第六章 稳定性同位素示踪法
同位素示踪法和同位素标记法
同位素示踪法和同位素标记法
同位素示踪法和同位素标记法都是利用同位素在生物、化学、地球科学等领域中的应用手段。
同位素示踪法指的是通过在样品中添加含放射性同位素的化合物，通过对其衰变方式进行测量，从而追踪样品在化学反应、代谢等过程中的变化。
而同位素标记法是在样品中添加非放射性同位素作为标记，利用这些同位素的特性探究样品在不同反应中物质的行为。
同位素示踪法对于现代化学和生物领域有着非常重要的应用，特别是在生命科学的研究中起着至关重要的作用。
比如说，在病毒研究中，同位素示踪法可以帮助研究人员确定病毒在体内如何复制，从而有助于研发新的治疗方法。
在食品化学中，同位素示踪法也能够用于分析食物成分的代谢途径，从而实现对胰岛素敏感性的评估以及准确评估营养摄入量。
同位素标记法则多用于原子轨道探测及量子物理中，目前主要用于分子生物学、药物研发等领域。
在分子生物学中，同位素标记法可用于研究许多重要的生物学过程。
例如基因表达研究、细胞分裂、DNA修复等等。
在新药研发方面，同位素标记法可以协助科学家确定新型药物在体内耗散的运动方式，从而更加准确地评估其药效。
总的来说，同位素示踪法和同位素标记法具有广泛的应用，尤其是在生命科学、物理化学、地球科学等领域中。
这些技术的应用，不仅为科学家的研究提供了新的手段，也为人类的生活带来了更多的希望和机遇。
华中农业大学同位素示踪技术讲课提纲七
af = 1.37-0.37 = 1.0%
∴ Ndff = ap/af = 0.3/1.0 = 30%
Npf = Np×Ndff = 30Kg/亩×30% = 9Kg/亩
施入尿素量：W = 20/40% = 80Kg/亩
肥料N素利用率：R = Npf/Nf= 9/20 = 45%
①15N2还原法（Burris,1941）:充15N2密室进行
NdfA=a样/a气×100%
固氮量=NdfA×总N量 ②同位素稀释法（J、O、Legg等，1975），15N施入土壤
NdfA=1- a固/a非
③AN值法（M、Fried等，1975），田间种固N、非固N NdfA=(As + Afix - As) ×NdfF/Af As、Af、Afix分别代表土壤、肥料、大豆有效N量。 NdfF:来自肥料N素的比例。
Ndff = ap/af×100% （设N素来源于土壤
和肥料二方面） （3）
af：肥料N的原子百分超（或动物饲料N的原 子百分超，此时又多了一个动物排泄因素）。
上片解释见第五章第37片同位 素稀释法
4 、 植 物 从 土 壤 中 摄 取 N 的 % （ Percentage of in the plant tissue derived from
(2) 仪器的本底检查。
(3)离子峰的选择（14N和15N的峰比28N、29N小 10倍，选28N、29N、30N）。
(4) 仪器精确度检查（检查去O2后的空气或 纯N气）。
2.分析样品的制备：
(1) K氏法（Kjeidali） 质谱分析常用法。
A.样品的消化：（例：0.05g植样
+10ml 浓 H2S04+3.3gSe:CuSO4:K2SO4 为 1:10:100混合催化剂→样液清亮再消煮 5h （ 土 ） 或 2h( 植 ) ， 温 度 120-140℃ 。 样品予处理：水杨酸—硫酸法：5g干土 或0.5g植样+12ml水杨酸：硫酸为50g： 1000ml 溶 液 中 放 置 30min ， 再 加 2.5g 硫 代硫酸钠和15ml水，缓缓加热至停出起 泡→冷却→常规消化）。
同位素示踪法的应用
同位素示踪法的应用
同位素示踪技术是利用放射性同位素或经富集的稀有稳定核素作为示踪剂，研究各种物理、化学、生物、环境和材料等领域中科学问题的技术。
示踪剂是由示踪原子或分子组成的物质。
示踪原子（又称标记原子）是其核性质易于探测的原子。
含有示踪原子的化合物，称为标记化合物。
理论上，几乎所有的化合物都可被示踪原子标记。
一种原子被标记的化合物，称为单标记化合物，两种原子被标记的化合物，则称为双标记化合物。
自然界中组成每个元素的稳定核素和放射性核素大体具有相同的物理性质和化学性质，即放射性核素或稀有稳定核素的原子、分子及其化合物，与普通物质的相应原子、分子及其化合物具有相同的物理和化学性质。
因此，可利用放射性核素或经富集的稀有稳定核素来示踪待研究的客观世界及其过程变化。
通过放射性测量方法，可观察由放射性核素标记的物质的分布和变化情况，对经富集的稀有稳定核素或者可用质谱法直接测定，亦可用中子活化法加以测定。
同位素地球化学
16
4)重核裂变：重放射性同位素自发地分裂为2—3片原子量 大致相同的“碎片”，各以高速度向不同方向飞散，如238U， 235U，232Th都可以发生这种裂变。
在自然界中，有些同位素只需通过一次某种固定形式的衰 变，即可变成某种稳定同位素：
87 37
Rb
3887
Sr
但是，有些放射性同位素需经过一系列的各种衰变才能变
ΔR = R样品 - R标准
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3.同位素成分表示方法：
3）样品相对于标准样品R的偏离程度（千分率）： Δ(‰)=（R样—R标）/R标×1000 =(R样/R标—1) ×1000
例如对34S/32S相对于标准样品的富集程度， 即以 δ34S‰ 来表示： δ34S(‰)=[((34S/32S)样/(34S/32S)标)-1] ×1000
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(一)放射性衰变定律
放射性同位素的特性： ①放射性同位素在原子核内部发生衰变，其结果是从一 个核素转变为另一个核素； ②衰变是自发的、永久不息的一种恒制反应，而且衰变 是按一定比例的； ③衰变反应不受任何温度、压力、元素的存在形式及其 物理化学条件的影响； ④衰变前核素和衰变后核素的原子数，只是时间的函数。
习惯上把微量（较小相对丰度）同位素放在R的分子上，这样可以 从样品的δ值，直接看出微量同位素比标准样品是富集了，还是贫化 了。
δ＞0表示34S比标准样品是富集了； δ＜0表示34S比标准样品是贫化了。
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4）同位素标准样品
同位素分析资料要能够进行世界范围内的比较，就必须建立世界 性的标准样品。世界标准样品的条件：
6
(一) 核素的性质
(1)核素具有电荷：一个质子带有一个单位的正电荷，原子的核电荷数等于质 子数，并由此决定原子的核外电子数。核电荷数一旦改变就变成了另外一种元素， 同时核电荷数也影响着核的组成及结构，即决定核的稳定性。
稳定性同位素示踪法
700℃ CuO 、 CaO 使 用 前 用 700℃ 高 温 12烘 干 除 去 CO2 ， H2O ， 并 在 122 压力下制成棒状 , 备光谱 18Kg/cm 18Kg/cm 压力下制成棒状, 分析
通电予热仪器10分钟，打开光电倍增管高压 通电予热仪器10分钟，打开光电倍增管高压 10分钟
大气中的氮气
大气中的氧气
氮的同位素表
射线种类 β+ β+ ββ半衰期 0.011S 9.96m 7.1S 4.15S 99.635 0.365 自然丰度
同位素
12N
13N
14N
15N
16N
17N
1978年国际纯化学和化学联合会 年国际纯化学和化学联合会IUPAC的命名 年国际纯化学和化学联合会 的命名 法: 1. 结构式 15[N]HCl 结构式: 物质不存在) 物质不存在
4.“Y”型管及内部反应抽气须彻底 ， 型管及内部反应抽气须彻底， Y 型管及内部反应抽气须彻底 防其它气体干扰。 防其它气体干扰。
以下在光谱仪上进行, 以下在光谱仪上进行 , 可用液体样 品也可用干样品
(2).杜马法（Dumas） (2).杜马法（Dumas） 杜马法
—光谱分析中常用法 光谱分析中常用法
峰高。 峰高。
求得平均峰高，计算15N丰度。 求得平均峰高， 丰度。 平均峰高
15N实验结果计算 七．
14、15的质量比28、29、30的小10倍 的质量比28 的小10 14、15的质量比28、29、30的小10倍 不参加运算
15N丰度小于5%: 当 丰度小于5
质量为28离子流强度/质量为29 28离子流强度 R = 质量为28离子流强度/质量为29 子流强度
放电管装入燃烧室固定架上 放电管装入燃烧室固定架上。 装入燃烧室固定架上。
稳定性同位素
稳定性同位素示踪法
概述：
1、1912年，Thomson首发现稳定性核素20Ne 和22Ne（氖）。 2、1929年，Naude发现了15N。
3、1937年，Urey等首次报道人工生产15N的 方法。
4、1940年，先后获得具生物意义的15N、18O 和2H大量生产。
5. 1947年9月在美国Wisconsin大学召开了“同位素 在生物学和医学中应用”专题讨论会，从此开始 了稳定性核素示踪技术应用的新纪元。
(4) 仪器精确度检查（检查去O2后的空气或 纯N气）。
2.分析样品的制备：
(1) K氏法（Kjeidali） 质谱分析常用法。
A.样品的消化：（例：0.05g植样+10ml浓
H2S04+3.3g催化剂（Se:CuSO4:K2SO4为1:10:100） → 样 液 清 亮 再 消 煮 5h （ 土 ） 或 2h( 植 ) ， 温 度 120-140℃。
3.予测样品测定项目……
五、质谱和光谱测定15N原理
14N和15质量不同 质谱：把N2离子化为28N-N2，29N-N2 ，30N-N2 使其 在均匀磁场中发生不同角度偏转 光谱：28N-N2：谱线波长为2976.8埃
29N-N2：谱线波长为2982.9埃 30N-N2：谱线波长为2988.6埃
1800的均匀磁场
即某核素在该组同位素中浓度。
自然丰度（Natural abundaa） A自(AO)
15N：0.365%、18O:0.204%
原子百分超（Atom percent excess） a
a = A-A自 又称富集度（Enrichment）
富集15N（Enriched 15N） 贫化15N（Depeled 15N )
[讲解]同位素示踪法
![[讲解]同位素示踪法](https://img.taocdn.com/s3/m/8456fb66dd88d0d232d46aaa.png)
[讲解]同位素示踪法同位素示踪法同位素示踪法在高中生物学实验中的应用同位素示踪法是利用放射性核素作为示踪剂对研究对象进行标记的微量分析方法，即把放射性同位素的原子参到其他物质中去，让它们一起运动、迁移，再用放射性探测仪器进行追踪，就可知道放射性原子通过什么路径，运动到哪里了，是怎样分布的。
同位素示踪法是生物学实验中经常应用的一项重要方法，它可以研究细胞内的元素或化合物的来源、组成、分布和去向等，进而了解细胞的结构和功能、化学物质的变化、反应机理等。
用于示踪技术的放射性同位素一般是用于构成细胞化合物的重要元素，如3H、14C、15N、18O、32P、35S、131I等。
在高中生物学教材中有多处涉及到放射性同位素的应用，下面笔者对教材中的相关知识进行归纳如下:1 研究蛋白质或核酸合成的原料及过程把具有反射性的原子参到合成蛋白质或核酸的原料(氨基酸或核苷酸)中，让它们一起运动、迁移，再用放射性探测仪器进行追踪，就可知道放射性原子通过什么路径、运动到哪里以及分布如何。
2 研究分泌蛋白的合成和运输用3H标记亮氨酸，探究分泌性蛋白质在细胞中的合成、运输与分泌途径。
在一次性给予放射性标记的氨基酸的前提下，通过观察细胞中放射性物质在不同时间出现的位置，就可以明确地看出细胞器在分泌蛋白合成和运输中的作用。
例如，通过实验说明分泌蛋白在附着于内质网上的核糖体中合成之后，是按照内质网?高尔基体?细胞膜的方向运输的，从而证明了细胞内的各种生物膜在功能上是紧密联系的。
3 研究细胞的结构和功能用同位素标记氨基酸或核苷酸并引入细胞内，探测这些放射性标记出现在哪些结构中，从而推断该细胞的结构和功能。
4 探究光合作用中元素的转移利用放射性同位素18O、14C、3H作为示踪原子来研究光合作用过程中某些物质的变化过程，从而揭示光合作用的机理。
例如，美国的科学家鲁宾和卡门研究光合作用中释放的氧到底是来自于水，还是来自于二氧化碳。
他们用氧的同位素18O 分别标记H2O和CO2，使它们分别成为H218O和C18O2，然后进行两组光合作用实验:第一组向绿色植物提供H218O和CO2，第二组向同种绿色植物提供H2O和C18O2。
同位素示踪法 丝氨酸
同位素示踪法丝氨酸
同位素示踪法是一种科学研究方法，通过使用同位素标记物质，可以追踪其在生物体内的代谢和转化过程。
丝氨酸是一种氨基酸，它在蛋白质合成以及其他生物代谢过程中发挥重要作用。
同位素示踪法可以通过标记丝氨酸的同位素来研究生物体内丝氨酸的代谢路径和动态变化。
例如，通过使用氘（氢的同位素）标记丝氨酸，在饲料中加入氘标记的丝氨酸，可以追踪这些标记丝氨酸在生物体内的代谢过程。
科学家可以通过检测组织样本中标记丝氨酸的含量和其代谢产物，来了解丝氨酸在生物体内的利用、合成和分解过程，从而深入研究蛋白质合成、氨基酸代谢和相关生物学过程。
同位素示踪法对于生物体内复杂的代谢过程提供了一种精细的研究手段，能够帮助科学家更深入地理解生物体内的化学反应和代谢途径，对于生物医学研究、药理学研究以及生物化学等领域具有重要意义。
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注意事项：
1.同位素交换反应：在一定条件下，标记 的铵盐可与大气发生反应：
15NH+
15N丰度高时应注意。
4
14 水溶液 + NH
3
14 + → NH
4
15 水溶液 + NH
3
14 13 12 2. 同位素效应：藻类对 C 、 C 、 C 的吸
收依次递减。
3.予测样品测定项目……
15 五、质谱和光谱测定 N原理
意大利天然硼酸盐
C
12C
捷克扑利兹石灰石
13C
1.108
99.635 0.365 大气中的氮气
N
14N 15N
O
16O
17O 18O
99.759
0.0374 0.2039
大气中的氧气
氮的同位素表
同位素
12N 13N 14N 15N 16N 17N 18N
射线种类 β β β β β
+ +
半衰期 0.011S 9.96m 7.1S 4.15S 0.63S
2.N素在不同部位分布的不均匀性
3.分析测定技术所能达到的精度。
15N 示 踪 法 引 入 N 素 肥 料 的 丰 度 计 算
参考公式
af = Wp• Rp• ap/Nf• RN
式中： af：N素肥料的原子百分超 Wp：植物总重量（待测） ap：植物样品中原子百分超 Rp：植物样品中含N百分率
Nf：施纯N量 RN：N肥利用率
5. 1947年9月在美国Wisconsin大学召开了“同位素
在生物学和医学中应用”专题讨论会，从此开始
了稳定性核素示踪技术应用的新纪元。
6. 近20年，稳定性核素示踪技术迅速发展，分离分析方 法取得了较大突破，13C、2H、18O、15N广泛应用于生物 学、医学、环保、农药、农学、微生物等研究领域。我 国先后分离了25种元素的100多种稳定性核素，例如：
B.蒸馏：
用蒸汽蒸馏将消化液中 NH3 分离出来， 并测定总N。 方法：消化液中加过量40%NaOH,释放的NH3 被蒸汽逐出，经冷凝后被 2% 硼酸吸收，加 入混合指示剂用标准硫酸滴定（设置一个 标准液）。 此步骤将NH3-N转变成了NH4+-N（铵态N）， 仪器分析适宜量1mgN/样品2-3ml(浓缩或稀 释) 。
2.分析样品的制备：
(1) K氏法（Kjeidali）
质谱分析常用法。
A. 样品的消化： （例： 0.05g 植样
+10ml 浓 H2S04+3.3gSe:CuSO4:K2SO4 为 1:10:100 混合催化剂→样液清亮再消煮 5h （土）或 2h( 植 ) ，温度 120-140℃。 样品予处理：水杨酸 —硫酸法：5g干土 或 0.5g 植样 +12ml 水杨酸：硫酸为 50g ： 1000ml 溶液中放置 30min ，再加 2.5g 硫 代硫酸钠和15ml 水，缓缓加热至停出起 泡→冷却→常规消化）。
4.无衰变，实验时间不受限制。
5.可进行放射性示踪法难以进行的实验。
例：N素中T最长的13N：T=9.096m
三. 稳定性同位素分析法的基本流程
同位素引入生物体
动植物原始样品
仪器所需的待测样品 进样过程
质谱分析法
记录
光谱分析法
实验结果分析
四
15 .影响 N引入丰度的因素
15 1.实验材料对 N的稀释程度。
15N标记化合物就有30余
种。
几个概念
稳定性同位素（Stable isotope） 丰度（Abundance） A 即某核在该组同位素中浓度(通常指人工加浓 了 的 )。 自然丰度（Natural abundaa） A自(AO) 15N：0.365%、18O:0.204% 原子百分超（Atom percent excess） a a = A-A自 又称富集度（Enrichment） 富集15N（Enriched15N） 贫化15N（Depeled15N )
核素
14N
15N
A （ %）
质量数
99.635
0.365
14
15
注意：由于同位素之间的质量差异，因此 它们的物理、化学、生物化学等性质会有 所不同，进行实验时，需注意同位素效应。
二. 稳定性同位素示踪法的特点：
1.无放射性，无辐射效应及不良影响。 2.安全、对人无伤害。
3.无污染，不受环境条件限制。
14N和15质量不同
质谱：把 N2 离子化为 28N-N2 ， 29N-N2 在均匀磁场中发生不同角度偏转 2 光谱：28N-N2：谱线波长为2976.8埃
29N-N
30N-N
，
30N-N
2
使其
2：谱线波长为2982.9埃
2：谱线波长为2988.6埃
-
1800的均匀磁场
加 速 电 压
出口
入口
六.供仪器待测NH4
+-N转化为N
气 : 2
在真空条件下，将上述样品与次溴酸钠 反应，放出 N 气（在质谱仪内进行）详
见书15N章节。
制样时注意：
1.所有试剂纯度要高。 2.消化要完全。
3. 防止样品间交叉污染（每个样品 蒸馏前用蒸馏15ml乙醇洗器皿）。 4.“Y” 型管及内部反应抽气须彻底， 防其它气体干扰。
一.稳定性同位素示踪法的基本依据：
1.自然界中一种元素同位素组成是相对恒定
2.同一元素的同位素具有相同的化学性质
3.同一元素的同位素之间存在质量差异
重要化学元素的稳定性同位素
元素
H
同位素
1H 2 H(D)
自然丰度
99.985 0.0147
样品来源
新鲜的表面淡水
B
10B 11B
18.46
81.54 98.892
自然丰度
99.635 0.365
稳定性同位素标记物的命名
1978年国际纯化学和化学联合会IUPAC的命名 法: 1. 结构式: 15[N]HCl 物质不存在) 或15NHCl（这样純的
2. 单标记化合物: H215N-CO-NH2 15N-尿素， 15 例如 N的丰度可为5%，10%，15%…… 3. 双标记化合物(一个同位素): H215N-CO-15NH2 尿素 4. 混合标记化合物: 尿素 ( 15NH2)13CO (13C15N)
1.对待测样品的要求：
(1) 因为测量的是不同质量离子流的相对含 量，因此，保证有一定的 N 量即可。一般要求 含N量1mg/ml最少不低于0.5mg。 (2) 仪器的本底检查。 (3)离子峰的选择（14N和15N的峰比28N、29N小 10倍，选28N、29N、30N）。 (4) 仪器精确度检查（检查去 O2 后的空气或 纯N气）。