TIMP-3基因在肝细胞肝癌中的表达及其意义
肝癌相关锌指蛋白转录因子异常机制及其临床价值
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国最常见的恶性肿瘤之一。
HCC发生的主要病原学因素与慢性持续性乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）感染，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）及毒物摄入等密切相关[1-3]，为多基因参与、多阶段进展的肝细胞恶性转化。
其机制复杂，早期诊断难，治疗效果不理想，预后差[4-5]。
临床与基础的最新研究显示，锌指蛋白家族（zinc finger proteins，ZNFs）是人类基因组中最大的转录因子家族，是参与调控细胞分化、胚胎发育和多种疾病相关的功能性蛋白质[6]。
复杂的ZNFs及其多达18种的Krüppel-like转录因子（KLFs）异常与多种肿瘤进展[7]。
作为转录激活因子调控细胞周期和增殖分化，在肝细胞恶性转化或HCC进展中，已发现有多种ZNFs和至少7种KLFs 参与HCC细胞增殖、分化、侵袭和转移过程[8]。
本文综评了HCC进展密切相关ZNFs和KLFs研究的新肝癌相关锌指蛋白/转录因子异常机制及其临床价值赛文莉1，姚敏2，姚登福11.南通大学附属医院临床医学研究中心（南通226001）；2.南通大学医学院免疫学系（南通226001）【摘要】肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国常见恶性肿瘤之一，其发生发展机制复杂且尚未完全阐明。
锌指蛋白家族（zinc finger protein family，ZNFs）是人类基因组中最大的转录因子家族，越来越多临床和基础研究证据显示ZNFs 及其Krüppel-like转录因子（KLFs）在HCC发生、发展中异常表达，发挥促癌或抑癌作用，其中部分因子有望成为HCC的新标志物和治疗靶点。
本文述评了肝癌ZNFs/KLFs表达及其临床价值研究的新进展。
【关键词】锌指蛋白肝细胞癌调控机制肿瘤标志物【中图分类号】R575.1文献标志码A DOI：10.3969/j.issn.2096-3351.2021.06.001 Mechanism of liver cancer-associated zinc finger protein/transcription factordisorders and their clinical valueSAI Wen-li1，YAO Min2，YAO Deng-fu11.Research Center of Clinical Medicine，the Affiliated Hospital of Nantong University，Nantong226001，China；2. Department of Immunology，Medical School of Nantong University，Nantong226001，China【Abstract】Hepatocellular carcinoma(HCC)is one of the most common malignant tumors in China,with its mechanism of development and progression remaining to be fully elucidated.Zinc finger protein family(ZNFs)is the largest transcription factor family in human genome;more and more clinical and basic research evidences have shown that abnormal ZNFs/Krüppel-like factors(KLFs)expression was observed during the development and pro⁃gression of HCC,playing a cancer-promoting or-inhibiting role;some of the factors show promise for new tumor bio⁃markers or therapeutic targets for HCC.This article reviews the recent research advances in ZNFs/KLFs expression in HCC and their clinical value.【Key words】Zinc finger protein Hepatocellular carcinoma Regulatory mechanism Tumor biomarker基金项目：国家自然科学基金（81673241）；南通市科技项目（MS12019016，MS12020021）第一作者简介：赛文莉，硕士。
TIMP-3基因在肝细胞肝癌中的表达及其意义
常肝组 织中的 ＴＭＰ一 Ｉ ３蛋 白及 ＴＭＰ一 Ｒ Ａ的表达情况 ， Ｉ ３ｍ Ｎ 分析 ＴＭＰ一３基 因的表达与 Ｈ Ｃ临床病理参数的 关系。结果 ＴＭＰ一 Ｉ Ｃ Ｉ ３ 蛋 白明确 定位 于肝 细胞胞质 内。ＴＭ ３ｍ Ｎ Ｉ Ｐ一 Ｒ Ａ和 ＴＭ ３蛋 白在 Ｈ Ｃ中的表达量 分别为 明显低 于癌 旁肝 组织和正 常肝组 织 中的 Ｉ Ｐ一 Ｃ 表达量 ， 差异有统计学意义（ ０ ０ ） Ｐ＜ ． １ 。统计学分析显示 ， ＨＣ 在 Ｃ中 ＴＭＰ一３基 因的低表 达与肿 瘤分化程 度、 清 中甲胎蛋 白表达 水 Ｉ 血 平、 是否合并 Ｈ Ｖ 感染等有关（ ０ ０ ） 与患者性 别等 因素无 关。结论 Ｂ Ｐ＜ ． ５ ， 表 达有望成为 Ｈ Ｃ的重要 分子生物学指标。 Ｃ 【 关键 词】 肝癌 ； Ｐ Ｒ； Ｔ Ｍ ３ 免 疫组化 Ｃ Ｉ Ｐ一 ；
『］ ６ 汤苏阳． 封闭负压引流论术对慢性创面愈合基质的研究［ ］ Ｄ．
北 京 ： 警 总 医 院 ，０ ３６— ． 武 ２０ ： ７
各种复 杂创 面 ２ １例疗 效观 察 ［ ］ 中国煤炭 工业 医学杂志 ， Ｊ．
２ １ ，４ １ ：５— ６ ０ １１ （ ） ２ ２ ．
［］ ７ 贺翎 ， 萍． 米 负压封 闭 引流在烧 伤合 并四肢 骨折 治疗 中的应
ＴＩ Ｐ 一３ｇ ｎ ｅ ａ ｏ ｅｌｌｒｃ ｒｉ ｏ ｎ ｔ ｉｎｆ ａ ｃ Ｕ Ｎ Ｊｎ—ｋ ｉＺ Ｍ ｅ ｅｉ ｈ ｐ ｔｃ ｌ ａ ａ ｃｎ ｍａａ ｄｉ ｓｇ ｉｃ ｅＹ Ａ ｎ ｕ ｓ ｉｎ ｉ ａ ， ＨＵＢａ ｏ—ｈ ａ， Ｉ ｕ ｎ， ＡＮＧＫｕ Ｚ ＮＧ Ｇ ｏ— ｕ ＷＥ Ｊ ａ Ｗ ｎ， ＨＡ ｕ
线粒体E3泛素连接酶MARCH5表达上调促进肝癌生长
•424 •现代生物医学进展 Progress in Modern Biomedicine VoL21 NO*3 FEB»2021doi: 10.13241/ki.pmb.2021.03.005线粒体E3泛素连接酶MARCH5表达上调促进肝癌生长*耿西林1张静1李晖1杨宇宇2张煜1常虎林1A(1陕西省人民医院肝胆外科陕西西安7丨〇〇68;2通用环球西安西航医院外一科陕西西安710021)摘要目的：膜相关辞指蛋白MARCH5(membrane-associatedRING-C H5)是定位于线粒体外膜的E3泛素连接酶，在调控线粒体分裂融合相关蛋白的表达中发挥重要作用。
以往研究在多种肿瘤中证实了线粒体分裂融合的异常，但目前MARCH5在肝癌中的表达与生物学作用均不清楚。
本研究旨在探讨MARCH5在肝癌组织与细胞系中的表达及其在肿瘤生长中的调控作用。
方法：1).利用免疫组化实验检测62对肝癌癌与癌旁组织中MARCH5表达，以明确MARCH5在肝癌中的表达是否发生了异常改变。
2)_ 利用qRT-PCR与Western b lo t实验检测4株肝癌细胞（SNU-354、SNU-368、H LE与HLF)与1株正常肝细胞HL7702中MARCH5表达，进一步分析MARCH5在肝癌细胞系中的表达改变。
3).下调肝癌细胞中MARCH5表达后，利用E D U实验与克隆形成实验分析对肝癌细胞增殖与克隆形成能力的影响。
结果：1).MARCH5在肝癌组织中表达显著高于癌旁组织。
2).MARCH5 在4株肝癌细胞中的表达均显著高于正常肝细胞。
3).下调MARCH5表达可显著抑制肝癌细胞的增殖与克隆形成。
结论：MARCH5在肝癌中表达显著上调并通过诱导增殖与克隆形成而促进肝癌的生长。
关键词:MARCH5;线粒体；增殖；克隆形成；肝癌中图分类号:R-33;Q244;R735.7 文献标识码:A文章编号：1673-6273(2021 )03-424-05Over-expression of MARCH5 Promotes Tumor Growth in Liver Cancer* GENGXi-Iin', ZHANG Jing1, LIH ui1, YANG Yu-yii, ZHANG Yu', CHANG Hu-lin'A(1 Department o f H epatobiliary Surgery, Shaanxi Provincial People's Hospital, Xi'an, Shaanxi, 710068, China;2 Department o f g eneral surgery, Xi'an Xihang hospital, Xi'an, Shaanxi, 710021, China)ABSTRACT Objective:MARCH5 (membrane-associated RING-CH 5) is an E3 ubiqutin-protein that localized in mitochondrial membrane and functions as a regulator of mitochondrial morphology.Previous studies have indicated the close link between mitochondrial dynamic dysfunction and cancer.However,the expression and biological functions of MARCH5 in liver cancer remains unclear. The present study aims to explore the expression and tumor growth promotive role of MARCH5 in liver cancer.Methods: 1.Immunohis-tochemistry analysis was applied to evaluate the expression of MARCH5 in 62-paired tumor and peritumor tissues of liver cancer. 2. MARCH5 expression was further evaluated in four human liver cancer cell lines(SNU-354, SNU-368, HLE and HLF)and one normal liver cell line HL-7702. 3.The effects of MARCH5 knockdown on the proliferation and colony formation were determined by EDU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)and colony formation assays in liver cancer SNU-368 cells.Results: 1.MARCH5 expression was significantly increased in tumor tissues of liver cancer when compared with peritumor tissues(P<0.001). 2.MARCH5 expression was significantly higher in four liver cancer cell lines than in normal liver cancer cell. 3.MARCH5 knockdown suppressed both proliferation and colony formation in liver cancer cells.Conclusion:MARCH5 over-expression promotes liver cancer growth through increasing cell proliferation and colony formation.Key words:MARCH5; Mitochondrial;Proliferation;Colony formation;Liver cancerChinese Library:R-33; Q244; R735.7 Document code:AArticle ID: 1673-6273(2021)03-424-05刖目线粒体在细胞能量代谢、凋亡、钙离子与氧化还原稳态调 控中发挥重要作用M。
MMP-9／TIMP-1与肝癌侵袭转移及HBsAg表达的相关性研究
【 要 】 目的 探 讨 基 质 金 属 蛋 白酶 一 （ 摘 ９ ＭＭＰ ９ 及 组 织 金 属 蛋 白酶 抑 制 剂一 （Ｉ 一 ） 人 肝 癌 及 癌 旁 组 织 中 一） １ＴＭＰ １ 在 的 表达 和 肝 癌 生 物 学 行 为 及 Ｈ ｓ ｇ表 达 之 间 的 关 系 。 方 法 应 用 免 疫 组 织 化 学 法 （Ｐ研 究 ４ ＢＡ Ｓ】 ０例 肝 癌 及 癌 旁 组 织 中 ＭＭＰ ９ 、Ｉ 一 和 ＨＢＡ 一 ＴＭＰ １ ｓ ｇ的 表 达 。 结 果 ＭＭＰ ９在 肝 癌 和 癌 旁 组 织 表 达 阳 性 率 分 别 为 ７ ． 和 一 ２５ ％
Ｚ Ａ ｅ ｘ Ａ ｈ－ｉ ， Ｕ ｉ ， ｔ １ＱｎｄｏＵ ｉ ｒ ｔ Ｍ ｄ ａ Ｃ ｌｇ ａ ｌｔ — Ｈ ０ Ｗ ｉ Ｕ Ｎ Ｓｉｙ ｇ ｓ Ｎ Ｙｎ ｅ ０ （ｉ ａ ｎ ｅ ｉ ｅ ｉ ｌ ｏｅｅ ｆ ｉｅ Ｍｕ ， ｎ ｇ ． ｇ ｖ ｓｙ ｃ ｌ ｆ ａ ｄ ｉ ｎ ｉａ Ｈｏｐｔ ， ｉ ｄ ｏＳ ａ ｄ ｎ ２ ６ １ ， ｈｎ ） ｃ ｌ ｉ ｐ ｓ ｉ Ｑｎ ａ ｈ ｎ ｏ ｇ ６ ０ １ Ｃ ｉａ ｌ ａ ｇ
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药 品 评价 ２０ ０ ７年 第 ４卷 第 １ 期
一
３ — ３
ＭＭＰ ９ ＴＭＰ １ 一 ／ Ｉ 一 与肝癌侵袭转移及 Ｈ ｓ ｇ Ｂ Ａ 表达的相 关性研究
赵 玮 ， 世 英 ， 樱 ， 永 宁 宣 孙 辛 （ 岛 大学 医学 院 附 属 青 岛 市市 立 医院 ， 青 山东 青 岛 ２ ６ １ ） ６ ０ １
ｆ 中图 分 类 号１ ７ ５７ ３． Ｒ
【 献 标 识码 １ 文 Ａ
【 章 编 号】 ６ ２ ２ ｏ （０ ７０ — ｏ ３ ｏ 文 １ ７— ８９ ２ ｏ ） １０ ３ 一 ４
c-met基因在肝细胞性肝癌的表达及其意义
c-met基因在肝细胞性肝癌的表达及其意义
毛芸;李肖;周翔平
【期刊名称】《华西医学》
【年(卷),期】2005(20)2
【总页数】2页(P403-404)
【关键词】c-met基因;肝细胞性;肝癌;基因表达;肿瘤;消化;系统
【作者】毛芸;李肖;周翔平
【作者单位】四川大学华西医院放射科
【正文语种】中文
【中图分类】R735.7
【相关文献】
1.肝细胞生长因子及其受体c-met原癌基因在人肝细胞癌中的表达及意义 [J], 赵志泉;张国新;徐顺福
2.去唾液酸糖蛋白受体2基因在肝细胞性肝癌中的表达及意义 [J], 张彧;陈铃;何国珍;邓伟;张春燕;黄天壬
3.C-MET、Golph2、EZH2及DKK1蛋白在肝细胞肝癌中的表达及相关性 [J], 付尧;吴鸿雁;顾劲扬;陈骏;余慧萍;孙琦;孟凡青;史炯
4.NES1基因在肝细胞肝癌中的表达及临床意义 [J], 曹虹;饶雪峰;邹霞;廖传文;陈晓亮
5.TIMP-3基因在肝细胞肝癌中的表达及其意义 [J], 苑进凯;祝葆华;魏娟;王坤;张国平;王蓝天
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基因表达谱芯片在胰腺癌组织差异表达相关基因筛选中的应用
基因表达谱芯片在胰腺癌组织差异表达相关基因筛选中的应用贾长河;刘志亮;张成伟【摘要】目的：探讨基因表达谱芯片技术筛选胰腺癌组织和癌旁正常组织基因表达谱差异的可行性。
方法应用Agilent公司生产的包含27958条DNA的基因芯片检测4例胰腺癌患者胰腺癌组织和癌旁正常组织的基因表达谱，筛选差异表达基因，并用半定量RT-PCR法检测差异基因CD151、S100A4、TIMP-3和NME3表达情况。
结果共筛选出46条基因表达谱差异基因，其中26条表达上调、20条表达下调。
差异基因CD151、S100A4、TIMP-3和NME3的表达情况与基因表达谱芯片检测结果一致。
结论基因表达谱芯片技术可以筛选出胰腺癌组织差异表达相关基因，为胰腺癌分子标志物研究提供了可靠依据。
%Objective To investigate the feasibility of using cDNA microarray to screen differentially expressed genes between pancreatic cancer tissues and surrounding normal pancreatic tissues.Methods Gene chip containing 27 958 genes made in Agilent company was used to detect gene expression profiles between tumor tissues and surrounding normal tissues from four patients with pancreatic cancer respectively, and we identified the differentially expressed genes of pancre-atic cancer.The expression of CD151, S100A4, TIMP-3 and NME3 was detected by sqRT-PCR.Results The analysis showed that 46 genes were identified as differentially expressed genes of pancreatic cancer, including 26 up-regulated genes and 20 down-regulated genes.The expression of CD151, S100A4, TIMP-3 and NME3 was consistent with gene chip analy-sis.Conclusion Differentially expressed genes associated with pancreatic cancer can be screened by cDNAmicroarray, which provides the foundation for the next step research of pancreatic carcinoma molecular markers.【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2015(000)029【总页数】4页(P10-13)【关键词】胰腺肿瘤;基因芯片;肿瘤基因【作者】贾长河;刘志亮;张成伟【作者单位】河南省人民医院，郑州450003;加拿大多伦多大学医学生物物理系;加拿大多伦多玛格丽特公主癌症中心【正文语种】中文【中图分类】R736.1胰腺癌是预后最差的消化系统恶性肿瘤之一，5年生存率低于5%，故早期诊断胰腺癌尤其重要，但其早期诊断困难。
3项指标联合检测在肝细胞肝癌中的诊断价值
ＣＨ ＥＮ ａ ， Ｑｉｎ ｙＵ
ｑ ｎ， ＥＩＭ ｉ ｇ ｈ ｉ Ｍ Ｏ ｎ ｏ ｇ， Ｎ —ｉ ＬＩ ｕ Ｍ ｎ ｕ ， Ｑｉｇ ｔ ｎ ＱＩ Ｌｉｌｎ， ＡＯ ｅ— ｉ Ｗ ｉ ａ．Ｓ ｒ ｅｙ Ｄｅ ａ ｔ ｎ ｆ ｊ ｕ ｇ ｒ ｐ ｒｍｅ ｔｏ
Ｇａ ｌａ ｄ Ｌｉ ｅ ｔ ｅ ｆ ｌａ ｅ ｓ ｔ ｌｏ ｉｉ ｅ ｃ ｌＣｏｌｇ Ｇｕ ｎ ｘｉ２ ０ ８ Ｃ ｎ ｌ ｎ ｖ ｒ，ｈ Ａｆ ｉｉ ｔｄ Ｈｏｐｉａ ｆ Ｇｕ ｌｎＭ ｄｉａ ｌｅ ｅ， ａ ｇ ０ ８ ３， ｈｉａ
例及健 康献血者 ４ Ｏ例 ， 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 （ Ｉ Ｓ 测 定 各 组 血 清 中 高 尔基 体 膜 蛋 白一 ３ 可 溶 性 细 胞 间 黏 附 分 用 Ｅ Ａ） Ｉ ７ 及
子一 用 荧 光 Ｅｌ Ｓ 测 定 各 组 血 清 中 甲胎 蛋 白含 量 。 结 果 甲胎 蛋 白 、 溶 性 细 胞 间 黏 附 分 子 １及 高 尔基 体 膜 蛋 １， Ａ Ｉ 可 白一 ３联 合检 测 可 使 原 发 性 肝 癌 的检 出敏 感 性 和 特 异 性 分 别 达 ８ 和 ９ ， 于 其 中 任 一 单 项 检 测 ， 明 显 提 高 ７ ６ ３ 高 可
ａ ｈｅ ｉ ｏｌｃ ｌ ｒ １ ｓ ＣＡ Ｍ ） ａ ｄ ｓｏｎ ｍ ｅ ｕ ｅ － （ Ｉ １ ｎｄ Ｇｏｌ ｐｒ ｅｎ ７ Ｇ Ｐ７３） ｉ ａ ｏｓｎｇ ｈｅ ｔｃ ｃ ｌｕｌｒ ｃ ｒ ｉ ｇｉ ｏｔ ｉ－ ３（ ｎ ｄｉｇｎ ｉ ｐａ ｉ ｅ ｌ ａ ａ ｃｎｏｍ ａ Ｍ ｅ ｈ ｄｓ ２ ． ｔ ｏ ２１ ｃ ｓ ｓ ｏｆｐ ｔｅ ｔ ｎｃ ｕ ｎｇ ４４ ｃ ｓ ｓ ｏ ｐ ｉ ｅｌｕ ａ ａ ｃｎ ａ ｅ ａ ｉ ｎ ｓｉ ｌ ｄｉ ａ ｅ ｆｈｅ ａｔｃ ｃ ｌ ｌ ｒｃ ｒ ｉ ｏｍ ａ， ４ ａ ｅ ｆｏｆ ｅ ｐ ｔｃｃ ｒ ｉ ｏｍ ａ， ４ ｃ ｓ ｓｏｆｈｅ １ ｃ ｓ ｓ ｏ ｈ ｒ ｈｅ ａ ｉ ａ ｃｎ ７ ａ ｅ — ｐａ ｉ ｎｉ ｉｃ ｓ ｓ． ａ ｅ ｎｈｅ ａ ｉ ｓ ａ ｅ ｎｄ ４０ ｃ ｓ ｓｏｆｎｏｍａｌｃ ｎｔｏｌ ｅ ｅ ｄ ｔ ｒ ｉ ｄ， ｎ ３ ｔｃ ｂｅ ｇｎ ｄ ｓ ａ ｅ ４９ ｃ ｓ ｓｏｆｕ ｐ ｔｃｄｉｅ ｓ ｓａ ａ ｅ ｏ ｒ ｓ ｗ ｒ ｅ ｅ ｍ ｎｅ ａ ｄ ７ ｗｅ ｅ ｄｅ ｒ — ｔ ｒ ｉ ｅ ｉｈ ｄ ｅ ｍ ｎ ｄ ｗ ｔ ｏｕｂ ｅ ａ ｔｂ ｌ ｎ ｉ ｏｄｙ ｅ ｙｍ ｅ ｌｎｋｅ ｍ ｍ ｕ ｎｚ ｉ ｄ ｉ ｎｏｓ ｂ ｎｔａ ｓ ｙ ａｐｈａ ｆ ｔ ｐｒ ｅｎ ｗ ｅ ｅ ｄ ｔ ｒ ｉ ｄ ｗ ｉｈ ｌ ｒ ｓ ｏｒ ｅ ｓ ａ ｌ ｅ ｏ ｏｔ ｉ ｒ ｅ ｅ ｍ ｎｅ ｔ ｆｕｏ ｅ ～ ｃ ｎ ｎｚ ｍ ｅ ｌｎｋ ｄ ｉ ｍ ｕｎｏ ｏ ｂｅ ｓ ａ ．Ｒｅ ｕ ｔ Ｃｏ ｂｉ ｄ ｅ ｅ ｔｏ ｌ ｈａ ｆ ｔ ｐｒ ｅｎ、 ｏ ｕ ｅ ｉ ｅ ｃ ｌｕｌｒ ａ ｅ ｔｅ ｙ ｉ ｅ ｍ ｓ ｒ ｎｔａ ｓ ｙ ｓ ｌｓ ｍ ｎｅ ｄ ｔ ｃ ｉ ｎ ｏｆａ ｐ — ｅ ｏ ｏｔ ｉ ｓ ｌ ｂｌ ｎｔ ｒ ｅ ｌ ａ ｄ—
生物钟基因 Timeless 在 HBV 相关肝癌组织中的表达及其与乙肝病毒 X 蛋白的关系
生物钟基因 Timeless 在 HBV 相关肝癌组织中的表达及其与乙肝病毒 X 蛋白的关系彭桦;何前进;金涛;李常海【摘要】Objective To investigate the expression of circadian clock gene Timeless in hepatitis B virus ( HBV)-relat-ed hepatocellular carcinoma (HCC) and its correlation with hepatitis B virus x protein (HBx).Methods Immunohisto-chemistry was employed to detect the expression of Timeless in 60 cases of HCC tissues and adjacent normal tissues.Then we analyzed the relationship between the expression of Timeless and clinic pathological features in HCC patients.Meanwhile, both pcDNA3.1-HBx and pcDNA3.1 were transfected into LO2 and HepG2 cell lines, respectively.Real-time PCR and West-ern blotting were used to detect the expression of Timeless mRNA and protein.Results The protein expression levels of Timeless in HCC tissues and adjacent normal tissues were60.0%(36/60) and 38.3%(23/60), respectively;and signifi-cant differences were found (P<0.05).The expression of Timeless in HCC tissues was associated with vascular invasion (P<0.05), was not related with sex, age, level of serum AFP (all P>0.05).HepG2 and LO2 cell lines transfected with pcD-NA3.1-HBx plasmids demonstrated higher protein and mRNA expression levels of Timeless as compared with those transfected with pcDNA3.1 plasmids (all P<0.05).Conclusion High expression of Timeless may be related to the occurrence and progression of HBV-related HCC, and HBx may be one of the reasons that causes the high expression ofTimeless.%目的：探讨生物钟基因Timeless在HBV相关肝癌中的表达及其与乙肝病毒X蛋白（ HBx）的关系。
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TIMP-3基因在肝细胞肝癌中的表达及其意义目的研究TIMP-3 基因在肝细胞肝癌(human hepatocellular carcinoma，HCC) 中的表达，探讨其在HCC 发生发展中的作用及意义。
方法应用免疫组化(SP法) 和SYBR Green实时荧光定量聚合酶链反应检测30例HCC及对应癌旁组织以及10例正常肝组织中的TIMP-3 蛋白及TIMP-3 mRNA的表达情况，分析TIMP-3 基因的表达与HCC 临床病理参数的关系。
结果TIMP-3 蛋白明确定位于肝细胞胞质内。
TIMP-3 mRNA和TIMP-3 蛋白在HCC中的表达量分别为明显低于癌旁肝组织和正常肝组织中的表达量，差异有统计学意义（P＜0.01）。
统计学分析显示，在HCC 中TIMP-3 基因的低表达与肿瘤分化程度、血清中甲胎蛋白表达水平、是否合并HBV 感染等有关（P＜0.05），与患者性别等因素无关。
结论TIMP-3 基因可能在HCC 的发生发展中起着重要作用，其表达有望成为HCC 的重要分子生物学指标。
标签：肝癌；PCR；TIMP-3；免疫组化TIMP-3 gene in hepatocellular carcinoma and its significance YUAN Jin-kai，ZHU Bao-hua，WEI Juan，WANG Kun，ZHANG Guo-ping，WANG Lan-tian.Guangdong Medical College Graduate School，Zhanjiang 524000，China[Abstract]ObjectiveTo investigate the expression of TIMP-3 gene in human hepatocellular carcinoma (HCC) and discussits significance during hepatocellular carcinogenesis. MethodsExpression of TIMP-3 protein in HCC and the paired paracarcinomaliver tissues from 30 HCC patients was detected by immunohistochemistry (SP method), and TIMP-3 mRNA expression was analyzed by reverse transcription polymerase chain reaction.The relationship between expression of TIMP-3 geneand clinicopathologic parameters in patients with HCC was analysed. ResultsExpression of TIMP-3 protein was definitely locatedin the liver cancer cell plasma. The positive rates of TIMP-3 mRNA and TIMP-3 protein in HCC were respectively which were prominently lower than those in the paired paracarcinoma liver tissues（P＜0.01）.Statistical analysis showed that TIMP-3 in HCC gene expression and low degree of tumor differentiation, serum alpha-fetoprotein expression, such as the merger of HBV infection (P＜0.05), gender and other factors unrelated to the patient. ConclusionTIMP-3 gene may occur in the development of HCC plays an important role, its expression is expected to become important molecular targets of HCC.[Key words]Liver cancer；PCR；TIMP-3；ImmunohistochemistryTIMPs是一组具有特异性抑制基质金属蛋白酶（matrixmetallo proteinases，MMPs）功能的活性因子，它通过抑制MMPs的功能而阻止肿瘤生长、侵袭和转移。
TIMP家族是多基因家族的编码蛋白，目前已克隆出4个成员，分别命名为TIMP1、TIMP2、TIMP-3、TIMP4。
其中，TIMP-3是分子量为21 kD的家族中重要的成员，具有与其它3个成员不同的特性，它只存在于细胞外基质(ECM)中，是一种结合ECM的非可溶性蛋白。
TIMP-3除了可抑制MMP对细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的降解外，它是唯一具有诱导细胞凋亡的功能［1,2］，已在多种肿瘤包括黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌中发现［1,3~5］，但在肝癌中研究的很少，笔者采用免疫组化(SP法)和SYBR Green实施荧光定量聚合酶链反应检测检测30例肝细胞肝癌和对应癌旁组织以及10例正常肝组织中的TIMP-3基因蛋白以及TIMP-3 mRNA的表达情况，分析TIMP-3 基因的表达与HCC临床病理参数的关系。
1材料与方法1.1材料30例HCC 组织及对应的癌旁肝组织以及10例正常组织均为2010年1月~9月广东医学院附属医院肝胆外科手术切除的新鲜标本和相应的石蜡包埋组织块,其中癌旁组织距肿瘤边缘3 cm 以上。
肝外伤而接受肝叶切除的肝组织和肝血管瘤周围的组织共10例，用于检测mRNA的标本在手术离体后立即去掉坏死组织血块，于30 min 内迅速投入液氮(－80 ℃) 冻存；相应做免疫组化的标本均经甲醛固定、脱水、常规石蜡包埋，制备4 μm 连续切片，由病理科医师进行诊断和分级，所有病例均经病理证实为HCC，所有患者术前均未接受放疗、化疗，具有完整的临床及病理资料。
40例患者男29例，女11例，年龄40～72岁。
1.2试剂TRIZOL（invitrogen公司）、逆转录试剂盒(大连宝生物)、PCR试剂盒(大连宝生物)，ABI 7000全自动荧光定量PCR仪。
抗PTEN和抗TIMP-3兔多克隆抗體及SP试剂盒均购自中杉金桥生物公司，效价为1∶100。
1.3引物设计和合成TIMP-3的引物上游为5-TTGGACACTAACTCCT-3，下游为5-CCTCCCTCACTCTTACATG-3；它的内参β-actin的引物上游为5-GGCATCGTGATGGACTCC-3，下游为5-GCTGGAAGGTGGACAGCG-3，以上引物均由大连宝生物科技有限公司设计和合成。
1.4qRT-PCR1.4.1组织总RNA的抽提取在－80 ℃冷冻保存的100 mg组织标本，剪碎后放入DEPC处理过的匀浆器中，加入1 ml Trizol进行研磨，将匀浆后的液体移入DEPC处理过的115 ml灭菌微量离心管(EP)中，室温静置5 min ，4 ℃，12 000 r/min 离心5 min，将上清移入另一同样处理过的115 ml灭菌EP管中，加入氯仿200 μl，振匀后室温静置5 min，4 ℃12 000 r/ min离心10 min，将上清移入另一DEPC处理过的115 ml灭菌微量离心管( EP) 中加入500异丙醇，振匀后4 ℃，12000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀至半干燥，加30 μl DEPC 水溶解，用紫外分光光度仪检测RNA 的纯度和含量。
1.4.2逆轉录合成cDNA反转录反应的体系为体系总体积取20 μl，各组分终浓度分别为逆转录缓冲液1Ｘ、dNTP 0.375 mmol/L、MMLV 逆转录酶20 U、总RNA样品0.2~ 200 ng，DEPC水加至20 μl，逆转录反应参数依次为为16 ℃30 min，42 ℃30 min，85 ℃10 min。
1.4.3荧光定量PCR反应反应体系总体积取20 μl，各组分浓度分别为PCR 缓冲液1Ｘ(内含SYBR Green荧光染料)、特异引物0.08 μmol/L、Taq DNA聚合酶5 U/μl、逆转录产物2 μl，DEPC 水加至20 μl；PCR扩增条件为95 ℃变性5 min，95 ℃10 s，60 ℃20 s，72 ℃20 s，40 个PCR 循环。
所有反应均设立3个复孔。
以2-△△CT表示肿瘤组织TIMP-3的表达量相对于对照组表达量的变化倍数，TIMP-3△△CT=(CT各自-CTβ-actin)肝癌(CT各自-CTβ-actin) 癌旁组织。
1.5免疫组化检测把4 μm 厚石蜡切片65 ℃烘烤脱蜡，3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶5 min ，微波修复抗原，加一抗4 ℃湿盒中过夜，加生物素化二抗37 ℃反应30 min ，以辣根过氧化物酶标记链霉亲合素37 ℃处理30 min ，冲洗后加二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染，脱水、封片后在光镜下观察，PTEN阳性表达部位主要在细胞质，凡细胞质中出现明显的棕黄色颗粒者为阳性细胞，TIMP-3的阳性表达部位主要在细胞外基质，凡细胞外基质质中出现明显的棕黄色斑片状为阳性细胞。
1.6统计学处理实时荧光定量PCR，TIMP-3的表达量相对表达数据以均数±标准差（x±s）表示，免疫组化的结果将采用Image-Pro Plus 5.0软件进行灰密度分析，数据均采用SPSS 13.0统计软件的t检验进行统计处理，P＜0.05 为差异有统计学意义。
2结果2.1TIMP-3在HCC及癌旁组织中的表达肝癌组织中TIMP-3 mRNA相对表达量明显低于癌旁组织和正常肝组织中的TIMP-3相对表达量，差异有统计学意义（P＜0.01）。
见图1。
图1TIMP-3在正常肝组织、癌旁、肝癌组织中的RNA表达量。
2.2免疫组化结果TIMP-3在肝癌中的的灰度值为（23.52±3.35），在癌旁中的灰度值为（49.65±1.94）。
在正常肝组织中的灰度值为（56.01±1.92）。
肝癌与癌旁、正常肝组织比较统计有统计学意义（P＜0.01），癌旁组织和正常肝组织统计没有统计学意义（P>0.05）。