石蜡包埋切片方法
实验六 石蜡切片法1
四、实验结果
包埋后的石蜡快应为均匀的半透明状，蜡块中没有 气泡。
包埋材料摆放的位置是否符合要求？
修块效果：每个蜡边与材料平行，蜡边的上下左右摇 平行。
切片效果：得到厚薄均匀的蜡带，蜡带无破损。 展片效果：展片后蜡带或蜡片平整，无气泡、粘附牢 固，蜡带略呈透明状，后续制片不易脱落。
五、作业
实验完毕，每人交包埋块一个，在纸盒上写
上材料名称及自己的姓名和日期；
实验完毕，每人交玻片两张，用铅笔在载玻
片上写上材料名称及自己的姓名和日期；
实验报告（姓名和日期）。
苦味酸液（波茵氏液）
甲液： 1％铬酸 10％醋酸 乙液： 甲醛 苦味酸饱和水溶液 50ml 20ml 25ml 75ml
包埋过程中易出现的问题及解决办法
问题：包埋后的石蜡块应为均匀半透明状，有时出现白色浑浊 结晶（像雪花一样）部分，这样在切片时就有妨碍，不易切出 薄的切片。 原因：①组织内部或石蜡中混有透明剂；②脱水不干净；③石 蜡本身品质不良；④组织块移入纸盒时动作太慢，周围的石蜡 已成凝固状态；⑤冷却用水温度不够低，石蜡凝固太慢。 解决办法：属于前三个原因者应在包埋之前就须注意；属于后 二个原因者，可将包埋块再投入Ⅲ蜡中熔化后重新包埋，但必 须注意熔化包埋过的石蜡块的时间不宜过久。
实验六 石蜡切片法
—— 包埋、切片和贴片
石蜡切片法
石蜡切片法是显微制片技术中最常用的一种方法，除了
藻类、菌类、木材和骨骼外一般的材料均可以使用，既 可制成较薄的切片，使材料各部分都清晰可见，同时也
可制成连续切片，观察材料的动态发生及层次，所以，
它在显微制片技术中占有非常重要的地位，必须掌握， 同时也是进行透射电镜观察超薄切片的基础。
石蜡切片法透明透蜡包埋
附：植物材料的透蜡过程必须缓慢进行，所须的时间 约需1-2天。其方法如下：①将材料连同二甲苯一起倒 入小蜡杯中；②然后轻轻倒入溶解的石蜡。石蜡就在二 甲苯的上层凝固起来。此时可将小蜡杯放在35-37ºC温箱 内，使石蜡徐徐熔解到饱和为止，约需1-2天；③将蜡杯 移入56-60ºC温箱中，待石蜡熔解后，倒去含有二甲苯的 石蜡，以后每隔1小时左右更换已熔的纯蜡一次，共换纯 蜡2-3次即可进行包埋。
二、试剂与器Βιβλιοθήκη 1.试 剂：1/2 无水乙醇+1/2二甲苯、 二甲苯、 1/2二甲苯+1/2石蜡、 纯石蜡。 2.器 材：恒温箱、蜡杯、镊子、解剖针、 酒精灯、塑料面盆、温台。
三、实验程序
1．透明：透明也是渐次由低浓度至高浓度。材料先 在纯酒精和二甲苯各半的混合液浸15—30分钟，再转 入纯二甲苯中透明（至透明为止），一般15—30分钟。
五、思考题 1 .当材料周围出现白色雾状时，应退回纯酒精中重
新脱水。为什么？
3．包埋：从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋 用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯，用温镊子夹取材料 平放于纸盒底部，使之排列整齐。将纸盒两侧的把手提 起，慢慢地平放在面盆的水面，待石蜡的表面凝固，将 纸盒慢慢浸入水中，待石蜡完全凝固（约30分钟）后即 可取出备用。
四、注意事项
透明的注意事项 • 使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中水分进入； • 更换透明剂，动作要迅速； • 材料周围出现白色雾状，应退回纯酒精中重新脱水。 透蜡的注意事项 • 动物材料常用的石蜡熔点为52-56ºC；植物材料为54-60ºC。 • 透蜡温度要恒定，不可忽高忽低； 包埋的注意事项 • 包埋前应先把必需的用具（恒温箱、温台、纸盒）准备好。 • 包埋用的镊子要先放在温箱中预热。
组织石蜡包埋和切片技术
组织石蜡包埋和切片技术包埋剂embedding agent在制作切片或超薄切片时，由于组织是柔软的，或局部的软硬不均，这样制作厚薄均匀的切片是困难的。
所以有必要用一定物质浸透组织内部，整个组织一样硬化，以利于切成薄片，这种物质叫做包埋剂。
一股用光学显微镜观察的切片，用石蜡、火棉胶、炭蜡、明胶等作包埋剂；电子显微镜则用环氧树脂、聚苯乙烯树脂、异丁烯树脂及水溶性树脂。
石蜡制片法是将材料经固定、脱水、透明、浸蜡后包埋在石蜡里面进行切片的方法。
此法适用范围，制片手段完备，能将材料切成极薄的片子（可切至2-8微米左右），并能制成连续的片子，这是其它制片法难以达到的，因此在光学显微镜的制片技术上它是最常用的一种方法。
除了一些经不住石蜡切片法中所应用的各种药剂处理的材料不能应用石蜡切片以外，一般的材料都可以用此法制片，但有制作时间较长，操作过程复杂以及材料易发硬或发脆等缺点。
该法多采用旋转式切片机进行切片。
石蜡制片操作程序如下：（一）材料的采集与分割采集材料应根据制片的目的和要求而定，材料要有代表性，无病虫害或其它损伤，如要观察病理解剖，则要取病斑、病症部位。
采下的材料应立即放在标本箱或湿布包起来带回实验室进行分割固定（如有条件也可在试验地采集后进行分割固定）。
为使固定液能迅速的渗透材料，材料要进行分割。
分割时动作要迅速，以防材料萎蔫。
分割块的大小，宜小不宜大，一般不超过1cm3，分割后立即杀死固定。
（二）杀死与固定利用药剂迅速把细胞杀死，以保持材料本来的状态和结构。
常用的固定有F.A.A固定液、卡诺固定液等。
将固定液放在具塞小瓶中，投入材料，盖好瓶盖。
用F.A.A 固定液固定，时间至少24小时。
F.A.A固定液既是良好的固定剂，也是保存剂，因此材料可长期保存在固定液中备用。
卡诺固定液穿透力强，固定较小材料一般1~6小时即可，最多不超过24小时。
因卡诺固定液不能做保存剂，所以固定后要用95%、85%酒精浸洗，每级约20min.，然后保存在70%的酒精中备用。
石蜡切片步骤
石蜡切片基本步骤（一）取材和固定根据实验目的选择材料。
将整个虫体或虫体的内部器官（如肠道、马氏管、唾液腺等）取出后，立即投入固定液。
取材大小：0.5cm>0.5 cm迥.2或者1.0 cm X.0 cm迥.2，厚度不宜超过3mm。
固定液：2.5%的戊二醛固定液，Bouin 氏液，10%甲醛等。
固定时间：4oC 固定24 小时。
注意事项：取材：1．勿使组织块受挤压切取组织块所用刀、剪要锋利，切割时不可来回切割。
夹取组织时，镊子要轻，切勿挤压，以免损伤组织。
取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。
2. 选好组织块的切面应熟悉器官组织的组成，并根据观察目的来确定纵切或横切。
3．保持材料的清洁组织块上如有血液、污物、粘液、食物等，先用生理盐水冲洗干净，再入固定液。
4．切除（清除）不需要的部分特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉，以免影响以后的程序和观察。
固定：1．材料新鲜取出组织后须立即固定。
否则时间相隔过久，体积就要收缩变形或发生自溶现象。
2．抽气生物组织常有气体的存在，使材料不能沉入固定液中，抽气使得固定液有效渗入。
真空泵抽气或者用空针管抽气。
昆虫整体固定，固定前用解剖针刺数个小孔，以利用固定液渗透。
3．固定剂用量一般为组织体积的10~20倍。
勿使组织贴于瓶底或瓶壁，以免影响固定剂的渗入。
4．避免阳光尽可能避免接触阳光以免失去固定作用。
5．加速固定轻轻摇动盛器使组织移动有利于固定液渗入，对长期固定的标本可经常更换固定液。
（二）洗涤2.5%戊二醛固定液固定的组织：0.2M, pH7.2 磷酸缓冲液漂洗三次，每次10minBouin氏固定液固定的组织：直接入70%酒精更换数次即可脱水，注意苦味酸。
甲醛固定的组织：直接投入50%或70%酒精脱水，不经水洗。
但如果在甲醛中时间过长，则仍应当用流水冲洗。
陈旧性标本和混合性固定液应及时洗涤，有利于脱水、切片和染色。
否则会影响以后的染色效果。
石蜡包埋技术
石蜡包埋技术制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡，包埋前必须将组织内所含的水分脱去。
而大多数的组织固定剂是水溶液，随后的水冲洗也使其含有大量水分，因此必须先行脱水，一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。
由于酒精和石蜡不能混合，须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精，因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状，所以此步骤又称透明。
最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。
常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋，前一章中已述过固定。
第一节脱水脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。
此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。
一．常用的脱水剂1．酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比较强，又能硬化组织。
但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。
因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。
第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50％酒精开始。
如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70％酒精开始，再经80％，95％以至无水酒精。
但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。
经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。
用AAF固定液固定的组织可直接置于95％酒精开始脱水。
用醇性固定剂（如Carnoy）则可置于高浓度无水酒精内，但应多次换液以除酸。
一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。
但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。
《病理检验技术》课件——石蜡包埋组织切片
石蜡包埋组织切片
7.若天气太冷，切片时组织蜡片容易碎裂，对着组织蜡块面 呵一口气后进行切片，可改善组织蜡片容易碎裂的情况，但 所切出的第一、二张组织蜡片厚度会比原来设定的切片厚度 稍厚一些，因此，前一、二张切出的组织蜡片不要。
石蜡包埋组织切片
6.调节切片刀的切片角度：切片机刀座上都有标 示切片刀切片角度的刻度，切片前需调节切片刀 至合适的切片角度，才能切好片。通常切片机上 刀座刻度范围为0°～10°，一般设定切片刀的 角度在8°左右为宜。但真正的切片角度是余隙 角。 所谓余隙角是指切片刀下刀锋倾斜面与组织蜡块 面的夹角。余隙角避免了切片时切片刀往返过程 中刀与组织蜡块面之间的摩擦。最理想的余隙角 是2°～4°，太大或太小都不能切好片。
3.如用金属框包埋组织蜡块，必须把四边修整平行，否 则在切片时会切出弯曲的组织蜡片带。
4.切片用毛笔应选用松软毛的水彩画笔，清扫切片刀上 的蜡屑时应顺着刀背往刀锋扫，避免刀锋切割笔毛，损 坏刀锋。
石蜡包埋组织切片
5.切片时转动切片手轮或推拉切片刀的动作要轻， 用力均匀。若用力太猛和速度太快，将会引起切片 压缩，也易导致轮转式切片机齿轮的磨损。
病理检验技术
石蜡包埋组织切片
石蜡包埋组织切片
组织石蜡切片 石蜡包埋组织切片
石蜡包埋组织切片
送检组织经过固定、 脱水、透明、浸蜡和 石蜡包埋制成组织蜡 块后即可马上进行切 片，称石蜡包埋组织 切片，简称石蜡切片。
石蜡包埋组织切片
一、石蜡切片操作过程
1.组织蜡块排序、冷冻：按病理号排序，先切在 前；蜡块组织面朝下放在一盘平整的冰块或冷冻 台上冷冻（-4～0℃）几分种后开始切片。
石蜡包埋和冰冻包埋实验步骤
1.取材固定:离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散。
固定就是加入一些可以让蛋白质变性的物质(比如说甲醛)，使得蛋白质的结构被固定住，不再发生变化，同时也不会再发生一些活性反应，这样才好做后续的染色步骤。
常见固定液是4%的多聚甲醛和饱和苦味酸。
根据不同目的、组织特征代表性取材。
取的材料应该小而薄。
便于固定剂迅速渗入内部，一般厚度不超过2mm，大小不超过5X 5mm"。
每个组织最好多切几块。
新鲜组织固定(组织块不宜太大太厚，这样固定液很难进入里面，可能会导致在较短的时间内脱水不完全，引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。
导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败。
组织块也不能太小，否则不能保证切片数量，且透明时间和浸蜡时间不能很好的把握。
)固定时间因固定剂种类而异，大多6-12 小时，一般不超过12小时。
视组织固定的难易程度而定。
后续如果做免疫组化，不应超过12小时;后续如果做HE染色，不应超过24小时。
固定完之后用水洗(目的:洗去渗入组织的固定液，终止固定以免影响对组织的内结构的观察，分析。
换液两次，一次半小时。
) 之后可直接脱水包埋或放入75%的乙醇4度可长期保存。
2.脱水从75%的乙醇中取出，分别放到80%，90%，100%( I )的乙醇中30min，再放入100%乙醇中。
固定完直接水洗包埋的，应从70%乙醇开始，易碎组织从50%乙醇开始。
组织脱水时间不应过长，尤其是高浓度乙醇，要特别注意控制时间。
3.透明透明的目的是置换组织内的脱水剂，为下一步浸蜡起到桥梁作用，二甲苯可以去除脂肪。
乙醇+-二甲苯(1:1) 2h；二甲苯(I )，二甲苯(II)各10min(根据组织的大小和透明的难易程度不同，透明的时间可以根据具体情况调整。
颜色浅的组织表面油亮，可以透过光时效果较好，颜色较深的组织至少边缘可以透光。
)4.浸蜡浸蜡目的是置换组织中的透明剂，为包埋作准备。
二甲苯+石蜡(1:1)2h；石蜡(I)1h;石蜡(II)2h.(浸蜡的时间也可以长一些)5.包埋在冰盒上进行，将融好的纯蜡(最好提前4小时以上开始融蜡，新蜡更难融)，倒入蜡盒(可以浸没组织就行，大约蜡盒的三分之一)由于蜡盒底部与冰盒接触，底部的蜡会先凝固，这样就可以把组织用镊子夹住立在底部。
常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤
常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡，包埋前必须将组织内所含的水分脱去。
而大多数的组织固定剂是水溶液，随后的水冲洗也使其含有大量水分，因此必须先行脱水，一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。
由于酒精和石蜡不能混合，须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精，因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状，所以此步骤又称透明。
最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。
常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋，前一章中已述过固定。
第一节脱水脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。
此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。
一．常用的脱水剂1．酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比较强，又能硬化组织。
但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。
因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。
第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50％酒精开始。
如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70％酒精开始，再经80％，95％以至无水酒精。
但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。
经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。
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石蜡包埋组织样品制备方法
组织采集后，经固定、保存、石蜡包埋、切片、展片、烤片，方可进行HE 染色（或其它化学染料染色）及免疫抗体标记。
以下操作依据组织大小及致密程度而定
1、组织的采集、固定和保存：
可依据实验目的及组织的特点而考虑采用不同的固定和保存方法。
此处只介绍实验室常用方法。
采取组织后，4%多聚甲醛（4%PFA）4︒C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜，PBS缓冲液洗三次，每次10min至1小时，于30%、50%乙醇中各10 min至1小时，4︒C保存于70%乙醇中。
2、组织的包埋、切片、展片及保存：：
固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54︒C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10μm，贴于处理过的干净载玻片上，34︒C烤片过夜，之后收集于载片盒中，4︒C密封保存。
石蜡包埋：
保存于4︒C 70%乙醇中的组织样品
↓
80%乙醇 15 min
↓
95%乙醇 15 min
↓
100%乙醇 15min ⨯ 2
↓
1/2乙醇1/2二甲苯 15 min
↓
二甲苯透明 5-10 min
↓
1/2二甲苯1/2石蜡 30 min
↓
石蜡（1） 1.5hr
↓
石蜡（2） 1.5-2.5hr
↓
石蜡（3）包埋
↓
4︒C保存
3、石蜡组织切片的免疫标记：
切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水，即可进行免疫反应，操作步骤与冰冻组织切片的反应方法相同。
石蜡组织切片脱蜡、复水步骤：
密封保存于4︒C的组织切片
↓
二甲苯(1) 10 min
↓
二甲苯(2) 10 min
↓
二甲苯(3) 10 min
↓
1/2二甲苯1/2乙醇 15 min
↓
100%乙醇 5 min
↓
95%乙醇 5 min
↓
80%乙醇 5 min
↓
70%乙醇5 min
↓
50%乙醇 5 min
↓
30%乙醇 5 min
↓
d
2H
2
O 5 min
4、石蜡组织切片的HE染色：
切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水，于苏木精中室温染色5-20 min，迅速用水冲洗切片，至组织切片变蓝，镜检。
用0.1-0.5%盐酸乙醇分色1～2秒钟，
也可用50ml H
O中加一滴氨水分色，效果亦好（如染色程度恰好，也可省略分
2
色步骤）。
之后用流水冲洗切片，直至切片变蓝，此称蓝化。
切片经梯度乙醇至95%乙醇中，于0.5%伊红中染色1～5秒或更长时间，95%乙醇洗去残色，若颜色太深，可在低浓度的乙醇中脱色，镜检。
无水乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。
普通光镜观察，室温干燥条件下保存染色切片。
石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水
↓
苏木精室温5-10 min
↓
O 迅速冲洗
H
2
↓
0.1%盐酸乙醇 1-2 sec
↓
流水滴洗
↓
30%乙醇 1 min
↓
50%乙醇 1 min
↓
70%乙醇 1 min
↓
80%乙醇 1 min
↓
95%乙醇 1 min
↓
伊红A液 1min
↓
伊红B液 1-30sec
↓
无水乙醇 1 min
↓
无水乙醇 5min⨯ 2
↓
1/2乙醇1/2二甲苯 15 min
↓
二甲苯(1) 5min
↓
二甲苯(2) 5min
↓
二甲苯(3) 5min
↓
中性树胶封片，室温干燥保存参照图片。