自然对流型PCR芯片的热分析与设计

PCR引物设计

PCR引物的优化设计聚合酶链反应( polymerase chain reaction,PCR)通过多循环的变性、退火和延伸过程，能够在时间内获得大量目的DNA片段，称为一种无细胞分子克隆技术，已经成为短生命科学实验室获取目的DNA片段的常规方法。

聚合酶链反应( polymerase chain reaction,PCR)是用于在体外酶促扩增特定DNA片段的快速方法。

像分子克隆技术一样，PCR方法使得许多以前不可能的实验得以完成，PCR的应用似乎是无止境的，并正在不断地扩展，其中包括从基因组DNA和cDNA直接克隆目的基因，体外诱变和DNA工程，对法医样品进行的遗传指纹鉴定，传染病原的分析，遗传疾病的产前诊断，基因的等位序列变异分析，RNA转录物结构的分析，基因组足迹分析以及对基因组DNA和cDNA进行直接核苷酸序列测定。

同时相关的技术也突飞猛进地发展。

PCR方法的广泛应用及其相关的技术的顺利进行均离不开PCR引物的合理设计。

可以说，PCR引物的合理设计是任何PCR反应能否进行及其产物的特异性、产率高低的关键。

目前许多计算机软件可用于引物的设计，但由于各种计算机软件自身存在的局限性，其设计的引物并无法满足实验者不同需要。

目前最常用的是计算机辅助设计，即实验者根据PCR引物设计的原则并结合自己的经验人工设计引物，然后选择合适的软件分析引物的合理性。

引物设计原则：2．1 原则PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的寡核昔酸片段，其中在扩增的DNA片断5’端的引物对应于有意链DNA序列，3’端的引物对应于无意链DNA 序列，使其能有效地扩增模板DNA序列。

因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。

要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。

同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。

若这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。

如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。

1.根据实验需要，确定需要扩增的DNA序列，并知道其CDS区序列（编码结构基因区,即从起始密码子区至终止密码子区）ncbi网站查询2. 选择所需的载体,确定合适的酶切位点。

PCR芯片中微腔室高度及加热器结构优化设计

Ｖｏ．Ｒ芯片中微腔室高度及加热器结构优化设计Ｃ
廖红华，廖宇，易金桥，徐建
（湖北民族学院信息工程学院，湖北恩施４５０）４００
摘要：ＰＲ扩增芯片中微加热器的传热及微腔（Ｎ对ＣＤＡ反应液腔）室的高度优化问题进行了有限元分析，通过ＡＳＳ软件模拟分析了单蛇形、蛇形以及双螺旋形等典型结构微加热器的温度场分布，ＮＹ双分析了不同腔室高度
ＰＲ芯片的温度场分布，Ｃ重点探讨了不同微加热器结构、不同布线规律对ＰＲ芯片微腔室温度分布均匀性的影响，ＣＰＲ芯片中ＤＡ反应液厚度与芯片上下表面温差的关系．ＣＮ仿真结果表明：匀加热器比非均匀加热器温度分布均均匀性更好；双螺旋形加热器较单蛇形与双蛇形加热器更能满足实际需要；ＮＤＡ反应液厚度与芯片上下表面温度差之间具有良好的线性关系．同时根据分析结果得到了所设计的具有电极均匀分布双螺旋微加热器的ＰＲ芯片微腔Ｃ
第２第４期７卷２００９年１２月
湖北民族学院学报（自然科学版）
ＪｕａｏｕｅＵｉｅｉｒａｏａｔｓＮｔａＳｉｃｄｉ）ｏｒｌｆｂｉｎｒｔｆｔｎｌｉ（ａｒｌｃｎｅＥｉｏｎＨｖｓｙｏＮｉｉｅｕｅｔｎ
—
ｈａｅｓｕｈａｉｇｅｓｒｅｔｅｄｕｌｅｐｎｉｅａｄｄｕｌｐｒ，ａｅａａｙｅｙＡＮＳｏ — ｅｔｒ，ｓｃｓｓｌｅｐｎｉ，ｏｂｅｓｒｅｔｎｏｂｅｓｉｎｎｎｌａｒｌｚｄｂｎＹＳｓｆｔ

热启动pcr原理

热启动pcr原理小伙伴们！今天咱们来聊一聊热启动PCR这个超级有趣的东西。

PCR，这名字听起来就很厉害的样子，全称是聚合酶链式反应。

这就像是在微观世界里搞一场大规模的复制粘贴活动。

而热启动PCR呢，那可是PCR里的“精致版”操作。

你可以把PCR想象成一个小小的生物工厂，里面的原料就是DNA模板、引物、dNTP（那些小小的核苷酸原料），还有很关键的聚合酶。

正常的PCR就像是开足马力直接开工的工厂，可热启动PCR不一样，它有个很独特的“热身”过程。

咱们先说说为什么要有这个热启动。

你看啊，在普通的PCR反应开始的时候，如果聚合酶一上来就特别活跃，就可能会出现一些小麻烦。

比如说，它可能会在引物还没和模板很好地结合的时候，就开始瞎忙活，制造出一些我们不想要的东西，就像一群小工人没等指挥安排好就乱动工，最后建出一些歪歪扭扭的小房子（也就是非特异性扩增产物）。

热启动PCR呢，就像是给这些小工人（聚合酶）先设了个小关卡。

在反应刚开始的时候，聚合酶是被抑制着的，就像小工人被暂时限制住行动一样。

这时候反应体系先慢慢升温，这个升温的过程就像是在给整个反应环境做热身操。

温度慢慢升高的时候，引物就开始寻找它们在DNA模板上的“小窝”，就像小钥匙在找锁眼一样。

这个过程可不能被打扰，而被抑制的聚合酶就乖乖地在旁边等着。

当温度达到一定程度，引物准确地找到了自己的位置，就像钥匙插进了锁眼，这时候抑制聚合酶的因素就消失了，聚合酶就像被解开了封印的小超人，一下子活力满满地开始工作啦。

它沿着引物开始把那些核苷酸原料一个个连接起来，就像盖房子的工人开始一块砖一块砖地往上垒。

这个热启动的过程就像是一场精心安排的表演。

先让舞台布置好（引物和模板结合），然后主角（聚合酶）再登场。

这样做最大的好处就是能够大大减少那些不想要的产物。

就好比我们要做漂亮的小蛋糕，热启动PCR就是先把模具（引物和模板结合的结构）准备好，然后再让做蛋糕的师傅（聚合酶）开始工作，这样做出来的蛋糕（扩增产物）就又好看又准确。

芯片级PCR仪温度模糊PID控制器设计与仿真

ｆｚｙｃｎｒｌｒｗｔｗｎｕｎｈｅｕｐｔｓｅｔｂｉｈｄＩｗｓｕｅｏｃｎｔｕｔｔｅｓｍｕａｉｎｍｏｅｆｍｉｒｃｉｅｅｕｚｏｔｌｉｔｏｉｐｔａｄｔｒｅｏｔｕｓｗａｓａｌｅ．ｔａｓｄｔｏｓｒｃｈｉｌｔｄｌｏｃｏｈｐｌｖｌｏｅｈｓｏ
ＰＤ控制算法很难解决温度快速切换与扰动抑制之间的矛盾、Ｉ结构简单性与系统鲁棒性之间的矛盾、静态与动态性能间的矛
盾。
（５）５℃ 和延伸区（２Ｃ，７￣）通过２～０次温度循环，可实现整０３便
个扩增过程 “Ｊ。其典型温度设定曲线如图１所示。
属度函数。其中温度偏差的模糊隶属函数如图４所示。
ｌ “Ｌ）ｅ
ＺＰＺ
ＰＳ
ＰＭ
ＰＢ
一
ｌ０ — ０ｏ８
－０４
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ｅ
一
４０
８０
１００
冒鼙玻璃盖片口皿疆［＝＝］ＤＳＰＭ臣圈
半导体制冷片函受强圜电风扇导热双面胶 — ＇Ａ乘性蛇形铜导线Ｗｆ／— ｆｆ
ｌｏｔｍＶｇｅｔｕｅｔｅｅａｕｅｏｅｓｏｔａｄａｈｅｅｔｅｐｅｉｅｃｎｒｆｔｍｐｒｔｒＳｍｕｔｅｕｌｈｓｌｏａｇｒｈ，ａｒａｙｒｄｃｅｔｍｐｒｔｒｖｒｈｏｎｃｉｖｈｒｃｓｏｔｌｏｅｅａｕ．ｉｌｎｏｓｔｉａｇ — ｉｎｌｅｈｏｅａｙ，ｒｔｍａｔｎｅｏｕｔｅｏｍａｃｈｎｔｅｃａｓｃＩｏｔｌａｇｒｈ，ｎｔｉｅｙｔｅｉ．ｉｈｈｓｓｒｇｒｒｂｓｒｒｎｅｔａｈｌｉａＰＤｃｎｒｏｔｍａｄｉｓａｏｒａｚｏｐｆｓｌｏｌｉｓｌｅ

生物芯片中PCR温控系统的研究

中仅含１个靶ＤＮＡ分子的样品．由于ＰＲ具有敏感性高、Ｃ特异性强、速、快简便等优点，已在病原微生物学
领域中显示出巨大的应用价值和广阔的发展前景．
１ＰＲ温控特性Ｃ
ＰＲ扩增ＤＣＮＡ的原理是先将含有所需扩增分析序列的靶ＤＮＡ双链经 “ 热变性 ” 理解开为两个寡聚处
２００６年５月
Ｍａｖ００．２６
文章编号：００１０
生物芯片中ＰＲ温控系统的研究Ｃ
王芳，吴慎山，雷兵，闫王旭
（南师范大学物理与信息工程学院，南新乡４３０）河河５０７
摘要ｉ酶链反应在温度控制系统（Ｃ聚合ＰＲ温控系统）中对反应时阃和集成化设计提出了严格的要求，因此
维普资讯 http:ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ/
第３４卷第２期
河南师范大学学报（自然科学版）
ＪｏｒａｌＨｅａｏｍａｉｅｓｔ（ｔｒｌｃｅｃ）ｕｎ０ｎｎＮｒｌＵｎｖｒｉｙＮａｕａｉｎｅＳ
Ｚ３４Ｎｏ２．．
列号的读取，系统的软件设计得以简化．时，使同在某个Ｄ１Ｂ０损坏时，换Ｓ８２更
中图分类号：Ｎ７Ｔ７１
文献标识码：Ａ
聚合酶链反应（ｏｙｒｈｉｅｃｉｐｌｍｅｓｃａｒａｔｎ简称ＰＲ）称无细胞分子克隆系统或特异性ＤＮＡ序列体外ｎｏＣ又引物定向酶促扩增法ｎ，可将极微量的靶ＤＮＡ特异地扩增上百万倍，能检测单分子ＤＮＡ或每１ｏ万个细胞

PCR实验室操作流程

PCR实验室操作流程PCR（聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction）是一种可以通过体外合成DNA的方法，也是现代生物技术中一项重要的分子生物学技术。

PCR技术的应用广泛，包括基因测序、基因突变检测、表达定量等。

下面是PCR实验室操作的一般流程。

1.设计引物：PCR实验的第一步是设计引物。

引物是用于扩增目标DNA片段的短链DNA序列。

两个引物分别对应目标序列的两端，其长度通常在18-24个碱基对之间。

引物的碱基序列必须与目标序列互补，以确保引物的结合和扩增特异性。

2. 制备PCR反应液：将PCR反应所需的试剂制备成PCR反应液。

PCR 反应液包括模板DNA、引物、聚合酶、反应缓冲液、dNTPs和Mg2+等。

聚合酶可以是常见的Taq聚合酶，也可以是其他高保真度的热稳定聚合酶。

反应缓冲液包含缓冲盐、pH调节剂和聚乙二醇等成分。

3.加热变性：PCR反应开始前，需要对DNA模板进行热变性，将其双链DNA解开成单链DNA，以供引物结合。

一般在95℃左右进行加热变性步骤，持续1-5分钟。

4.循环扩增：PCR实验主要包括循环扩增的步骤。

循环扩增主要分为三个步骤：变性、退火和延伸。

变性温度一般设置在94-98℃，可以使DNA双链变为单链；退火温度根据引物序列的特性来设计，一般设置在50-70℃之间，可以使引物与DNA模板序列结合；延伸温度一般为72℃，此温度下聚合酶能够合成新的DNA链。

5.PCR循环反复：PCR反应通常进行30-40个循环，每个循环包括变性、退火和延伸的三个步骤。

这样可以进行指数级扩增，生成大量目标DNA片段。

6. PCR产物检测：PCR反应结束后，可以通过凝胶电泳等方法对PCR产物进行检测。

将PCR产物与DNA分子量标记物一起电泳，可以通过与标准品比较得知扩增片段的大小。

也可以通过染色剂如SYBR Green等进行荧光定量，或者使用定量PCR方法定量扩增产物的数量。

7.结果分析和数据处理：根据PCR产物的结果进行数据分析和处理。

pcr熔解曲线原理

PCR熔解曲线（Melting curve analysis）是一种通过实时荧光定量PCR技术（qPCR）来检测和分析核酸的方法。

它的原理是在PCR反应完成后，通过逐渐增加温度的同时监测每一步的荧光信号来检测和分析扩增产物。

这个过程可以帮助我们了解产物的特异性、引物设计及扩增体系的性能。

PCR熔解曲线的基本方法是：在PCR热循环程序结束并获得扩增产物后，通过设置特殊的热循环程序，对PCR产物逐渐加热，同时监测体系荧光信号的变化。

通常加热的范围是65-95摄氏度。

体系中的双链DNA扩增产物会随着温度的升高而解链，双螺旋结构打开成单链，而结合在原来双链结构上的核酸嵌入式染料因失去结合位点而重新游离在体系中，导致体系荧光信号的衰减。

当DNA双链结构丢失一半时对应的温度即该DNA片段的熔解温度（Tm）。

通过熔解曲线分析，我们可以获知产物的特异性，进而了解引物设计及扩增体系的性能。

正常情况下，特异性扩增产物的熔解温度应在55-75摄氏度之间。

如果出现较高的熔解温度，可能是由于引物设计不合理或扩增体系中存在非特异性产物。

为了更好地识别和分析熔解曲线，荧光定量软件可自动对原始熔解曲线荧光信号进行处理，即荧光信号的变化率对温度求导，将熔解曲线图转化为熔解峰图。

峰顶在横坐标上对应的温度即为Tm值。

峰高与扩增产物的量呈正相关，峰宽可提示发生解链的温度范围。

通过熔解曲线分析，我们可以更准确地评估PCR反应的特异性和引物设计的效果。

PCR技术的原理及操作

PCR技术的优点与缺点
1 优点
PCR技术可以在非常短的时间内扩增出大量目的DNA，其灵敏度高，特异性强。
2 缺点
PCR技术的一大缺点是可能会出现PCR抑制现象，同时PCR为幂函数反应，轻微变化都可能对最终结果产生影响。
3 局限性
PCR技术在特定情况下可能会出现假阳性或假阴性的偏差。
PCR技术的意义与前景
PCR反应需要进行精确而稳定的温度控制，部分PCR反应需要特殊的温度梯度。
2 引物控制
PCR反应是否成功，很大程度上取决于引物的设计和控制，包括质量和浓度等。
3 体系控制
PCR反应体系的选择和准备对于PCR反应的控制也具有重要作用。
PCR反应的检测
凝胶电泳分析
将PCR反应产物注入凝胶条后，通过电泳的形式在凝胶条上分离分子，并以荧光探针的方式检测PCR产物。
3 PCR整体富集技术
4 相似序列PCR
从混合样品中获取特定种群或物种的DNA。
利用PCR和限制片段长度多态性分析方法，针对多个相似序列特异扩增出特异片段。
引物的设计
引物长度
通常需要16-24 bp长度。
引物设计
基本的引物设计规则包括GC 含量、碱基配对和长度。
引物检查
在引物设计后需要进行引物交叉杂交、DNA序列特异性等检查。
3 优点
数字PCR相对于传统方法具有更高的检测灵敏度、更好的定量精度和更高的可重复性。
高通量PCR技术
原理
高通量PCR通过并行管道、抑制杂乱、自动可扩展等多种方式以实现对PCR反应体系高效率、高精度的操作与控制。
应用领域
包括基因芯片分析、生物信息学分析、蛋白表达、基因转录和全基因组测序等方面。