登革热检测方法
登革热诊断与实验室检测
特异性
检测时机
登革热不同诊断方法的可操作性和可信性
直接检测
可操作性
间接检测
病毒分离 核酸检测 NS1检测
可信性
IgM检测
IgG检测
登革病毒结构
细胞间病毒(未成熟)
细胞外病毒(成熟)
包膜糖蛋白
前M
(双体) 基质蛋白
核衣壳蛋白 (C蛋白)
登革病毒基因组结构
结构蛋白
非结构蛋白
登革病毒分离
细胞
昆虫细胞: C6/36、AP61 哺乳动物细胞: Vero、BHK21
YF PRNT 80% 减少 DV抗体用捕获法化学发光
接种17D疫苗后黄热和登革抗体
登革病毒感染后的黄热和登革抗体
检测登革病毒IgM抗体的试剂比较
真核rEIII蛋白MacELISA法检测早期登革病人血清
OD Value
3.5
dengue virus patients sera
3.0
hantan virus patients sera
登革分型实时PCR
登革抗体检测方法
检测IgM MacELISA、免疫层析(ICT)
检测IgG 间接法ELISA、GacELISA、IFA、 免疫层析(ICT)
中和试验 特异性高，可以用于分型
登革病人血清和乙脑交叉反应
乙脑、黄热和登革热的抗体交叉反应
登革病人血清和乙脑交叉反应
黄热病毒中和抗体和登革病毒抗体
NS1为50kD的糖蛋白 以300kD的六聚体形式分泌到血液中
DHF患者血清中NS1明显升高 激活补体 血管内皮细胞功能不全 血管通透性增加
NS1抗原特点及其应用
一、分泌性表达，易于检测 二、出现早，发病或发病前即可检出 三、浓度高，可达50 ug/ml 四、持续时间长，初次感染可持续9-12天 五、大量临床应用验证 六、NS1抗体可能用于血清分型 七、再次感染不易检测，在发病5-7天后很少能检出 八、高浓度NS1患者发病较重 九、可检测蚊子中的NS1抗原，用于监测
登革热检测规程
登革热（一）登革病毒感染与机体免疫反应登革病毒感染后，潜伏期为3～14 天，通常 4～7 天，潜伏期内采集的患者标本尚不能检出登革病毒或相应的机体免疫反应。
发病后，病毒在血液中存在的时间（病毒血症期）约为7 天，病毒 NS1抗原在血液存在的时间略长。
发病后4～ 5 天内，可在病人的血清、血浆、白细胞、脑脊液和尸检组织标本中分离到病毒，病毒核酸及NS1抗原在这个时期的检出率高。
病人血液中抗体水平，因个体免疫状态不同而具有显著差异。
若以前没有感染过登革病毒或其他黄病毒，或接种过黄病毒疫苗（如：乙脑、黄热等），病人首次感染抗体免疫反应呈现为特异性抗体水平缓慢升高， IgM 抗体出现最早，随后出现的是IgA 和 IgG 抗体。
在发病后3～5 天的患者中IgM 抗体检出率约为50%，发病后第 5 天的患者中检出率约为80%，而在发病后第10 天患者中，约 99%的患者可检出。
IgM 抗体水平在发病后 2 周达高峰，然后逐步下降，可保持2～3 个月。
IgA 抗体出现略晚于IgM 抗体，可保持约45 天。
在发病一周后，可在血液标本中检出较低滴度的IgG 抗体，之后抗体滴度缓慢升高，可持续存在多月甚至终生。
如果病人属于再次感染登革病毒（登革病毒感染者以前曾感染过登革病毒，有时可能是曾接种其他黄病毒疫苗或感染过其他黄病毒），抗体滴度可快速升高并可和多种黄病毒产生反应。
主要为高水平的IgG 抗体，在急性期即可检出，可持续存在10 个月以上，甚至终生。
IgA 抗体也可在急性期标本中检出。
再次感染登革病毒的病人恢复期早期的IgM 抗体滴度明显低于首次感染，甚至无法检出，通过计算 IgM/IgG 抗体比例，可以区分首次或再次登革病毒感染。
IgA 抗体检测试剂在临床诊断中的应用尚处于评价阶段。
登革病毒 IgM/IgG 抗体检测规程【方法】胶体金法【预期用途】登革热（ Dengue Fever ）是一种由登革病毒引起的急性传染病，主要流行于热带和亚热带国家和地区。
登革热实验室检测指南.doc
附件2登革热实验室检测指南一、目的（一）及时发现、诊断病例。
（二）及时了解伊蚊媒介携带登革病毒状况。
（三）病毒分型和溯源。
（四）为登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策、措施提供科学依据。
二、检测对象（一）疑似和临床诊断病例（按照登革热诊断标准WS216-2008）。
（二）伊蚊成蚊和幼虫。
三、样本采集、保存和运输（一）临床标本采集用无菌真空干燥管，采集患者非抗凝血，及时分离血清，分装2份，保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，标记清楚后低温保存，其中1份用于现场实验室检测，1份用于上级预防控制机构复核（附件1，附表1）。
1.登革热临床诊断病例及疑似病例，每次采集血液标本5mL。
2.登革热临床诊断和疑似的住院病例（包括初筛阴性），应采集双份血液标本，入院当天和出院前1天各一份。
3.疫点首发病例，必要时应采集第二份血标本，距第一份血样采集日期间隔在7天以上。
（二）蚊媒标本采集疫点内采集的伊蚊成蚊及幼虫，分类鉴定后，填写媒介标本采集信息表，按照采集地点分装，每管10-20只。
（三）标本保存、运送标本应-70℃以下保存，血液标本可-20℃以下保存，但不超过1周。
标本运送时采用低温冷藏运输，避免冻融，样本运输应遵守国家相关生物安全规定。
四、检测内容（一）实验室检测登革热疑似病例发生所在地医院和/或县（市）疾控机构采集病例血清，检测登革病毒抗原、核酸或抗体，检测流程参见图1。
（二）复核检测1.送市或省级疾病预防控制机构的临床标本，抽样30%进行复核检测，疫点首发病例需采用病原学和/或双份标本血清学方法复核检测，暴发疫情复核检测不少于5例，疫情少于5例者应全部检测，病毒核酸阳性标本应分型检测。
2.疫点首发病例，重症病例、输入病例急性期标本应采用PCR方法进行分型检测，阳性者分离病毒，从临床标本或所分离病毒中扩增E蛋白编码基因，完成序列分析。
3.每次暴发疫情应开展病毒全基因组序列分析。
4.实验室检测阴性临床病例以及重症病例，应对恢复期血清进行IgM、IgG 抗体和/或中和抗体检测。
登革热实验室检测指南
登革热实验室检测指南一、目的（-）及时发现、诊断病例。
（二）及时了解伊蚊媒介携带登革病毒状况。
（三）病毒分型和溯源。
（四）为登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策、措施提供科学依据。
二、检测对象（-）疑似和临床诊断病例（按照登革热诊断标准WS216-2008） o（二）伊蚊成蚊和幼虫。
三、样本采集、保存和运输（-）临床标本采集用无菌真空干燥管，采集患者非抗凝血，及时分离血清，分装2份，保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，标记清楚后低温保存，其中1份用于现场实验室检测，1份用于上级预防控制机构复核（附件1,附表1） o1.登革热临床诊断病例及疑似病例，每次采集血液标本5mLo2.登革热临床诊断和疑似的住院病例（包括初筛阴性），应采集双份血液标本，入院当天和出院前1天各一份。
3.疫点首发病例，必要时应采集第二份血标本，距第一份血样采集日期间隔在7天以上。
（二）蚊媒标本采集疫点内采集的伊蚊成蚊及幼虫，分类鉴定后，填写媒介标本采集信息表，按照采集地点分装，每管10-20 Ro （三）标本保存、运送标本应-70°C以下保存，血液标本可-20°C以下保存，但不超过1周。
标本运送时采用低温冷藏运输，避免冻融，样本运输应遵守国家相关生物安全规定。
四、检测内容（-）实验室检测登革热疑似病例发生所在地医院和/或县（市）疾控机构采集病例血清，检测登革病毒抗原、核酸或抗体，检测流程参见图1。
（二）复核检测1.送市或省级疾病预防控制机构的临床标本，抽样30%进行复核检测，疫点首发病例需采用病原学和/或双份标本血清学方法复核检测，暴发疫情复核检测不少于5例，疫情少于5例者应全部检测，病毒核酸阳性标本应分型检测。
2.疫点首发病例，重症病例、输入病例急性期标本应采用PCR方法进行分型检测，阳性者分离病毒，从临床标本或所分离病毒中扩增E蛋白编码基因，完成序列分析。
3.每次暴发疫情应开展病毒全基因组序列分析。
登革热实验室检测指南
附件2登革热实验室检测指南一、目的（一）及时发现、诊断病例。
（二）及时了解伊蚊媒介携带登革病毒状况。
（三）病毒分型和溯源。
（四）为登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策、措施提供科学依据。
二、检测对象（一）疑似和临床诊断病例（按照登革热诊断标准WS216-2008）。
（二）伊蚊成蚊和幼虫。
三、样本采集、保存和运输（一）临床标本采集用无菌真空干燥管，采集患者非抗凝血，及时分离血清，分装2份，保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，标记清楚后低温保存，其中1份用于现场实验室检测，1份用于上级预防控制机构复核（附件1，附表1）。
1.登革热临床诊断病例及疑似病例，每次采集血液标本5mL。
2.登革热临床诊断和疑似的住院病例（包括初筛阴性），应采集双份血液标本，入院当天和出院前1天各一份。
3.疫点首发病例，必要时应采集第二份血标本，距第一份血样采集日期间隔在7天以上。
（二）蚊媒标本采集疫点内采集的伊蚊成蚊及幼虫，分类鉴定后，填写媒介标本采集信息表，按照采集地点分装，每管10-20只。
（三）标本保存、运送标本应-70℃以下保存，血液标本可-20℃以下保存，但不超过1周。
标本运送时采用低温冷藏运输，避免冻融，样本运输应遵守国家相关生物安全规定。
四、检测内容（一）实验室检测登革热疑似病例发生所在地医院和/或县（市）疾控机构采集病例血清，检测登革病毒抗原、核酸或抗体，检测流程参见图1。
（二）复核检测1.送市或省级疾病预防控制机构的临床标本，抽样30%进行复核检测，疫点首发病例需采用病原学和/或双份标本血清学方法复核检测，暴发疫情复核检测不少于5例，疫情少于5例者应全部检测，病毒核酸阳性标本应分型检测。
2.疫点首发病例，重症病例、输入病例急性期标本应采用PCR方法进行分型检测，阳性者分离病毒，从临床标本或所分离病毒中扩增E蛋白编码基因，完成序列分析。
3.每次暴发疫情应开展病毒全基因组序列分析。
4.实验室检测阴性临床病例以及重症病例，应对恢复期血清进行IgM、IgG 抗体和/或中和抗体检测。
登革热监测方案
登革热监测方案摘要：登革热是由登革热病毒引起的一种传染病，主要通过蚊子传播。
为了及时发现和控制登革热的传播，制定一套有效的监测方案至关重要。
本文旨在探讨登革热监测方案的设计和应用，包括监测指标、监测方法、监测频率以及监测结果的分析与处理等内容。
一、引言：登革热是一种病毒性疾病，全球范围内都存在。
随着全球化和旅游业的发展，登革热疫情的传播范围不断扩大，给全球公共卫生安全带来了威胁。
因此，及时有效的监测方案对于控制登革热的传播至关重要。
二、监测指标：登革热的监测指标主要包括疫情发生地区的病例数、病原体携带者数以及蚊子密度等。
其中，病例数是判断疫情是否存在和发展趋势的关键指标；病原体携带者数反映了登革热病毒在人群中的传播情况；蚊子密度是判断蚊子传播情况的重要指标。
三、监测方法：1. 病例监测：通过监测临床病例，及时了解疫情的发展趋势。
可以通过医院和社区的卫生系统进行监测，并建立病例报告制度，确保病例数据的及时上报和统计。
2. 病原体携带者监测：通过监测被蚊子叮咬的人群中携带登革热病毒的比例，了解病毒在人群中的传播情况。
这可以通过采集血样并进行实验室检测来实现。
3. 蚊子密度监测：通过蚊子捕捉装置和采集器具进行蚊子密度的监测。
可以设置监测点位并定期采集蚊子样本，通过统计蚊子数量和种类来了解蚊子密度的变化趋势。
四、监测频率：监测频率应根据疫情的不同阶段和监测指标的特点进行灵活调整。
通常情况下，监测频率可分为日常监测、定期监测和重点监测三种。
1. 日常监测：每天对病例数据、蚊子密度等进行监测，及时发现问题和异常情况。
2. 定期监测：每周或每月对病例数据和蚊子密度进行统计分析，了解登革热的传播趋势和变化情况。
3. 重点监测：在疫情高发地区或特殊时期，增加监测频率，密切关注疫情的发展情况，及时调整防控措施。
五、监测结果的分析与处理：监测结果的分析与处理应该根据监测指标的变化趋势和疫情的发展情况，采取相应的措施和调整策略。
登革热实验室检查结果
登革热实验室检查结果（实用版）目录1.登革热实验室检查的背景和重要性2.登革热实验室检查的具体内容和方法3.登革热实验室检查的结果及其意义4.登革热实验室检查的展望和建议正文一、登革热实验室检查的背景和重要性登革热是一种由登革热病毒引起的急性传染病，主要通过蚊子叮咬传播。
近年来，随着全球气候变暖，蚊子活动范围不断扩大，登革热疫情呈现出快速增长的趋势。
我国作为登革热的高发区之一，对登革热的防控工作具有重要意义。
实验室检查作为登革热诊断的重要手段，对于早期发现、早期诊断、早期治疗登革热具有重要作用。
二、登革热实验室检查的具体内容和方法登革热实验室检查主要包括病毒核酸检测、病毒分离培养、血清学检测等方法。
病毒核酸检测是目前最为常用的方法，其原理是通过检测病人血清或组织中登革热病毒的 RNA，从而确定是否感染了登革热病毒。
病毒分离培养是通过将病人血清或组织在实验室中培养，观察是否出现登革热病毒。
血清学检测则是通过检测病人血清中登革热病毒特异性抗体，判断病人是否感染过登革热病毒。
三、登革热实验室检查的结果及其意义根据实验室检查的结果，可以明确病人是否感染了登革热病毒，以及感染的病毒类型。
这对于病人的诊断和治疗具有重要意义。
此外，通过对实验室检查结果的分析，还可以了解登革热病毒的传播规律和疫情趋势，为制定针对性的防控措施提供科学依据。
四、登革热实验室检查的展望和建议随着科学技术的进步，登革热实验室检查方法将更加精确和便捷。
未来，应加强登革热实验室检查能力的建设，提高检查的准确性和时效性。
同时，加强对登革热实验室检查结果的分析和利用，为登革热防控工作提供有力支持。
登革热检测规程完整
登革病毒IgM/IgG 抗体检测规程【方法】胶体金法【预期用途】登革热（Dengue Fever ）是一种由登革病毒引起的急性传染病，主要流行于热带和亚热带国家和地区。
登革病毒为单股正链RNA 病毒，在分类学上属于黄病毒科，黄病毒属（flavivirus ）。
病毒核心为RNA 与蛋白质组成的20 面立体对称的病毒颗粒，外层为两种糖蛋白组成的包膜，包膜含有型和群特异性抗原。
病毒基因编码3个结构蛋白（核衣壳蛋白C,膜蛋白M,包膜蛋白E）和7个非结构蛋白（NS1,NS2a,NS2b,NS3,NS4a,NS4b,NS5 ）。
登革病毒感染可导致机体产生免疫应答，并产生病毒特异性的抗体。
初次感染者，发病后3－5天可在血液中检出病毒IgM 抗体，发病2周后达到高峰，可维持2－3个月，发病 1 周后可检出病毒IgG 抗体，IgG 抗体可维持数年甚至终生。
检测临床登革热症状的病人样本中登革病毒抗体，有助于登革热的辅助诊断。
【检验原理】采用胶体金免疫层析技术，在玻璃纤维上预包被胶体金标记的登革病毒抗原（Au-Dengue-Ag ）和羊IgG（Au-羊IgG）,在硝酸纤维素膜上IgG检测线，IgM检测线和对照线处分别包被鼠抗人IgG单克隆抗体，鼠抗人IgM 单克隆抗体和鼠抗羊IgG 单克隆抗体。
检测阳性标本时，样本中登革热病毒IgG 抗体（或IgM 抗体）与Au-Dengue-Ag 结合形成复合物，由于层析作用复合物沿纸条向前移动，经过IgG 检测线（或IgM 检测线）时与预包被的鼠抗人IgG 单抗（或鼠抗人IgM 单抗）形成“Au-Dengue-Ag －Dengue 病毒抗体－鼠抗人IgG 单抗（或鼠抗人IgM 单抗）－固相材料”夹心物而富集显色，胶体金标记羊IgG 则在对照线与鼠抗羊IgG 单克隆抗体结合富集显色，阴性标本则仅在对照线处显色。
【试剂组成成分】1，登革病毒IgM/IgG 抗体试剂检测线：鼠抗人IgM 抗体、鼠抗人IgG 抗体对照线：鼠抗羊IgG 抗体结合垫：胶体金标记登革病毒抗原和胶体金标记羊IgG2 ，梓品稀释液3 ，2uL 吸管【样本要求】1 ，检测样本为血清或血浆，避免溶血。
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附件1：免疫荧光法（IFA）检测IgG抗体试验材料：（1）DV1～4型抗原片：DV标准毒株感染C6/36或BHK21细胞制备，低温干燥保存；（2）对照：登革热患者恢复期血清（阳性对照），非登革热患者血清阴性对照）；（3）羊抗人（或兔抗人）IgG荧光素标记抗体；（4）常用稀释液：pH7.2～7.4PBS、伊文思兰等；（5）荧光显微镜。
检测步骤：（1）用pH7.4，0.02mol/LPBS稀释待检血清，从1：20开始做4倍连续稀释至需要的稀释度。
（2）取出抗原片，用蒸馏水漂洗后，冷风吹干。
（3）用加样器依次从高稀释度到低稀释度逐个加入已稀释的待检血清，加入量以覆盖细胞抗原面为准（若为双份血清，最好上排为急性期血清，下排为恢复期血清），在37℃水浴箱湿盒孵育30分钟（每次试验设阳、阴性对照）。
（4）用PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，再用蒸馏水洗涤1次脱盐，冷风吹干。
（5）用含1：3万的伊文思兰PBS按工作浓度稀释荧光结合物，滴加各孔（以覆盖细胞抗原面为准），在37℃水浴箱湿盒孵育30分钟，然后同（4）洗涤、漂洗、吹干。
（6）荧光显微镜观察结果。
结果判断：细胞内病毒特异性荧光为黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内。
根据特异性荧光颗粒多少、荧光亮度、阳性细胞在细胞总数中所占比例，可将免疫荧光反应大致区分为1～4个“＋”。
检测抗体滴度时，以能观察到明显特异性荧光反应（＞“＋”）最高血清稀释度的倒数表示。
意义：阳性结果，表明曾受到DV感染，＞1：80有诊断参考意义；恢复期血清抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍或4倍以上升高则可确诊。
附件2：酶联免疫吸附试验（ELISA）检测单份和/或双份血清IgG抗体试验材料：（1）抗原：阳性抗原：采用C6/36细胞感染登革病毒培养物为阳性抗原。
阴性抗原：未接种病毒的正常C6/36细胞为阴性抗原对照。
（2）辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体；（3）缓冲液：包被液：pH9.6碳酸缓冲液；稀释液：pH7.4PBS（含5%脱脂奶）洗涤液：pH7.4PBS－T（0.05％吐温－20）；（4）显色液：A/B液（5）终止液：4NH2SO4（6）酶标板、酶标仪。
检测步骤：（1）用包被液按工作浓度稀释抗原，100μl/孔，4℃过夜；（2）弃去包被液，用PBS-T重复洗涤3～5次，甩干；（3）将待检血清用稀释液从1：100开始作2或4倍连续稀释，加入抗原孔，100μl/孔，同时设阴、阳性对照，37℃水浴1小时；（4）弃去血清，用洗涤液洗涤5～6次；（5）加酶结合物，用稀释液按工作浓度稀释，100μl/孔，37℃水浴1小时；（6）弃去酶标抗体，用洗涤液洗涤6次，甩干；（7）加显色液：于各反应孔内加A/B液各一滴，37℃，避光3～5分钟；（8）加终止液于每反应孔，100μl/孔。
结果判断：于450nm（TMB）阳性对照孔OD值/阴性对照孔OD值，即P/N≥2.1，对照成立；若待检血清孔OD值与阴性对照孔OD比值≥2.1，则标本为登革热IgG抗体阳性，反之阴性。
（阴性对照孔OD值小于0.05按0.05记，若大于0.05按实际数值计算）意义：阳性结果，表明曾受到DV感染，＞1：100有诊断参考意义；恢复期血清抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍或4倍以上升高则可确诊。
附件3：IgM捕捉ELISA法（MacELISA）检测登革热IgM抗体试验材料：（1）抗原：阳性抗原：采用C6/36细胞感染登革病毒培养物为阳性抗原。
阴性抗原：未接种病毒的正常C6/36细胞为阴性抗原对照。
（2）抗人IgM（μ链）单克隆抗体或多克隆抗体；（3）登革病毒IgM阳性、阴性对照血清；（4）辣根过氧化物酶标记登革病毒单克隆抗体；（5）缓冲液：洗涤液：pH7.4PBS－T（0.05％吐温－20）；稀释液：pH7.4PBS（5％牛血清）；封闭液：pH9.6碳酸缓冲液（1％牛血清白蛋白）；（6）显色液：A/B液（7）终止液：4NH2SO4（8）酶标板、酶标仪。
检测步骤：（1）用稀释液按效价稀释抗人μ链单克隆抗体，100μl/孔，加盖，4℃过夜；（2）弃去抗人μ链，用洗涤液重复洗3次，甩干，加封闭液，100μl/孔，置37℃水浴孵育2小时；（3）弃封闭液，用洗涤液重复洗3次，甩干。
（4）将待检血清用稀释液从1：10开始作2或4倍连续稀释，加入酶标板孔中，100μl/孔，同时加入已1：10稀释的阳性血清、阴性血清对照各4孔，100μl/孔，置37℃水浴孵育2小时；（5）弃去血清，用洗涤液重复洗3次，甩干，分别加4个型DV抗原及阴性抗原对照，100μl/孔，4℃过夜；（6）弃抗原，用洗涤液重复洗3次，甩干，加用稀释液稀释至工作浓度的相应的登革热酶标单克隆抗体，正常抗原加4个型混合的酶标单克隆抗体，100μl/孔，37℃水浴2小时；（7）弃去标记物，用洗涤液重复洗3次，甩干，于各反应孔内加A/B液各一滴，37℃，避光3～5分钟；（8）加终止液于每反应孔，一滴/孔。
结果判断：（1）目测方法：阳性对照孔呈明显蓝色，阴性对照孔呈无色，对照成立；若待检血清孔呈明显淡蓝色或深蓝色（TMB），则标本为登革热IgM抗体阳性，反之阴性。
（2）酶联免疫检测仪检测：于450nm（TMB）阳性对照孔OD值/阴性对照孔OD值，即P/N≥2.1，对照成立；若待检血清孔OD值与阴性对照孔OD比值≥2.1，则标本为登革热IgM抗体阳性，反之阴性。
（阴性对照孔OD值小于0.05按0.05记，若大于0.05按实际数值计算）意义：阳性结果，表明患者新近DV感染，用于登革热早期诊断。
附件4：C6/36（或BHK21）细胞分离登革热病毒标本：（1）患者血清：无菌采集发病后5日内登革患者静脉血3ml，分离血清，接种细胞培养；不能及时接种细胞者可置-70℃保存。
污染的血清要加双抗（青霉素、链霉素，终浓度各1000U/ml），4℃2小时处理后接种细胞。
（2）尸检材料：脑、肝等。
（3）蚊：采集吸过血的伊蚊或其它可疑媒介蚊，用0.5mol/L（10％）葡萄糖液喂养，至胃血完全消化后置-70℃保存，死后按蚊种及捕获地点分组，5～10只/组，生理盐水冲洗数次后，用研磨器研碎，每组加0.5mlHank’s液，2000转/分钟离心15分钟，取上清加双抗（青霉素、链霉素，终浓度各1000U/ml），4℃过夜，备用。
病毒分离：将培养好的单层细胞上清弃掉，用Hank’s液洗涤2遍，接种用Hank’s液稀释成10-1的患者血清0.1ml或组织悬液或蚊悬液0.2ml。
C6/36细胞在28℃吸附1小时，BHK21细胞在37℃吸附1小时，补加维持液，C6/36细胞在28℃培养，BHK21细胞在37℃培养。
第二天开始观察细胞病变情况。
一般BHK21细胞4天左右出现病变，C6/36细胞需要在28℃培养7天。
如果没有细胞病变，则盲传3代（每次取细胞悬液0.1ml）接种细胞传代。
按附件6进行鉴定。
附件5：乳鼠分离登革热病毒标本：同附件4。
病毒分离：（1）每一检材接种一窝1～2日龄乳鼠，脑内接种0.01ml/只。
接种后48小时内死亡者按非特异性死亡处理，弃去。
（2）存活者观察10天，若仍未发病，则解剖其中2只，取脑，用pH8.0肉汤制成10％悬液，盲传一窝1～2日龄乳鼠，存活鼠和盲传鼠均观察到第4周，未发病为阴性结果；（3）在观察期内发病（活动力降低、站立不稳、肢体抽搐、不全麻痹等症状）者，解剖，取半边脑，按盲传法制成10％悬液，接种一窝1～2日龄乳鼠，并作无菌试验；另半边脑置5.43mol/L（50%）甘油缓冲液中低温保存。
无菌试验阴性而重复以上症状者作为可以毒种传代、保存，并按附件6进行鉴定。
附件6：免疫荧光法检测DV抗原材料：（1）细胞抗原片的制备：出现“＋＋”细胞病变的C6/36细胞或BHK21细胞倒去维持液（若盲传无细胞病变出现，仍然按此方法制备），用pH7.2PBS洗涤2次，加PBS用滴管把细胞从管壁上吹下，吹散，2000转/分钟离心5分钟，弃去PBS，沉渣用0.2mlPBS吹散，滴加在抗原片上，吹干，冷丙酮固定10分钟，PBS冲洗2次，蒸馏水漂洗1次，吹干，-20℃保存备用；（2）脑、肝组织片：冷冻切片机切片，吹干，冷丙酮固定10分钟，PBS冲洗2次，蒸馏水漂洗1次，吹干，-20℃保存备用；（3）荧光标记单克隆抗体；（4）荧光显微镜。
方法：（1）制备的抗原片或组织片，吹干，按顺序滴加4个型的荧光标记单克隆抗体，2孔/型，对照2孔（加PBS），置湿盒内37℃水浴30分钟；（2）取出，用PBS冲洗3次，蒸馏水漂洗1次，吹干；（3）荧光显微镜观察结果。
结果判断：特异性免疫荧光呈黄绿色颗粒，分布在胞浆中，正常组织细胞呈橙红色或暗红。
意义：从病人血清、组织或蚊媒中分离出DV或查到抗原，可确诊DV感染和病毒型别。
附件7：RT-PCR检测DV基因及分型材料：（1）附件6和分离的DV（2）引物：（供参考）┌──────┬─────────────┬───────┬─────┐│引物│序列（5’～3’）│靶序列（基因）│片段（bp）││││││├──────┼─────────────┼───────┼─────┤│1～4通用引物│＋）GTGCACACATTGACAGAACA │NS1 │539 │├──────┼─────────────┤││││—）CTTTCTATCCAATAACCCAT │││├──────┼─────────────┼───────┼─────┤│型特异性引物││││├──────┼─────────────┼───────┼─────┤│ DEN-1 │＋）GGACTGCGTATGGAGTTTTG │ E-NS1 │490 │├──────┼─────────────┤││││—）ATGGGTTGTGGCCTAATCAG │││├──────┼─────────────┼───────┼─────┤│ DEN-2 │＋）GTTCCTCTGCAAACACTCCA │ E │230 │├──────┼─────────────┤││││—）GTGTTATTTTGAGTTTCCTTG │││├──────┼─────────────┼───────┼─────┤│ DEN-3 │＋）GTGCTTACACAGCCCTGTTT │ E-NS1 │320 │├──────┼─────────────┤││││—）TCCATTCTCCCAATCTCCTG │││├──────┼─────────────┼───────┼─────┤│ DEN-4 │＋）CCATTATGGCTGTGTTGTTT │ NS2a-NS2b │398 │├──────┼─────────────┤││││—）CTTCATCCTGCTTCACTTCT │││└──────┴─────────────┴───────┴─────┘方法：（1）病毒RNA的提取：采用TRIzol按说明提取，制备模板RNA；（2）逆转录、合成cDNA：采用Super Scrip TMII或AMV逆转录酶，按说明书进行；（3）PCR扩增：反应条件为95℃预变性10分钟，94℃60秒、55℃60秒、72℃45秒、扩增30～35个循环，72℃延伸12分钟。