基因工程复习要点
基因工程复习要点
基因工程复习要点一1.载体的功能1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供必要的条件2.基因工程学科建立的理论和技术发明1.三大理论：DNA是遗传物质、1953年提出DNA的双螺旋结构、提出中心法则和遗传密码2.三大技术：工具酶的发现、载体的发现、逆转录酶的发现3.质粒的特点质粒是一类存在于细菌和真菌细胞中能独立于染色体DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子，也称cccDNA.通常在1~100范围内。
自主复制性、可扩增性、可转移性、不相容性4.描述PBR322质粒筛选过程PBR322质粒有两个标记基因，氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。
若在康四环素抗性基因上插入外源DNA,则1.先将转化液涂布在含有氨苄青霉素的平板上，未长的菌落是未导入质粒的菌落2.再将上述平板上存活的菌落影印到含有四环素平板上，在四环素上不长但在氨苄青霉素上长的转化子即为重组子。
5.简述PUC系列质粒筛选重组子的过程PUC是在PBR322质粒上改造的若在lacZ’标记基因上插入外源DNA，则将转化液涂布在含有Amp的平板上，蓝色菌落为非重组子，白色菌落为重组子，没长的未导入质粒。
6.基因工程操作的基本流程1.离：从供体细胞中分离出基因组DNA2.切、连：用限制性核酸内切酶分别将外源DNA和载体分开,用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，构成重组DNA分子3.转、增：将重组DNA导入受体细胞，段时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中4.筛：筛选经转化处理的细胞，获得外源基因高效稳定的基因工程菌或细胞5.表达：筛选好的菌或细胞导入到受体中使其高效稳定表达7.为什么说逆转录酶的发现对基因工程学科的建立至关重要1.对分子生物学的中心法则进行修正和补充2.使真核基因的制备成为可能可将mRNA反转录形成DNA用于获得目的基因3.在致癌病毒的研究中发现癌基因，为肿瘤发病机理的研究提供有价值线索8.蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。
基因工程复习重点
Southern blotting：即DNA印迹杂交，以碱基互补配对为原则，将DNA影印转移与标记探针进行高特异性杂交的方法。
Cosmid：黏粒载体，含有λ噬菌体的cos位点和质粒的复制子，是专门为克隆大片段设计的载体。
cDNA library：利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增称cDNA文库。
RACE：通过反转录和PCR技术进行cDNA末端快速扩增，得到基因转录本的未知序列，从而获得mRNA完整序列的方法。
RT-PCR：即逆转录PCR，先用逆转录酶作用于mRNA，以寡聚dT为引物合成cDNA 第一链，然后用已知一对引物，扩增嵌合分子的一种方法。
MCS：包含多个限制酶切位点的一段短的DNA序列。
插入失活：若把外源DNA片段插入到载体的选择标记基因中而使此基因失活，丧失其原有的表现特性，此方法叫插入失活。
PCR：是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。
mRNA差异显示技术：根据真核生物mRNA带有3’poly(dA) 的结构，合成poly(dT)12MN引物与mRNA的3’端互补，在反转录酶的作用下合成cDNA－mRNA 杂交分子。
然后合成5’随机引物(10bp) 和poly(dT)12MN引物，PCR扩增获得所有mRNA的cDNA分子。
巢式PCR：巢式PCR使用两对PCR引物扩增完整的片段。
第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。
第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。
实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
蛋白质印迹法：又称免疫印迹法，在蛋白质凝胶电泳和固相免疫测定基础上发展起来的蛋白质检测技术，检测蛋白样品中是否存在抗原，也可以评价新抗体的特异性。
大学基因工程复习归纳重点复习资料
基因工程复习归纳第一章绪论1.基因工程的定义：是指按照人们的愿望，经过严密的设计，将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体/宿主）内，使之按照人们的意愿稳定遗传、并表达出新的性状的技术。
2.基因工程概念的发展：遗传工程→DNA重组技术→分子/基因克隆（Molecular/Gene→基因工程→基因操作。
应用领域以“基因工程”、“DNA重组”为主基因工程基因工程的历史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重组技术1978：Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市1988：PCR技术诞生1989：我国第一个基因工程药物rhIFNα1b上市2003: 世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市3.基因工程的三大关键元件基因（供体）：外源基因、目的基因载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗传的DNA分子（克隆载体、表达载体）。
宿主（受体）：，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞（组织、器官或个体）。
4.基因工程的基本步骤（切、接、转、增、检（大肠杆菌是中心角色）（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。
（2）重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。
（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。
（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。
（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
第二章 DNA重组克隆的单元操作一、用于核酸操作的工具酶1.限制性核酸内切酶(主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵)。
限制性核酸内切酶的功能与类型其中II型限制性核酸内切酶：切割位点专一，适于DNA重组，是DNA重组中最常用工具酶。
基因工程复习知识点
基因工程复习资料一、知识点1.根据基因工程的定义，能替代基因工程的术语。
2. 含有II型限制性内切酶切位点的DNA 片段的特点。
3.已知一双链DNA分子，分别用限制酶Ⅰ、限制酶Ⅱ切割单独切割得到不同片段；同时用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割时，得到另外的片段，据此分析该双链DNA分子结构及酶切位点情况。
4．质粒分子生物学的描述。
5．在植物基因工程中广泛使用的载体。
6．质粒带有α互补的 lacZ'标记基因，那筛选培养基中加入显色底物和诱导物分别为？7．载体常用的选择性标记：抗生素、生化标记、营养缺陷型标记的包括哪些（要能区分缩写符号）。
8．DNA双链是靠什么化学键维持？9．能有效区分重组子与非重组子的是方法有哪些？10．离体cDNA 合成中所涉及的工具酶是有哪些？11．强化基因转录的元件是哪些？12．基因调控元件中属于负调控顺式作用元件的是哪些？13．关于包涵体的叙述。
14. 在单子叶、双子叶植物及动物的遗传转化过程中，应用最成功的间接转化法分别是什么15. 在对转基因植物进行分子鉴定时，检测外源基因的整合、表达、转录，分别可以采用哪些方法？16．细菌存在限制-修饰的现象，其生理意义是什么？17．Taq DNA 聚合酶的发现使得 PCR 技术的广泛运用成为可能，是利用其哪个特点？18．关于柯斯质粒（cosmid）描述。
19．Cosmid、 -DNA 、 Plasmid几种常用载体的装载量大小比较20．载体质粒 pBR322上的两个选择性标记： Ap r、 Tc r。
它们分别含有一个单一酶切位点： Pst I 、 Sph I。
若将一外源基因插入Ap r中的Pst I位点，那么转化子和重组子如何筛选，若插入Sph I又如何筛选？21．DNA-DNA,DNA-RNA分子杂交的化学原理是什么（靠什么维持其双链稳定性）？22．cDNA 法获得目的基因的特点表现为？23．原核生物启动子的特征是有哪些？24．强化 mRNA 翻译的元件是哪些？25．高等哺乳类动物基因在大肠杆菌中高效表达时，包涵体形成的原因是？26.动物基因转移法中的胚胎干细胞法有何特点？（）27. 如何正确理解基因漂移？28.熟悉pBR322、pUC18/19载体的组成元件及作用、简写所代表的含义。
基因工程复习资料
基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因堆叠技术和dna重组技术，就是以分子遗传学为理论基为础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种dna分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内乌核酸酶就是一类能够辨识双链dna中特定核苷酸序列（辨识序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内乌核酸酶通常就是以第一次抽取至这类酶的生物的种名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字ⅰ、ⅱ、ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.dna连接酶：定义：dna连接酶也称dna黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接dna链3‘-oh末端和，另一dna链的5’-p末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的dna链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌dna连接酶、t4dna连接酶、tscdna连接酶、真核生物细胞辨认出的连接酶，例如酶ⅰ、酶ⅱ、酶ⅲ等多种类型。
4.dna片段的相连接方法：①具互补黏性末端dna片段之间的连接：可用e?colidna连接酶，也可用t4dna连接酶。
②尼奥罗末端dna片段之间的相连接：就可以用t4dna连接酶，并且必须减少酶的用量。
③dna片段末端修饰后进行连接：dna片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；dna片段5′端脱磷酸化后进行连接；dna片段加连杆或衔接头后连接。
5.dna聚合酶：①定义：dna聚合酶就是指用dna单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化剂制备一条与模板链序列优势互补的dna新链的酶。
基因工程复习提纲
1.1 DNA重组技术的基本工具一、基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
概念分析①基因工程技术的原理：基因重组②目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
③操作水平：DNA分子水平④操作环境：体外⑤优点：克服远缘杂交不亲和障碍，定向改造生物性状从结构上分析，为什么不同生物的DNA能够重组?(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。
(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。
(3)生物界共用一套遗传密码。
二、基础理论和技术的发展催生了基因工程（一）基础理论的重大突破①DNA是遗传物质的证明 1944年，艾弗里等人通过不同类型肺炎双球菌的转化实验，不仅证明了生物的遗传物质是DNA，还证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体，艾弗里等人的工作可以说是基因工程的先导。
②DNA双螺旋结构和中心法则的确立1953年，沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。
1958年，梅赛尔松和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。
中心法则阐明了遗传信息流动的方向。
③遗传密码的破译人们认识到，自然界中从微生物到人类共用一套遗传密码，而且为基因的分离和合成等提供了理论依据。
（二）技术发明使基因工程的实施成为可能①基因转移载体的发现 1967年，罗思和赫林斯基发现细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移，这一发现为基因转移找到了一种运载工具②工具酶的发现科学家发现了多种限制酶、连接酶、逆转录酶，这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
③DNA合成和测序技术的发明④DNA体外重组的实现⑤重组DNA表达实验的成功 1973年，博耶和科恩选用仅含单一EcoRI酶切位点的载体质粒pSC101，使之与非洲爪蟾核糖体蛋白基因的DNA片段重组。
基因工程重点考点归纳
基因工程重点考点归纳1. 简述基因工程中的四大要素。
答：基因工程的四大要素是基因、工具酶、载体、宿主细胞。
2. 简述基因工程诞生的基础。
答：基因工程诞生的基础是理论上的三大发现和技术上的三大发明。
1971年，史密斯（Smith H. O.）等人从细菌中分离出的一种限制性酶,酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。
1972年伯格（Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体DNA，将两种DNA 分子用连接酶连接起来,得到新的DNA分子。
1973年，科恩（Cohen S.）等进一步将酶切DNA分子与质DNA 连接起来，并将重组质粒转入E.coli细胞中。
理论上的三大发现：（1）DNA是遗传物质（2）DNA双螺旋模型（Watson/Crick 1953）（3）确定了遗传信息传递的方式（60年代）技术上的三大发明：（1）工具酶的使用【Smith 和Wilcox(1970) 流感嗜血杆菌分离纯化了Hind II其它工具酶（如连接酶）等的发现分子剪刀和DNA缝合工具】（2）基因运载工具—DNA载体的使用(对质粒的认识）【细菌的致育因子—F因子Lederberg 1946抗药性因子(R) 大肠杆菌素因（Col）】（3）逆转录酶的使用【Baltimomore 和Temin (1970) 各自发现了逆转录酶】意义：丰富了“中心法则”、真核基因的制备成为可能、构建cDNA 文库成为可能。
第二章1.简述细菌的限制与修饰系统答：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制—修饰系统(R-M Restriction-modification system)。
R-M系统是细菌安内御外的积极措施。
根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少可分为四类。
2.II型限制性内切酶的特点答：II型限制性内切酶是同源二聚体，由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成。
识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割DNA，产生带3‘- 羟基和5’-磷酸基团的DNA 产物，需Mg2+，相应的修饰酶只需SAM 。
基因工程复习(含答案)
基因工程复习题一、名词解释: （10～20%）基因工程基因工程工具酶限制性内切酶限制性内切酶得Star活性PCR引物PCR扩增平台期DNA芯片基因组文库cDNA文库转化限制与修饰系统原位杂交: 将细胞或组织得核酸固定保持在原来得位置上, 然后用探针与之杂交得一种核酸分子杂交技术, 该方法可较好地反映目得基因在细胞或组织中得分布与表达变化。
粘性末端: 双链DNA被限制性内切酶切割后, 形成得两条链错开几个碱基, 而不就是平齐得末端。
Northern印迹杂交: 将RNA进行变性电泳后, 再转移到固相支持物上与探针杂交得一种核酸分子杂交技术, 可用于检测目得基因得转录水平。
转位: 一个或一组基因片段从基因组得一个位置转移到另一个位置得现象。
基因工程: 在体外, 用酶学方法将各种来源得DNA与载体DNA连接成为重组DNA, 继而通过转化与筛选得到含有目得基因得宿主细胞, 最后进行扩增得到大量相同重组DNA分子得过程称为基因工程, 又称基因克隆、DNA克隆与重组DNA等。
目得基因：基因工程中, 那些被感兴趣得、被选作研究对象得基因就叫作目得基因。
连接器: 人工合成得一段含有某些酶切位点寡核苷酸片段, 连接到目得基因得两端, 便于基因重组中得切割与连接。
转化: 受体细胞被导入外源DNA并使其生物性状发生改变得过程。
停滞效应: PCR中后期, 随着目得DNA扩展产物逐渐积累, 酶得催化反应趋于饱与, DNA扩增产物得增加减慢, 进入相对稳定状态, 即为停滞效应, 又称平台期。
逆转录PCR: 以mRNA为原始模板进行得PCR反应。
PCR: 即聚合酶链式反应。
在模板, 引物, 4种dNTP与耐热DNA聚合酶存在得条件下, 特异性地扩增位于两段已知序列之间得DNA区段地酶促合成反应。
α-互补（α-complementation）：指在M13噬菌体DNA或PUC质粒序列中, 插入了lac 启动子-操纵子基因序列以及编码β-半乳糖苷酶N-端145个氨基酸得核苷酸序列（又称α-肽）, 该序列不能产生有活性得β-半乳糖苷酶。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
一1.载体的功能1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供必要的条件2.基因工程学科建立的理论和技术发明1.三大理论：DNA是遗传物质、1953年提出DNA的双螺旋结构、提出中心法则和遗传密码2.三大技术：工具酶的发现、载体的发现、逆转录酶的发现3.质粒的特点质粒是一类存在于细菌和真菌细胞中能独立于染色体DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子，也称cccDNA.通常在1~100范围内。
自主复制性、可扩增性、可转移性、不相容性4.描述PBR322质粒筛选过程PBR322质粒有两个标记基因，氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。
若在康四环素抗性基因上插入外源DNA,则1.先将转化液涂布在含有氨苄青霉素的平板上，未长的菌落是未导入质粒的菌落2.再将上述平板上存活的菌落影印到含有四环素平板上，在四环素上不长但在氨苄青霉素上长的转化子即为重组子。
5.简述PUC系列质粒筛选重组子的过程PUC是在PBR322质粒上改造的若在lacZ’标记基因上插入外源DNA，则将转化液涂布在含有Amp的平板上，蓝色菌落为非重组子，白色菌落为重组子，没长的未导入质粒。
6.基因工程操作的基本流程1.离：从供体细胞中分离出基因组DNA2.切、连：用限制性核酸内切酶分别将外源DNA和载体分开,用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，构成重组DNA分子3.转、增：将重组DNA导入受体细胞，段时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中4.筛：筛选经转化处理的细胞，获得外源基因高效稳定的基因工程菌或细胞5.表达：筛选好的菌或细胞导入到受体中使其高效稳定表达7.为什么说逆转录酶的发现对基因工程学科的建立至关重要1.对分子生物学的中心法则进行修正和补充2.使真核基因的制备成为可能可将mRNA反转录形成DNA用于获得目的基因3.在致癌病毒的研究中发现癌基因，为肿瘤发病机理的研究提供有价值线索8.蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。
野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝，可使整个菌落产生蓝色变化。
人工插入外源基因后突变型大肠杆菌的β-半乳糖苷酶被插入的外源基因切断，无法形成完整的β-半乳糖苷酶，故不能对无色化合物X-gal进行切割，菌落呈白色。
9.噬菌体载体与质粒相比的优点是什么1.感染效率更高2.扩增速度快，复制量大3.插入容量大4.筛选更简单10.描述碱变性法提取质粒的原理和过程原理：大肠杆菌裂解后有两种DNA为染色体DNA和质粒DNA，将细胞裂解后的溶液中加入强碱调pH至12.0，两种DNA均变性，再加入高盐溶液如KAc将pH调至中性，此时，染色体DNA生成白色絮状沉淀，而质粒DNA很快复性。
过程：1.酶或机械法等破坏细胞，释放出胞内物质2.加碱使DNA与蛋白质变性，加中和液复性3.在上清液中通过酚-氯仿抽提，去垢剂或酶使剩余蛋白质变性或水解，除去蛋白质4.加入醇溶液使质粒DNA变性沉淀而与其他水溶性物质分离5.将沉淀溶解于有RNase的TE溶液中，温浴降解RNA后电泳检测，-20℃保存。
11.三种提取质粒方法的特点和应用1.碱变性法：提取量可大可小，纯度相对较高，大部分实验可用2.沸水浴法：提取快速，纯度不高，提取量小，可用于快速筛选3.离心法：纯度非常高，提取时间长，操作复杂，主要用于基因治疗12.基因工程学科的局限性1.生态上，基因不受控制的扩散，如植物花粉传播使杂草获得抗虫抗除草基因2.转基因食物随人体肠道菌群排泄到水体，从而进入生态链，造成基因污染3.可能造成人种的基因歧视二1.酶切反应如何终止？1)将反应液在65℃下加热5—10分钟；2)向反应液中加入EDTA（螯合激活剂Mg2+）。
2.影响DNA连接反应的因素有哪些？最重要的是哪一点？1)DNA连接酶的酶量：黏性末端一般为0.1U，平末端一般为1U；2)连接时间：5分钟至过夜；3)反应温度：4—16℃；4)插入DNA与载体DNA的分子摩尔比，最佳比为3:1（最重要的一点）3.对于平末端，如何进行更好的连接？1)末端同聚物加尾法：利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3‘端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏性末端，外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸，如dA(dG)和dT(dC)，然后在DNA连接酶作用下连接成为重组的DNA。
2)衔接物连接法：先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成黏性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。
4.简述碱性磷酸酶的作用。
碱性磷酸酶可将5‘磷酸转化为5‘-OH，从而防止DNA自连，提高DNA连接效率。
5.介绍两种制备探针的方法。
1）切口平移法制备DNA 探针的过程:①使用DNA 酶Ⅰ在DNA 双链上随机切开若干切口,切口处分别形成3′和5′末端。
②利用DNA 聚合酶Ⅰ的5′→3′核酸外切活性,在切口处按5′→3′方向切除单核苷酸;同时利用DNA 聚合酶Ⅰ的5′→3′的聚合酶活性,在切口处3′端加入底物中的单核苷酸,使脱氧核苷酸链得以延伸。
③随着反应的进行,切口不断按5′→3′的方向移动,底物中被标记的单核苷酸被掺入到DNA 链中,直至被标记的DNA 片段两条链的3′端时完成标记。
2）末端标记法：（三种：3‘末端标记法、5‘末端标记法、T4聚合酶替代法，这里讲的是3‘末端标记法）利用Klenow片段填补由限制酶消解DNA所产生的凹陷末端，通过末端脱氧核糖核苷酸转移酶催化标记的dNTP加到3‘末端上。
6.什么是末端转移酶？其作用是什么？定义：一种能够将脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）加到某DNA片段上3‘-OH上的不需要模板的DNA聚合酶。
作用：可在DNA3‘末端添加特定的核苷酸，在人工黏性末端的构建中极有用处。
特点：无需模板的DNA聚合酶、具有5’至3’端的DNA聚合活性7.什么是限制与修饰作用，描述过程。
原核细胞为了保护自己，选择性的降解外源DNA，并保护个体免疫于外来DNA侵入系统。
主要由限制性内切酶和甲基化酶组成的二元系统。
8.影响限制性核酸内切酶的影响因素。
酶的纯度、酶切反应的温度与时间、DNA样品的纯度、DNA分子的构型、DNA甲基化的程度、限制性核酸内切酶的反应缓冲液。
9.三种限制性核酸内切酶的特点。
Ⅰ型：能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。
Ⅱ型：能识别专一的核苷酸顺序，并在改顺序内的固定位置上切割双链，识别顺序是一个回文对称顺序。
Ⅲ型：有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。
10.Klenow酶的定义活性及作用定义：Klenow酶是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ端的大片段活性：5’~3’的聚合活性，3’~5’的外切教正功能。
用途：修复由内切酶造成的3’凹断，使之成为平末端、催化cDNA第二条链的合成、用于双脱氧末端终止法测定DNA的序列。
11.逆转录酶有哪些酶活性RNA指导的DNA聚合酶活性、RNase H活性（水解DNA）、DNA指导的DNA聚合酶活性12.S1核酸酶是一种高度单链特异的核酸内切酶，酸性条件下，由Zn2+激活、降解单链DNA或RNA、降解反应方式为内切或外切，酶量过大时会伴有双核苷酸的降解作用：切平突出的单链末端三1.核酸提取的注意点（提取通则）1)冰上操作，可降低酶活性，防止核酸被降解；2)操作尽可能快速；3)操作时要温柔，如不能用振荡器来振荡核酸，否则核酸容易断裂；4)防止酶的降解，尤其是RNA,因为RNA酶多，且多数耐高温，耐酸碱不易失活。
2.为什么RNA提取比DNA更困难？1)RNA比DNA易被降解：RNase（核糖核酸酶）是非常稳定的酶，能够耐受高温高压，很难除去，DNase（脱氧核糖核酸酶）高温下易失活，因此RNA比DNA更容易因为污染了酶而被酶降解；2)RNA在弱碱性条件下更容易分解，酸碱性耐受性差；3)从结构来说，RNA更容易分解的机理是：在2‘位置上有游离的-OH，以致形成2‘,3’-环形磷酸盐的中间产物，分解需要更低的自由能，因此易分解。
3.核酸提取之后，如何确定产量和浓度？1)测核酸的OD260的值，若OD260=1，则代表有50μg/μL的DNA，40μg/μL的RNA；2)测OD260/ OD280的值，DNA在1.6—1.8，RNA在1.8—2.0，若比值小，则表明蛋白质超标。
4.凝胶电泳分离核酸的原理。
将凝胶置电场中，在中性pH值下带电荷的核酸通过凝胶网孔向阳极迁移，迁移速率受到核酸的分子大小、构象、琼脂糖浓度、所加电压、电场、电泳缓冲液、嵌入染料的量等因素影响。
在不同条件下电泳适当时间后，大小、构象不同的核酸片段将处在凝胶不同位置上，从而达到分离的目的。
琼脂糖凝胶的分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可分离长度为200bp至50kb的DNA。
5.化学合成的三种策略。
1)小片段粘接法：将待合成的目的基因分成若干小片段，每段长12-15bp（碱基长度），两条互补链分别设计成交错覆盖的两套小片段，然后通过化学方法合成，并退火形成双链DNA大片段。
2)中片段法（补丁延长法）：将目的基因的一条链分成若干40-50bp大小的片段，另一条链设计成与上述大片段交错互补的小片段（约20bp的补丁）。
两组不同大小的DNA单链片段退火后，用klenow酶将空缺部分补齐，最后用T4-DNA连接酶修复缺口。
3)大片段酶促法：将目的基因两条链均分成40-50bp的单链DNA片段，分别进行化学合成，然后用klenow酶和T4-DNA连接酶补平。
6.化学合成法的特点和用途。
特点：优点—反应快，操作简单；缺点—价格昂贵，大部分情况下仅限于小片段的合成。
用途：合成PCR所需的引物；合成探针；合成接头；可合成新的人造基因。
7.什么是平台效应？在PCR扩增反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，引物、模板、聚合酶达到一定比值时，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，也叫平台效应。
原因：产物量增多、dNTP消耗殆尽、酶活趋于平稳。
8.PCR的五要素。
模板、引物、Taq酶、dNTP（4种）、Mg2+浓度。
9.PCR用途：（1）基因分离、克隆（2）扩增DNA靶序列并测序（3）DNA靶序列的突变分析（4）衡量DNA样品检测与分析。
四1.引物设计的原则（1）引物长度控制在15-30bp（2）引物要是一对有相同的或相近的GC含量（3）设计出的引物最好不要有其他的结合位点（4）上下两条引物最好不要有互补区域（5）引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个碱基，保证引物能够被切割2.PCR没有获得目的产物或得到杂产物的原因（1）没有获得目的产物原因：1.Taq酶少；2.退火温度过高；3.dNTP太少；Mgcl2太少；5.循环次数太少；6.模板太少或不纯；解决方案：1.多加Taq酶、dNTP、Mgcl2、模板；2.降低退火温度；3.纯化模板；4.增加循环次数（2）得到杂产物原因：1.循环次数过多；2.酶太多；3.退火温度过低；4.模板、Mgcl2、dNTP过多；5.引物设计不合理解决方案：1.增加循环次数；2.减少酶量、模板、Mgcl2、dNTP；3.升高退火温度；4.重新设计引物；5.增加延伸时间（3）若上述解决方案都无法在奏效，可采用热启动PCR技术，有三种方案：a.在PCR体系中先不加入酶，当温度达到94℃时，再添加酶进行PCR反应；b.将酶用石蜡珠包裹（或在反应液上部铺一层融化的石蜡，待其凝固后加酶），直到石蜡融化后再进入反应液中；c.使用热启动DNA聚合酶，在酶上作抗体封闭，或化学修饰，使其在94℃时才具有活性（原理：阻止温度升高到变性温度前的PCR反应的发生）3.做PCR实验时为什么要做对照实验（1）检查PCR试剂，PCR扩增产物是否污染（2）在医学检测方面，可检测PCR检查结果的正确性，以防出现错误的诊断4.介绍实时定量PCR实时定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法，由于在PCR扩增的指数时期，模板的C t值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依技术原理：将标记有荧光素的Taq man探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵循聚合酶链式反应规律，与模板DNA互补配对的Taq man探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得C t值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测样本的目的基因的拷贝数5.热启动PCR定义：PCR中，先将模板同引物在高于两者变性温度下处理一段时间，然后再加入酶和其他组分进行扩增的方式。