔酮合成酶分子生物学研究进展河南农业科学植物查尔酮合成酶分子生物学研究进展王燕,许锋,程水源(1,长江大学园艺园林学院,湖北荆州434025;2,黄冈师范学院生命科学与工程学院,湖北黄冈438000)摘要:查尔酮合成酶(chalconesynthase,CHS,EC2.3.1.74),是植物类黄酮物质合成途径中的第一个酶,也是植物次生代谢途径中的关键酶之一,对植物具有非常重要的生理意义.为此,综述了查尔酮合成酶基因结构,基因进化,表达调控机理以及诱导因子,概述了查尔酮合成酶基因工程在植物生理方面的研究,并进一步对查尔酮合成酶的分子生物学研究做了展望.关键词:植物;查尔酮合成酶;分子生物学;基因工程中图分类号:943.2文献标识码:A文章编号:1004—3268(2007)08—0005—05查尔酮合成酶(chalconesynthase,CHS,EC2.3.1.74)是植物类黄酮物质合成途径中的第一个酶.它催化该途径的第一步,即3个分子的丙二酰一CoA和1个分子的对香豆酰一CoA结合形成第一个具有C15架的黄酮类化合物一查尔酮.该产物进一步衍生转化构成了各类黄酮化合物l1].此中间物的异构化和功能基团的进一步取代都能导致黄酮,异黄酮和花色素苷的合成.这些化合物为自然界提供了颜色,并参与了植物的多种生理过程,包括防紫外线辐射,抗病,生长素运输,花粉的育性等,.现已对许多植物查尔酮合成酶基因进行了分离克隆和测序,很多学者通过转基因方法成功地将外源查尔酮合成酶基因导入植物,提高了转基因植物查尔酮合成酶活性,并且这些植物都表现出了目的生理性状.而且查尔酮合成酶在植物中是普遍存在的,它的分子进化存在多种途径,也有许多查尔酮合.成酶基因的分子进化途径的研究报道.在此基础上对国内外植物查尔酮合成酶分子生物学及基因工程的研究进展进行了综述.1查尔酮合成酶基因结构自从第一个荷兰芹的chs序列在l983年发表以来,到目前为止,已从多种双子叶,单子叶和裸子植物中克隆了s基因,例如,玉米,高粱,兰花,矮牵牛引,拟南芥,金鱼草l.],豆类～.和松树|l等.所有报道的chs基因都属于多基因家族,chs基因在结构上非常保守,除金鱼草的1个chs基因AMCHS含有2个内含子外[1o2.其余的chs 均只包含1个内含子和2个外显子.而且这个内含子的位置在已发现的序列中均相同,即位于第65位(以欧洲赤松PinusSylvestris的PSCHS为标准)的半胱氨酸密码子内第一和第二位碱基之间,其长度从几十碱基对到几千碱基对不等.外显子l较短,只编码约60个氨基酸,且长度变异较大;外显子2编码约340个氨基酸,在进化中较保守,易于排序,提供的进化信息较多|1.王金玲等的研究也表明,可用CHS基因外显子2代表全基因进行研究口. Koes等研究矮牵牛的CHS基因家族包括8～l0个成员,在植物正常发育中仅CHs—A和CHs—J在花中表达,前者转录mRNA占CHS总mRNA的90[8l2查尔酮合成酶基因进化CHS在植物中是普遍存在的,现认为最早在陆生植物中出现,例如,轮藻纲和苔藓植物『2.有资料显示,CHS是从脂肪酸代谢途径中的一个酶进化而来.越来越多的证据显示,在进化的过程中,CHS的功能有过多次转变,例如,不断重复地转变成芪合成酶(stilbenesynthase,STS).Tropf等收稿日期:2007—03—14基金项目:湖北省自然科学基金(2002AB094);湖北省青年杰出人才基金(2003AB014);教育部新世纪优秀人才计划(NCET一04—0746);湖北省教育厅重大科技项目(Z200627002)作者简介:王燕(1967一),女,江苏南通人,吾0教授,主要从事银杏次生代谢分子生物学方面的研究.通讯作者:程水源(1965一).男,湖北天门人,教授,博士生导师,主要从事银杏次生代谢方面的研究.5?2007年第8期通过CHS和STS的进化指出,在进化的历史中,STS曾经几次从CHS独立地进化出来.Lanz等指出,CHS在植物的不同类群中是很保守的,已有数据表明,CHS基因是一个较大的基因家族,其编码区比较保守,长约1.2kb,科之间的氨基酸同源性在7O～90[243.Ursula等首次尝试用CHS基因编码区的DNA序列来研究物种的进化关系引,当时他们只分析了7个种8个序列;王金玲等于2000年共分析了19个科的83个序列_1川.基于最筒约法对所研究的CHS基因外显子2部分DNA序列构建的系统进行自展分析的结果表明:各科序列在分支图上的分布情况不同,对于大部分分科,同一科的序列都形成一组,只有少数科的序列分布在相距很远的分支中,在CHS基因的进化中,经常发生基因重复一分歧(duplication—divergence). 攀枝花苏铁的2个克隆CPA1和CPA5分布在相距很远的分支中,说明CHS基因的重复在裸子植物就已经发生.杨俊波等的研究表明l2:山茶属CHS基因家族在进化过程中已分化为A,B,C3个家族,包括A1,A2,A3,B1,B2,C等6类不同的基因成员.其中只有A2类成员为全部被研究的5种植物所共有,而其他类成员只在部分被研究的植物中发现.所有这些CHS成员具有很高的同源性,在核苷酸水平上同一亚家族内基本上高于9O,不同亚家族间也在78%以上.从推测的氨基酸组成看,山茶属内CHS基因的功能一旦发生了分化,各类成员的碱基替代率会有较大差异.进一步分析认为,该属CHS基因的分化直到近期还在活跃地进行.Ferrerd等也指出不同种的进化式样有一定的差别,这种不同的进化式样可能是物种形成后受不同环境因素影响而形成的.近几年来的研究结果表明,CHS只是植物聚酮化合物合成酶家族中的一个成员.通过功能和序列鉴定这个家族的其他成员包括:STS,ACS,2PS,这些蛋白与CHS的序列同源性在65～75之间. Durbin等指出,CHS非常适合于基因复制的研究和基因家族起源的调查引.但是,目前还没有从假定的早期陆生植物中或者其可能的祖先植物中分离得到CHS及其相关的基因,关于这些植物中CHS 相关蛋白合成的次生代谢产物也没有研究.3CHS基因表达的调控研究3.1CHS表达的调控机理CHS是类黄酮生物合成过程中第一个关键酶,6CHS基因的表达受多种内外因素的调控.将CHS基因的启动子片段与GU5报告基因连接,导入植物细胞,通过转基因,原生质体瞬时表达,定点专一突变等手段对CHS基因的启动子进行研究,在CHS 基因启动子区找到了一些作用元件.正是这些元件以及他们与转录因子之间的相互作用,决定了CHS 基因的表达方式受发育和内外因素的复杂调控【2. 与查尔酮基因表达相关的顺式作用元件与反式作用因子已陆续被发现川,如ACE元件(ACGele—ment)『3l,.,H区(H—box)_33],富含AT元件(A T —richelement)_34I.,沉默子(Silencer)[.,P区(BoxP)[37J,工区和Ⅱ区(BoxI和BoxⅡ)_3.3.2CHS表达的诱导因子查尔酮合成酶往往受不同的发育调控和组织特异性调控,对不同外界刺激的敏感程度也不同. Senebier在18世纪末最早发现类黄酮的生物合成受光的调控,在一些植物中,花色素苷只有在光照下才会产生.Arthur也认为,刺激花色素苷合成最有效的光是蓝光/UV—A和UV—B.CHS的表达产生mRNA受到蓝光,紫外光的调节.在香菜细胞培养中,CHS表达产生最大量mRNA同时需要蓝光和紫外光.在自芥和香菜中,暗生长的幼苗CHS表达产生mRNA受光敏色素调节,而成熟叶片中, UV—B和uV—A/蓝光受体介导CHS表达产生mRNA.拟南芥中,紫外光和蓝光控制幼苗CHS表达产生mRNA和成熟叶组织的CHS表达.光敏色素对幼苗的CHS表达起作用[3.除了受光诱导外,CHS的表达还受病原微生物侵染和机械损伤等各种外界因子所诱导c4¨.4CHS基因工程与植物生理代谢4.1CHS转基因在植物花色的影响方面研究截至目前,大多数花卉新品种都是通过传统育种方法来获得的[4.而传统的方法存在着很多的局限性.遗传工程技术的发展给观赏植物产业的发展开辟了一条新的途径,在大多数植物种类中,类黄酮化合物是最重要的花色素.类黄酮生物合成基因的克隆,为遗传工程手段改变花色奠定了基础.目前,遗传工程技术可以从两个方面来改变花的颜色. 第一:抑制类黄酮生物合成基因的活性,导致中间产物的积累和花色的改变;第二,引入新基因来补充某些品种缺乏合成某些颜色的能力【l4.抑制类黄酮生物合成基因的活性有2种方法:一是通过反义RNA技术将目的基因的反义链连接河南农业科学在启动子后面,并转化植物,使目的基因的表达受到抑制;二是通过向植物中引入额外数量的目的基因拷贝,以共抑制技术方式,使目的基因的表达受到抑制[4.CHS基因的反义抑制和共抑制技术已经在牵牛,天竺葵,菊花和玫瑰中取得了成功].用遗传工程技术改变花色的另一条途径是通过转基因技术.例如,牵牛中的二氢黄酮醇4～还原酶不能把二氢黄酮醇(dihydrokaempfero1)转化为合成花葵素糖苷的中间产物,用传统的方法很难培育出橘红色的牵牛花.Meyer等利用遗传工程技术,将玉米的dfr基因转化进入开白花的牵牛中,使该DFR基因在牵牛中表达,产生的dIr酶能使二氢黄酮醇转化为相应的中间产物,进一步合成花葵素糖苷,培育出了橘红色的牵牛花[4.4.2CHS基因工程在植物育性方面的研究类黄酮与植物的育性有密切的关系.它在花粉中主要的合成部位是绒毡层,然后运输到子囊腔并最后进入花粉粒的外壁,成为组成外壁的一个重要的成分.因此,类黄酮在花粉粒的形成中起着非常重要的作用.研究认为,chs—a转基因植物雄性不育现象的产生可能是由于chs在花药中的转录.邵莉等人将正向chs—a基因转入矮牵牛中,在成功地改变了花的颜色的同时还发现了转基因植物也出现了雄性不育的现象.在玉米中,人们早就发现由于CHS突变(C2, Whp)而产生的不育的白色花粉粒.与此同时,水稻中类CHS基因的异常表达也可能导致花粉粒败育l_4.张毅等研究证明了在水稻花药中特异表达的类查尔酮合成酶基因D5mRNA的积累在四分体时期达到高峰并持续到小孢子时期,而这一时期与外壁的形成密切相关,而且有报道表明,拟南芥的雄性不育突变体msl2即为花粉外壁形成的缺陷型.4.3CHS基因工程在植物防御反应中的研究对于chs在植物防御反应中的调控方式的研究正在两个方向上进行:一是观察植物受到病原微生物侵染后的各种生理变化;另一个是研究与CHS表达相关的调控因子及其基因的调控方式.在病原微生物与植物相互作用的过程中,各种激发因子和抑制因子大都存在于细胞之外,而CHS 及其他与真菌有关的基因的表达均发生在细胞内, 细胞外的信号如何传递到细胞内,是一个引人注目的问题.目前已确证与CHS表达有关的信号传递过程是磷酸肌醇(PI)途径.不少研究结果显示.植物在遭受病原微生物侵染后,CHS活性显着增强,chs活跃转录,这些结果表明,由CHS调控的苯丙烷代谢反应很可能是植物抵抗病原物侵染的重要防卫反应之一[5.齐放军等用水稻抗白叶枯病近等基因系材料及转基因系材料,研究了水稻白叶枯病菌互作中,水稻防卫基因chs的转录特征[5.Northern检测结果显示,在与白叶枯病菌非亲和性互作中,水稻chs基因的转录均不受到诱导或只是受到很微蜀弓的诱导. 表明由chs基因调控的苯丙烷核心反应的启动和产物的合成,有助于增强水稻对白叶桔病菌的抗性.试验结果显示:互作中水稻chs基因是否受到白叶枯病菌的诱导,不仅与水稻中抗病基因有关,而且还与抗病基因的种类有关.表明水稻chs基因在互作中是否受到诱导转录,取决于其水稻功能性抗病基因产物对白叶枯病菌的专化性识别[5.从植物受到病原微生物侵染开始,到chS被诱导表达一系列调控过程至今还缺乏一个完整的认识.相信随着chs这一模式基因在植物防御机制中的作用研究的不断深入,人类不但将进一步认清植物基因调控的机理,而且可以通过利用它们的调控途径来改变某些基因的表达效应,从而为改良作物品种,提高作物抗病能力开辟一条崭新的途径.5展望迄今,有关学者至少对1o余种植物查尔酮合成酶基因进行了转化研究,如烟草,核桃,芸香,水稻,玫瑰,百合,矮牵牛,黄瓜,玉米等,尤其是在观赏植物花色的转基因研究方面最为深入.在未来农业中,开展CHS基因的克隆,结构特点,表达部位和时空表达模式的研究.以便有目的的用之于转化植物,使之在转基因植物中大量,持久地表达,提高目的次生代谢产物的含量,使植物查尔酮合成酶转基因应用进入产业化具有重要意义.参考文献:[1]程水源,颐曼如,束怀瑞.银杏叶黄酮研究进展[J].林业科学,2000,36(6):110一l15.[2]KoesRE,FrancescaQ,JosephNM.Theflavonoid biosyntheticpathwayinplants:functionandevolution 口].Bioessays,l994,16:123—132.[3]MartinCR.Structure,function,andregulationofthe chalconesynthase[C]//.InternationReviewofCytolo gy,l993,147:233—284.[4]ReimoldU,KroegerM,KreuzalerF,eta1.Coding72007年第8期E5J[6]E7]E8][9][io3[11][12][13][14][15]and3noncodingnucleotide thasemessengerRNAandsequenceoftheenzyme[J].18O6.sequenceofchalconesyn—assignmentofaminoacidEMBOJ,1983,2:1801一FrankenP,NiesbachKU.WeydemannU,eta1.The duplicatedchalconesynthasegenesC2andWhp(white pollen)ofZeamaysareindependentlyregulated;evi—dencefortranslationalcontrolofWhpexpressionby theanthocyaninintensifyinggene[J].EMBOJ,1991,10:2605—2612.LoC,CoolbaughRC.NicholsonRI.Molecular characterizationandinsilicoexpressionanalysisof chalconesynthasegenefamilyinsorghumbicolor[J]. 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矮牵牛的查尔酮合酶(CHS)基因的生物信息学分析
农学学报
JOURNAL OF AGRICULTURE
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导 法 将 CHS 基 因 反 义 片 断 导 入 非 洲 菊 (Gerbera jamesonii, Bolus.)中，内源 CHS 合成受到抑制，花色素 合成大大受阻，从而使花色发生改变。因此，利用基因 工程技术对 CHS 基因进行调控具有重要意义。近年 来很多物种的 CHS 基因被相继克隆，但利用生物信息 学的方法系统研究这些基因间的进化关系尚未见相关
2.4 氨基酸序列之间的多重比对分析 从图 2 可以看出，CHS 基因的同源性较高，达到
80.55% 。 这 说 明 该 基 因 比 较 保 守 ，有 多 个 同 源 性 达 到 100%的区段，这些区段序列信息将对其他物种中 该 基 因 的 克 隆 具 有 很 重 要 的 参 考 作 用 ，也 为 后 续 利 用 RNA 干扰的转基因方法改变花色提供了保守区 段。此外，在序列信息中还可发现，一些 CHS 基因
(School of Life Sciences, Hunan University of Science and Technology, Xiangtan 411201, Hunan, China)
Abstract: To study the homology and evolutionary relationships among CHS (chalcone synthase) genes, and using the CHS gene in Petunia hybrida as studied object, its base distribution, amino acids composition and hydrophobicity or hydrophilicity were analyzed by the software and bioinformatics web site, as well as multiple comparisons and phylogenetic analysis with other 10 species. The mRNA single sequence contained 1170 bp base, the number of amino acids encoding protein was 389 and its relative molecular mass was 42580.02, leucine gave the highest content of 10.80% , hydrophobic maximum value was 2.038, hydrophobic minimum value was -2.208, and no obvious hydrophilic or hydrophobic area was found. The homology of multiple comparisons of the amino acid sequence for CHS genes in 11 species achieved 80.55%. The genes were in a stable state, encoded protein was hydrophilic protein, and the evolutionary process was conservative. The conservative sequence information achieved in these CHS genes laid a foundation for other new CHS gene cloning. Key words: Chalcone Synthetase Gene; Flower Colour; Bioinformatics; Sequence Analysis
植物查尔酮异构酶的生物信息学分析
摘 要 ： 用生物信息学方法和 工具对 Ｇ ｎ ａｋ中的洋葱 、 豆 、 采 ｅＢ ｎ 豌 番茄和茶 等植物 的黄酮类 化合物合成关键 酶查 尔酮异构酶（ ＨＩ的核 酸和氨基 酸序 列进行 了比对、 Ｃ ） 分析 和建模 ， 而对其 进
分子结构 、 理化性质 、 亚细胞 定位 、 白转运肽 、 蛋 跨膜结构域 、 疏水性 、 分子 系统进化 、 白质二级和 蛋
基查 尔酮生成异黄酮类化合物 和黄酮类化合 物 ； 另一种
主要存在 于非豆 科植物 中 ， 化 ６－ 氧查尔酮 生成 ５ 催 ， 脱 羟基黄烷酮［ 。目前 Ｃ Ｉ 因 已先后 从豌 豆、 】 Ｈ 基 矮牵牛 、 苜蓿等多种植物 和人类粪便厌氧细菌中被克隆出来 引， 通过代谢工程的研 究证明 改变 Ｃ 活力 可 以有效 调控 ＨＩ
关键词 ： 查尔酮异构酶 ； 生物信息学 ； 黄酮类化合物
中图分类号 ： ４． ； ５８ 文献标识码 ： 文章编号 ： ０ －００ （０８ ０ —０ ９ —０ Ｑ ９ ６５Ｑ ５ Ａ １ １ ０９ ２０ ）２ ｌ３ ５ ０
黄酮类 化合 物是 由苯丙 烷类化 合物衍 生得 到的一
大类植物次生代谓 产物 ， ｝ 其特点是具有 Ｃ －３Ｃ 的基本 ６ 一６ Ｃ 骨架 ， 并可根据中间吡喃环 的不 同氧化水 平和两侧 Ａ、 Ｂ
核酸及氨基酸序列的分子结构 和理 化性质 分析 、 开放阅
读框的查找 和翻译使用 Ｖｅｔｒ Ｔ ｃ Ｉ ｏ Ｎ ８软件完成 ； 核酸及
氨基酸序 列的 同源性 比对使 用 Ｃｕｔ ｌｓ ｌＸ软 件 和 Ｎ Ｂ ａ ＣＩ 上的 Ｂａｔ ｌ 在线工具完成 ； ｓ 分子系统发生树使 用 ＭＥ Ａ Ｇ ３ 的 Ｐ ｙ ｇｎ ｈ ｌ ｅｙ中的 Ｎ ｉｈ ｏ－ ｉ ｎ ｏ ｅ ｂｒ ｏｎ ｇ方法构建 ； ｇ Ｊ ｉ 亚细胞定 位情况的考察 使用 Ｔ ｒｅ ． ｅｖｒ 线 完成 ， 对 ａｇｔ １ １Ｓ ｒｅ 在 Ｐ 并
查尔酮合成酶基因在植物生理学研究中的应用
16生物技术世界 BIOTECHWORLD查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS,EC 2.3.1.74)属于植物次生代谢过程当中黄酮类分子合成的关键酶,跟类黄酮分子的关系很大,使此过程进行有效催化的首要环节,即将3分子的丙二酰辅酶A(malonyl-CoA)和1分子的4-香豆酰辅酶A(4-coumaroyl-CoA)联系生成首个拥有C13骨架的黄酮类分子—查尔酮,此物质经过衍生会转变成多种黄铜类的物质,这一化合物的异构化以及功能团的深入都可以使黄铜、异黄酮以及花色素的有效合成物被替代。
此物质在大部分生理生化过程里发挥着很大的作用,目前已经成了植物生理生化以及分子生物学进行研究分析的的热点。
对于查尔酮合成酶来说,其在苯丙氨酸代谢过程和植物的成长过程里至关重要,会参与植物成长的一系列环节,像植物抗病能力、放太阳照射等。
现在早已晓得胁迫像UV照射,以及诱导子再就是伤害因素等都能够抓变CHS金银的表达,再就是,此种基因的表达会受到苯丙素类物质所代谢分子和蔗糖等物质的制约。
截止到现在,GenBank数据库里面存在四千多条植物CHS基因,使得转基因植物查尔酮合成酶所具有的活性得以提升,同时,所有植物都呈现了目的生理性状。
在这样的条件下,在总体阐述了国内外植物查尔酮合成酶基因在植物生理学方面的有关研究到底进展到什么情况。
1 CHS 基因的构成第1个植物CHS基因序列是1983年在欧芹(Petroselinum hortense)细胞悬浮液中被检测到的,其分子量大约为50kDa。
现在,对于CHS基因来说,早就从大量的单子叶、双子叶以及骡子植物里面复制了很多,我们从新闻中看到的CHS基因的相关报道,大部分都是多基因家族。
通过研究得知,CHS基因就其结构来看,是比较保守的,其组成大约超四百个氨基酸,它的相对分子质量却是4.2×104。
只有金鱼草中的CHS基因有2个内含分子存在,别的CHS都是存有1个内含分子或者是2个外显子,所有的内含子的地点都在序列中的相同位置上。
查尔酮异构酶分子生物学研究进展
3.2 催化反应发生过程及分子机理
CHI 催化的分子内环化反应需要底物具有 2’位羟基，反应开始于对底物查尔酮 2’-羟基 的去质子化，产生的 2’-氧负离子对 α,β-不饱和双键的 β-碳原子进行亲核攻击，产生 2'-酸性 在 pH7.5 时， CHI 催化 4,2’,4’,6’羟基基团 （图 3） 。 CHI 催化的这种环化反应是 pH 依赖的[19]， 四羟基查尔酮、 4,2’,4’-三羟基查尔酮、 2’,4’-二羟基查尔酮的催化活性达到 90%以上， 而 4,2’二羟基查尔酮很低的环化效率也反映出它的 2’位羟基基团的高 pKa 值。在 pH6.0 时，CHI 催化 4,2’,4’,6’-四羟基查尔酮、 4,2’,4’-三羟基查尔酮的催化活性只有 50%， 而 CHI 催化 2’,4’二羟基查尔酮和 4,2’-二羟基查尔酮的催化活性更低。比较 CHI 与 7,4’-二羟基黄烷酮、7-羟 基黄烷酮和 4’-羟基黄烷酮复合物的晶体结构，显示所有的 7-羟基黄烷酮都有共同的结合方 式，而 4’-羟基黄烷酮则结合在活性部位的另一侧[19]。
4. CHI对黄酮代谢的调控
研究表明 CHI 是黄酮代谢途径中一个很重要的关键酶， 降低 CHI 酶活性或 CHI 突变体 能导致植物中查尔酮大量积累，黄酮化合物的含量显著降低。如：降低翠菊（C.chinensis）
-4-
[23]
、康乃馨（Dianthus caryophyllus）[24]、仙客来（Cyclamen persicum）[25]的 CHI 酶活性，
图 2 CHI 催化反应示意图 Overall reaction 化生成(2RS)-黄烷酮， 但只有(2S)-黄烷酮是后来的黄酮 类化合物代谢过程的中间产物，而由 CHI 催化的反应速度是自发反应速度的 107 倍，且催化 产物中 99.999%的是(2S)-黄烷酮[16]。植物中缺少 CHI 活性的突变体，如拟南芥 tt5 突变体仅 能产生很少量的类黄酮，影响种子的正常着色[17]。而若将 typeⅠ的 chi 基因转到拟南芥 tt5 突变株中使其过量表达，可以使转化株产生正常的柚皮素而使种皮颜色恢复正常[18]。
白木香查尔酮合酶(AsCHS1)基因的克隆和生物信息学分析
白木香查尔酮合酶（AsCHS1）基因的克隆和生物信息学分析目的：对国产沉香的源植物白木香Aquilaria sinensis查尔酮合酶（chalcone synthase，CHS）基因AsCHS1编码区进行克隆，并对其进行生物信息学分析和表达分析。
方法：根据已报道的白木香伤害转录组高通量测序结果分析获得1条具有查尔酮合酶保守结构域的CHS基因序列，采用RT-PCR技术，以不同伤害时间白木香木质部混合样品总RNA为模板克隆得到白木香AsCHS1的基因编码区序列，并对AsCHS1蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析。
另外，采用qRT-PCR方法，以组蛋白（histones）为内参对AsCHS1基因在伤害胁迫下的表达模式进行分析。
结果：序列分析表明，所克隆的AsCHS1基因编码区开放阅读框（opening reading frame，ORF）长为1 194 bp，编码397个氨基酸残基，命名为AsCHS1。
qRT-PCR实验证明该基因表达量在伤害后12 h最大，说明该基因能够在早期响应伤害胁迫。
结论：白木香AsCHS1基因的编码区序列的分离克隆为进一步研究AsCHS1蛋白在白木香中黄酮合成途径中的功能及表达调控奠定基础。
标签：查尔酮合酶；白木香；黄酮合成国产沉香为瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg含树脂的木材。
作为我国传统中药，沉香有具行气止痛、温中止呕、纳气平喘的功效，用于胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急[1]。
沉香为极珍贵芳香类药材，因其产量低、价格高，远远不能满足市场的需求。
沉香叶的资源丰富，探讨沉香叶代替沉香药材的可行性是沉香研究开发中的一个重要研究方向。
通过对沉香叶提取物的化学成分及药理研究，沉香叶中含有多糖、黄酮、苷类及酚类等化学成分[2-6]，具有镇静、抗炎、止血、抗肿瘤、抗氧化等药理作用[7]。
其中，黄酮类物质，如芫花素、木樨草素等均具有药理活性[8]。
三种蕨类植物查尔酮合成酶(CHS)基因的克隆与分析的开题报告
三种蕨类植物查尔酮合成酶(CHS)基因的克隆与分析的开题报告摘要：蕨类植物是一类古老的植物，具有良好的药用和食用价值。
查尔酮合成酶(CHS)是蕨类植物合成次生代谢物的重要酶，在蕨类植物的生物合成过程中起着关键作用。
本研究旨在克隆三种不同蕨类植物的CHS基因，并对其进行序列分析和表达模式研究，以期深入探究蕨类植物的生物合成机制。
1. 研究背景蕨类植物是一类古老的植物，分布广泛，包括了蕨、石松、蘑苔等多种，具有重要的药用和食用价值。
蕨类植物是地球上最早的裸子植物之一，其生存时间可追溯到4.6亿年前，对环境的适应能力极强。
查尔酮合成酶（CHS）是蕨类植物合成次生代谢物的重要酶，在化学防御、异色花色和抗氧化等方面起着关键作用。
随着基因工程和生物技术的发展，研究CHS基因及其调控机制已经成为国内外学者的热门研究课题。
2. 研究目的本研究旨在克隆三种不同蕨类植物（蕨、石松、蘑苔）的CHS基因，并对其进行序列分析和表达模式研究，以期深入探究蕨类植物的生物合成机制。
3. 研究方法（1）样本采集：分别采集蕨、石松和蘑苔的新鲜叶子样本。
（2）总RNA提取：采用TRIzol法提取样本总RNA。
（3）cDNA合成：将提取的总RNA进行逆转录反应，制备出cDNA模板。
（4）CHS基因克隆：采用PCR扩增方法，使用通用引物扩增CHS 基因的全长序列。
（5）克隆序列分析：将PCR产物进行酶切、测序和分析，获得CHS基因的全长序列，并进行多序列比对和物种系统发育树构建。
（6）实时荧光定量PCR：采用实时荧光定量PCR技术对三种蕨类植物中CHS基因的表达模式进行研究。
4. 预期结果预计可以从三种不同的蕨类植物中成功克隆到CHS基因，并获得其全长序列。
通过多序列比对和系统发育树构建，可以对三种蕨类植物的CHS基因进行进化分析和比较。
通过实时荧光定量PCR技术，可以研究三种蕨类植物中CHS基因的表达模式，揭示CHS基因在蕨类植物中的生物合成机制。
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第一作者简介:雷桅(1982 ),男,硕士研究生,主要从事药用植物代谢工程研究。
E mail:weil06@ 。
通讯作者:孙敏。
基金项目:三峡库区生态环境教育部重点实验室开放基金资助(EF200609)。
收稿日期:2007-09-01植物查尔酮异构酶的生物信息学分析雷 桅1,邹 祥2,向 阳1,汤绍虎1,孙 敏1(1.西南大学生命科学学院,三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆400715;2.西南大学药学院,重庆400715)摘 要:采用生物信息学方法和工具对GenBank 中的洋葱、豌豆、番茄和茶等植物的黄酮类化合物合成关键酶查尔酮异构酶(CHI)的核酸和氨基酸序列进行了比对、分析和建模,进而对其分子结构、理化性质、亚细胞定位、蛋白转运肽、跨膜结构域、疏水性、分子系统进化、蛋白质二级和三级结构等重要参数进行了预测和推理。
结果表明:该类酶基因的全长包括5 、3 非翻译区和一个开放阅读框,无蛋白转运肽,且定位于细胞质基质,是一个疏水性蛋白,二级结构均以随机卷曲和 螺旋为主要构件,洋葱和豌豆的CHI 三维建模成功。
关键词:查尔酮异构酶;生物信息学;黄酮类化合物中图分类号:Q 946.5;Q 558 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2008)02-0193-05黄酮类化合物是由苯丙烷类化合物衍生得到的一大类植物次生代谢产物,其特点是具有C6 C3 C6的基本骨架,并可根据中间吡喃环的不同氧化水平和两侧A 、B 环上连接的各种取代基,而分为不同的黄酮类型。
研究证明黄酮类化合物对植物自身进行正常的生理活动起着重要作用,如调节生长、UV 防护、抗虫抗病、花色形成,影响花粉育性,诱导植物根部与共生菌相互作用等。
因此作为园艺植物中一类重要的化学成分,一直备受农艺界的广泛关注,是花色基因工程和天然产物代谢工程研究的一类主要目标产物。
查尔酮异构酶(c halcone isomerase,CHI)是第1个被认识的黄酮类化合物合成相关酶,也是黄酮代谢途径中的关键酶之一,它催化柚皮苷查尔酮异构化形成有生物活性的二羟基黄烷酮。
CHI 一般可分为两种类型,一种主要存在于豆科植物中,催化6 脱氧查尔酮和6 羟基查尔酮生成异黄酮类化合物和黄酮类化合物;另一种主要存在于非豆科植物中,催化6 脱氧查尔酮生成5羟基黄烷酮[1]。
目前CHI 基因已先后从豌豆、矮牵牛、苜蓿等多种植物和人类粪便厌氧细菌中被克隆出来[2 5],通过代谢工程的研究证明改变CH I 活力可以有效调控黄酮类化合物的含量,例如超量表达牵牛花CHI基因使番茄果皮中的黄酮水平提高了78倍[6],降低康乃馨中的CHI 酶活得到奇特的黄色花朵[7],而CH I 失活的洋葱突变体中槲皮素水平明显下降[8]。
因此对CHI 的研究是当前一个十分重要的热门话题。
现利用生物信息学的方法,以洋葱(Allium cep a)为重点,对豌豆(Pisum sativum )、番茄(Lycop ersicon esculentum )、茶(Camellia sinensis)等园艺植物查尔酮异构酶的基因及相应氨基酸序列的理化性质、结构特征、生化功能及系统演化关系等进行预测和分析,以期为今后深入研究CH I 家族蛋白的酶学特性和黄酮生物合成的分子机理提供理论依据。
1材料与方法数据来源于NCBI 核酸和蛋白质数据库中已登录的查尔酮异构酶(CH I)的核酸序列及其对应的氨基酸序列:洋葱(Acc ession:AY541034)、豌豆(Accession:U03433)、番茄(Accession:AY348871)、茶(Accession:DQ120521)。
利用Vector NTI 8、Clustal X 、MEGA3、ViewerLite 4.2软件和ww 、 等网站提供的各种在线生物信息学工具进行预测和分析。
核酸及氨基酸序列的分子结构和理化性质分析、开放阅读框的查找和翻译使用Vector NTI 8软件完成;核酸及氨基酸序列的同源性比对使用Clustal X 软件和NCBI 上的Blast 在线工具完成;分子系统发生树使用MEGA3的Phylogeny 中的Neighbor Joining 方法构建;亚细胞定位情况的考察使用TargetP 1.1Server 在线完成,并对其结果进行SignalP 及ChloroP 分析,得到蛋白质信号肽和叶绿体转运肽的相关信息;跨膜结构域和疏水性分析分别使用TMHMM 和ProtScale 完成;蛋白质二级结构预测和三级建模分别使用GOR 和SWISS MODEL 完成。
2结果与分析1932.1 植物CHI基因的核酸及相应氨基酸序列的分子结构和理化性质分析Vector NTI8分析得到的洋葱、豌豆、番茄和茶的核酸序列和氨基酸序列相关结构和性质数据见表1,其中洋葱CHI基因的全长mRNA序列及其推导的氨基酸序列如图1所示。
由表1可见,不同植物CH I基因全长、开放阅读框碱基数及其所编码的氨基酸残基数相差较小,且编码区的起始密码子均为ATG,而终止密码子则不一致,洋葱和豌豆的是TGA,番茄和茶的是TAA。
同时,不同植物CHI的分子量、等电点、摩尔消光系数、酸性氨基酸比例、碱性氨基酸比例、带电氨基酸比例、极性氨基酸比例、疏水性氨基酸比例等理化指标均表现出一定的差异,这表明CH I基因可能存在一定的物种特异性和生化多态性;含量最丰富的氨基酸也不完全相同,但至少都含有Lys,说明Lys在CHI的催化反应中起着重要作用。
表1 植物CHI基因的核酸及相应氨基酸序列的分子结构和理化性质分析指标洋葱豌豆番茄茶基因全长/bp90590210011002开放阅读框全长/bp678669786720起始位点及密码子/bp85ATG22ATG81A T G92ATG 终止位点及密码子/bp763T GA691T GA867T AA812T AA 氨基酸残基数226223262240分子量/kDa24.17024.78728.97226.353等电点 5.107.20 5.65 5.34摩尔消光系数167401141078007920含量最丰富的氨基酸/%Arg8.85Gl u8.41Gl y9.73Lys8.07Il e8.07Leu11.66Lys13.36Glu10.69Gl y7.63Lys12.08L e u9.17Gly8.33酸性氨基酸比例/%12.8313.4516.0316.25碱性氨基酸比例/%9.7313.4515.2714.58带电氨基酸比例/%26.5534.0833.9734.58极性氨基酸比例/%22.1221.5220.6120.00疏水性氨基酸比例/%38.0535.4331.3031.251cg cgg g aag cag tcg ta tca acccag ag ta cg cg gg g act acat cat tt cta gat t tt cat cta tacct cat aat t ca ag aaM E A V T K L D V E G T A F D S V I I P P G S S K T H F L G G A G 84ATG GAAGCAGTGACAAAGT TGGACGTAGAAGGAACTGCCTT TGA T TCAGT CATCATCCCT CCCGGTT CATCCAAAACGCACTTT CTCGGCGGTGCAGGT V R G L E I G G K F I A F T A I G I Y L E T D S I P F L A D K W K184GTAAGGGGTT T AGAAATTGGAGGTAAATT T AT AGCGTT T ACGGCAATCGGCATCTACTTGGAAACAGATTCAATT CCGT TTCTTGCTGA TAAAT GGAAA G K T G E E L A G S L D F F R D I C T G P F E K F T N V T M I L P 242GGAAAAACAGGCGAGGAACTCGCTGGT TCACTCGACTTT TTT CGAGATAT ATGCACAGGACCCT TTGAGAAA T TTACTAA T GTAACAATGA T TCT CCCT L T G E Q Y S E K V T E N C V A Y W K A I G I Y T D A E A S A V D 359CT AACGGGAGAACAGTACTCCGAAAAAGT AACAGAAAATT GT GTGGCT T ATT GGAAAGCAATT GGAA T CT ACACAGATGCAGAAGCGTCGGCTGTTGAT K F K Q A F K P E S F P P G S S I L F T H T P S G T L K I A F S K 407!AAGTTTAAACAAGCT TTTAAACCT GAGAGTTT CCCTCCT GGTTCA T CCATTCT CTT CACTCAT ACCCCTAGCGGAACACTAAAGA T TGCA T TT TCAAAA D G S V S K D E G V L I E N K A L T Q A V L E S I I G E H G V S P 580GATGGT TCGGTT TCTAAAGATGAAGGCGT ACT CA T TGAGAA TAAGGCGCTGACACAAGCCGTA T TGGAGT CGATTATTGGGGAGCATGGT GTATCACCT A A K L S I A S R L S E I M N K V G N V E E K L P V L S*679GCTGCTAAGCT AAGCAT AGCATCGAGA T TGTCAGAGAT T ATGAACAAAGTT GGAAACGTGGAAGAAAAGT T ACCGGTGCTT TC At g a a t t g g g aa g g a t t 779cg t g aa g ga aa at g at g g t ct g tg t t t ta aa ct ag at g a ag t cg act t ct t gt g t g ag a ta g tc act g g ag aa t ta ct g g gt t g ca at aa ta a cat t aa t 879tctgtgatcaacaaaaaaaaaaaaaaaa图1 洋葱CHI的cDNA全长序列及推测的氨基酸序列注:编码区和翻译的氨基酸用大写字母表示,起始密码子用∀表示,终止密码子用*表示,UTR用小写字母表示。