土壤与环境微生物研究法
微生物群落对土壤健康状况的评估与监测方法研究
微生物群落对土壤健康状况的评估与监测方法研究第一章：引言土壤是地球上生命的重要基础，而微生物群落作为土壤生态系统的重要组成部分，对土壤健康状况的评估与监测具有重要意义。
本文将综述目前微生物群落对土壤健康状况评估与监测的方法，并探讨其局限性和未来发展方向。
第二章：微生物群落与土壤健康2.1 微生物群落的功能土壤微生物群落包含多种微生物，如细菌、真菌、放线菌等，它们在土壤中发挥着重要的功能，比如有益菌种可以帮助植物生长、改善土壤质量，而有害菌种则可能引发土壤病害等问题。
2.2 微生物群落与土壤健康的关系微生物群落对土壤健康具有重要影响，它们参与土壤有机质分解、养分循环、抗病性调控等过程。
不同土壤健康状况下，微生物群落的丰富度、多样性和功能特征也会有所不同。
第三章：微生物群落评估方法3.1 文化基于方法文化基于方法是微生物群落评估的传统方法，通过分离纯培养菌株并进一步进行系统分类和功能分析来评估微生物群落的结构和功能特征。
该方法具有较高的可靠性，但受限于某些菌株难以培养以及培养基选择等问题。
3.2 分子生物学方法分子生物学方法基于微生物DNA或RNA的序列信息进行微生物群落评估。
其中最常用的方法是16S rRNA基因测序和ITS测序，可以更全面地了解微生物群落的组成和多样性。
此外，还有PCR-DGGE、T-RFLP等方法也被广泛应用于微生物群落评估。
3.3 元基因组学方法随着高通量测序技术的发展，元基因组学方法成为微生物群落评估的重要手段，能够揭示微生物群落的功能特征和代谢潜力。
这些方法包括元转录组学、元蛋白质组学等，其优势在于可以深入了解微生物群落的功能及其对土壤健康的影响。
第四章：微生物群落监测方法4.1 生物指示剂生物指示剂是通过观察特定微生物种群的分布和数量来评估土壤健康状况的方法。
例如，土壤中特定的蛋白质、酶活性或微生物细胞的含量可以被用作评估指标。
通过对这些指标的测量，可以揭示土壤中的微生物群落特征和动态变化。
不同环境条件下土壤微生物多样性研究
不同环境条件下土壤微生物多样性研究土壤微生物是土壤生态系统中的重要组成部分，对土壤养分循环、有机质分解以及植物生长等起着关键的作用。
然而，不同环境条件下土壤微生物的多样性存在一定的差异。
本文将探讨不同环境条件对土壤微生物多样性的影响，并针对不同环境条件下土壤微生物多样性的研究进行分析。
一、干旱环境对土壤微生物多样性的影响干旱环境下，土壤中水分减少，导致土壤微生物的生存环境恶化。
研究表明，在干旱环境下，土壤微生物的多样性明显降低。
这是因为干旱条件下，土壤中的水分限制了土壤微生物的生长和繁殖，使得一部分微生物无法在这样的环境下生存。
同时，干旱环境也影响了土壤中养分的分布，进而影响微生物的多样性。
因此，在干旱环境下，土壤微生物多样性较低。
二、寒冷环境对土壤微生物多样性的影响寒冷环境下，土壤中的温度较低，土壤活性降低，这对土壤微生物的多样性产生一定的影响。
研究发现，在寒冷环境下，土壤微生物的多样性相对较低。
这是因为低温环境下微生物的代谢活动减慢，生长速度降低，导致微生物数量减少，从而降低了土壤微生物的多样性。
此外，寒冷环境下的冻融作用也会对土壤微生物的多样性造成影响，这是因为冻融作用会破坏土壤结构，改变土壤中的物理化学性质，进而影响微生物的分布和活动。
三、酸性环境对土壤微生物多样性的影响酸性环境是指土壤pH值低于7的环境。
酸性环境会对土壤微生物的多样性产生显著影响。
研究发现，在酸性环境下，土壤微生物的种类和数量较少。
这是因为酸性环境下，土壤中的一些有益菌群会被抑制，而一些耐酸性的微生物会适应这样的环境，导致土壤微生物多样性降低。
另外，酸性环境会影响土壤养分的有效性，进而影响微生物的生长和繁殖。
四、盐碱环境对土壤微生物多样性的影响盐碱环境指土壤中盐分和碱性物质含量较高的环境。
盐碱环境对土壤微生物多样性产生较大影响。
研究表明，在盐碱环境下，土壤微生物多样性明显降低。
这是因为盐碱环境下，土壤中盐分过高会抑制土壤微生物的生长和活动，导致一部分微生物无法在这样的环境下生存。
土壤微生物
利用土壤微生物群落中不同物种DNA序列的差异，构建 DNA指纹图谱，用于土壤微生物群落结构和多样性的研究 。
宏基因组学技术
01
宏基因组DNA提取
直接从土壤样品中提取所有微生物的总DNA，用于后续的分析和研究
。02 03宏基因组构建将提取的宏基因组DNA片段化可获得土壤微生物的基因信息 和功能。
土壤肥力的提升
微生物分解有机物产生的 腐殖质等物质，有助于提 高土壤肥力和保肥能力。
植物生长的促进与保护
植物营养供应
生物防治作用
微生物通过分解有机物和矿化作用， 释放植物所需的矿质营养，促进植物 生长。
一些微生物能够产生抗生素、毒素等 物质，抑制或杀死病原菌和害虫，保 护植物免受生物胁迫。
植物激素的合成与分泌
土壤微生物作为地球上最为丰富的生物资 源之一，对于揭示生命起源、演化和生物 多样性等生命科学问题具有重要意义。
02 土壤微生物的多 样性
微生物种类的多样性
细菌
包括革兰氏阳性菌、革 兰氏阴性菌等，是土壤 中最丰富的微生物类群
。
真菌
包括酵母菌、霉菌等， 参与土壤有机质的分解
和养分循环。
放线菌
主要参与土壤有机质的 分解和腐殖质的形成。
有益作用
一些微生物能够与植物共生，促进植 物生长，提高植物抗逆性。
微生物遗传的多样性
基因多样性
土壤微生物基因组具有高度的多样性，包 括编码各种代谢途径、适应不同环境的基
因。
微生物进化
土壤微生物在长期进化过程中形成了适应 不同环境的遗传特性，使得它们能够在各
种极端环境中生存和繁殖。
遗传物质交流
微生物之间通过基因水平转移等方式交流 遗传物质，增加了土壤微生物遗传的多样 性。
土壤微生物研究方法
第二节 土壤微生物的计数与分析
• 一、培养计数法
•
根据培养基上所生长微生物的数量来 估算土壤中微生物的数量的方法
（一）一般微生物的分离与计数
• 稀释平板法
• 最大或然数法（MPN稀释法） • 土粒法
• 稀释平板法：
•
用已知质量的土壤在适量的溶液中搅拌的时候，微生 物和土壤分离，这些分开的微生物细胞在营养琼脂平板上 生长成为分散的菌落，根据菌落数换算得单位重量土壤中 微生物的数量。土壤中微生物的数量很多，因此必须取少 量样品制成土壤悬液，然后稀释，使发育在培养皿中的菌 落可以很好地分散开
测定是微生物在与野外环境完全不同的溶液 中的代谢活性，因此，也不能确定它的结果能 否反映土壤区系的实际代谢情况；
二、土壤微生物结构多样性分析
• 磷脂脂肪酸法也称为PLEA法 • （phospholipid fatty acid 法）； • 磷酸脂肪酸是所有微生物细胞膜磷脂的组分，具有结构多 样性和较高的生物学特异性，用磷酸脂肪酸作为标记物来 研究鉴别土壤微生物群落结构多样性变化。
?土壤微生物细胞利用31种碳源进行代谢以代谢过程产生的酶与四唑类显色物质如种碳源进行代谢以代谢过程产生的酶与四唑类显色物质如ttctv发生颜色反应的浊度差异为基础运用独有的显性排列技术分析土壤微生物的代谢特征指纹图谱反映不同环境条件引起的土壤微生物群落变化发生颜色反应的浊度差异为基础运用独有的显性排列技术分析土壤微生物的代谢特征指纹图谱反映不同环境条件引起的土壤微生物群落变化?biolog测试板含有96个小孔除对照外其余孔内分别含有不同的有机碳源和一种指示剂通过接种菌悬液根据微生物对碳源利用时指示剂颜色变化差异来鉴定微生物群落功能多样性个小孔除对照外其余孔内分别含有不同的有机碳源和一种指示剂通过接种菌悬液根据微生物对碳源利用时指示剂颜色变化差异来鉴定微生物群落功能多样性该法优点?灵敏度高分辨力强?无需分离培养纯种微生物可以最大限度地保留微生物群落原有的代谢特征无需分离培养纯种微生物可以最大限度地保留微生物群落原有的代谢特征?测定简便数据读取与记录可以由计算机辅助完成测定简便数据读取与记录可以由计算机辅助完成?可以连续监测微生物的变化可批量分析该法缺点?特别依赖于群体生理活性不能监测休眠体也不能检测那些不能利用特别依赖于群体生理活性不能监测休眠体也不能检测那些不能利用biolog碳源底物的群体
环保领域中土壤微生物菌株的筛选研究
环保领域中土壤微生物菌株的筛选研究土壤微生物菌株在环保领域中扮演着极为重要的角色，是一种有利于生态系统健康的重要组成部分，对于维持环境生态平衡发挥着十分重要的作用。
本文旨在探究土壤微生物菌株的筛选研究在环保领域中的应用及意义。
一、土壤微生物菌株的筛选传统的土壤微生物菌株筛选方法主要依靠培养基和生物学特性进行研究，然而这种方法的缺点在于对于一些难以培养的菌株无法得到很好的筛选。
因此，研究人员开始借助分子生物学等现代生物技术手段对土壤微生物菌株进行筛选，这种方法具有快速、准确、可重复性强、不受环境和培养基的限制等优势，是目前广泛采用的筛选方法。
二、土壤微生物菌株在环保领域中的应用1、土壤修复土壤修复是维护生态系统健康的一项重要措施，而土壤微生物菌株则可以通过其代谢产物对于土壤污染物进行分解、去除、转化等作用，从而促进土壤修复。
例如，亚硝酸盐可以通过硝化细菌、亚硝化细菌等微生物的转化作用被消除，如这些细菌的筛选及培养对于找到修复土壤中亚硝酸盐的生物菌株具有举足轻重的地位。
2、环境治理土壤微生物菌株可以通过吸附和生物降解等作用，对于土壤中污染物质进行吸收和降解等作用。
例如，利用细菌对于重金属的吸附、运输和沉淀等作用，可以从土壤中去除重金属污染。
在环境治理中，筛选和发现对于某些污染物具有降解作用的微生物将具有非常重要的作用。
3、农业生产土壤微生物菌株也在农业生产中扮演着重要的角色。
对于一些农业生产杀菌、抗病等问题，可以通过筛选和选育细菌来进行一方面的解决。
例如，枯草芽孢杆菌可有效抑制一些作物腐霉菌的生长，对于保障作物的生产具有不可替代的作用。
四、结论土壤微生物菌株的筛选工作可以帮助我们发现具有地域特征和环境适应能力的菌株，推动环境治理工作，有利于维护生态环境的健康，促进环境保护和可持续经济发展。
研究人员需要以有效的筛选方法和技术实现对于菌株的精准筛选，推动土壤菌株的发现、应用和推广。
土壤生态学的前沿研究
土壤生态学的前沿研究土壤，是地球生命的重要基础，是支撑着全球生物多样性和人类生存的基石。
而土壤生态学，则是研究土壤生态系统内部及其与外部环境相互作用的学科。
近年来，随着人类活动的不断加剧，土壤生态系统的健康和稳定已经成为关系到人类生存福祉的重要问题。
因此，土壤生态学的研究不仅需要了解土壤生物、生态过程和土壤碳循环等基础知识，同时也需要关注全球土壤生态环境的变化趋势以及相关治理手段和措施。
一、土壤微生物基因组学土壤微生物具有多样性、多功能性和适应性等特点，对土壤生态系统的功能维持和生物碳循环起着重要的作用。
而土壤微生物的基因组学研究，为深入了解微生物与土壤环境之间的相互作用和生物功能提供了新的视角和方法。
通过对土壤细菌、真菌、原生生物等微生物的基因组学研究，可以探测微生物在土壤生态系统中的生境适应性、代谢途径、功能基因等，从而为深入理解微生物在土壤生态系统中的生态作用和环境适应性提供基础支撑。
同时，基于微生物基因组的重构和编辑，还可以有效地利用微生物的代谢能力和生物功能，实现土壤养分利用、生物降解、环境修复等目标，为土壤生态环境的治理提供新的可持续性策略。
二、土壤碳循环与碳库效应土壤碳循环和碳库效应是近年来土壤生态学研究的热点问题之一。
土壤碳循环包括土壤有机碳的输入、输出和转化过程等，它与土壤生态系统的健康和稳定密切相关。
而碳库效应，则是指土壤有机碳在土壤中的储存能力和稳定性。
随着全球气候变化加剧，土壤碳循环和碳库效应已经成为制定土壤碳管理和治理策略的主要依据和方向。
因此，建立全面、精准的土壤碳循环和碳库效应体系，不仅可以促进土壤生态系统的健康和稳定，同时也可以提高全球生态环境的质量和可持续性。
三、土壤生态系统多样性和功能土壤生态系统内部的多样性和功能是评价其生态服务和发挥作用的重要指标。
土壤微生物、土壤动物、土壤植物等以及它们之间的复杂相互作用，构成了一个充满生命活力的生态系统。
而对于不同类型的土壤生态系统，其生态功能和生态服务也呈现出多样性和特殊性。
土壤微生物量测定方法
土壤微生物量测定方法一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取-碳分析仪器法）1、试剂（1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1 2（v : v）加入分液漏斗中，充分摇动1 min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。
得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。
纯化后的氯仿置于试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。
（2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1 mol L-1]：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴定终点判断和测定的准确度。
配制时应先除去碳酸钠，根据碳酸钠不溶于浓碱，可先将氢氧化钠配成50%（w : v）的浓氧溶液，密闭放置3～4 d。
待碳酸钠沉降后，取56 ml 50%氢氧化钠上清液（约19 mol L-1），用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馏水释稀到1 L，即为浓度1 mol L-1 NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。
（3）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5 mol L-1]：取1742.5 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25 L塑料桶中，加蒸馏水至20 L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1）上溶解24 h即可。
（4）六偏磷酸钠溶液[ρ（Na）= 5 g 100 ml-1，pH 2.0]：称取50.0 g分析纯六偏磷酸钠溶于800 ml高纯度去离子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH 2.0，用高纯度去离子水定容至1 L。
要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。
（5）过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2 g 100 ml-1]：称取20.0 g分析纯过硫酸钾，溶于高纯度去离子水中，定容至1 L。
值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7 d。
（6）磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100 ml-1]：量取37 ml 分析纯浓磷酸（85%），慢慢加入到188 ml高纯度去离子水中即可。
微生物群落结构对土壤性质的影响研究
微生物群落结构对土壤性质的影响研究随着人们对生态环境的认识日益深入，对于微生物群落结构对于土壤性质的影响也逐渐得到了重视。
微生物群落是指在一定环境下相互作用的微生物群体，在土壤中的微生物、真菌、细菌等群体中占据着重要的地位。
它们对土壤生物活性和养分循环起着至关重要的作用。
而对于微生物群落结构的研究，也是了解土壤生态学和生态系统功能的关键。
一、微生物群落结构对土壤生态系统的影响微生物群落的结构种类可能相当繁多，从土壤的性质、环境和某些有益微生物生长的影响等方面，这些微生物的种类和数量都会发生变化。
通过微生物群落结构的研究，我们能掌握土壤系统中微生物的种类、数量和活跃性的信息，并进一步理解土壤有机质的脆弱性、养分循环和氮固定等的过程。
此外，微生物群落结构对土壤的有机质降解和泥炭土形成等起着至关重要的作用。
二、微生物群落结构对土壤理化性质的影响微生物群落结构对土壤的理化性质有直接的影响。
对于土壤中的有机质水解和养分释放，微生物群落是必不可少的参与者，这对土壤的性质有很大的影响。
通过微生物群落结构的分析，可以了解到土壤水、热、气和肥力环境的相互作用，因此可以用微生物群落的变化来推测土壤理化性质的变化。
此外，微生物群落结构的稳定性和多样性也是影响土壤理化性质的重要因素之一。
三、微生物群落结构对土壤固定和释放养分的影响微生物群落可以通过释放代谢产物、以及促进根系吸收养分等方式，对土壤中的养分释放和固定产生重要的影响。
对于生长旺盛的微生物群落，它们会将固定的养分耗尽，从而形成营养不足的土壤环境。
而一些微生物群落的变化也可能引发化学反应和添加土壤改良剂的必要性，比如添加短链碳水化合物能真实构造出相应的垮地土壤、增强固氮活性等等。
四、微生物群落结构对土壤生态功能的影响微生物群落是土壤生态系统中不可或缺的组成部分，它们通过分解有机质、养分生存、水平运输、抵抗紫外线辐射等方式，维持了土壤生态系统的环境和生物多样性的平衡。
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第七章土壤微生物区系分析 (92)第一节一般土壤微生物的分离与计数 (92)一、稀释平板法 (92)二、MPN稀释法 (94)三、土粒法 (96)第二节厌氧微生物的分离 (96)一、充氮厌氧培养法 (96)二、焦性没食子酸吸氧法 (97)三、专性厌氧细菌的分离法 (98)第三节土壤主要类群微生物的分离与计数 (99)一、好氧细菌的分离与计数 (99)二、丝状真菌的分离与计数 (100)三、放线菌的分离与计数 (100)第四节土壤中功能微生物的测定 (101)一、氨化细菌的测定 (101)二、硝化细菌的测定 (102)三、反硝化细菌的测定 (104)四、好氧性自生固氮细菌的测定 (105)十一、纤维分解菌的测定 (106)十二、光合细菌的测定 (108)十三、甲烷产生菌的测定 (109)十四、有机污染物降解菌的测定 (110)十五、重金属抗性菌的测定 (111)第八章根圈微生物分析 (111)第一节根圈细菌的分析 (112)一、根圈的分区 (112)二、根圈细菌的分离 (112)三、根圈优势菌株的分群 (114)第二节植物组织内微生物的分离 (115)一、植物材料的选择 (116)二、组织表面消毒 (116)三、分离方法 (117)第十五章土壤微生物生物量的测定 (119)第一节土壤样品采集与预处理 (119)第二节土壤微生物生物量碳分析 (120)一、熏蒸提取——容量分析法 (120)第三节土壤微生物生物量氮分析 (124)一、熏蒸提取——全氮测定法 (125)二、熏蒸提取——茚三酮比色法 (127)第四节土壤微生物生物量磷分析 (129)一、熏蒸提取——全磷测定法 (129)第十七章土壤生物化学过程强度测定 (130)第一节土壤呼吸作用 (130)一、密闭静置培养测CO2法 (130)二、通气培养测002法 (131)三、田间收集C02法 (132)第二节土壤氨化作用 (133)一、土壤培养法 (133)二、氨化菌培养液培养法 (134)第三节土壤硝化作用 (135)一、土壤培养法 (136)二、培养基接种土壤悬液法 (137)三、纯菌培养法 (138)四、环流法 (139)第四节土壤反硝化作用 (140)一、硝酸盐消失法 (140)二、气相色谱法 (142)第五节土壤固氮作用 (145)一、土壤培养测全氮法 (145)二、无氮培养液培养法 (146)三、乙炔还原法 (147)第六节土壤磷素的转化作用 (151)第十八章土壤酶活性测定 (152)第一节氧化还原酶 (153)一、脱氢酶 (153)二、多酚氧化酶 (154)三、过氧化氢酶 (155)四、过氧化物酶 (156)五、硝酸还原酶 (158)六、亚硝酸还原酶 (159)七、硫酸盐还原酶 (160)第二节水解酶 (161)一、脲酶 (161)二、蛋白酶 (163)三、α-淀粉酶和β-淀粉酶 (164)四、脂肪酸 (165)五、转化酶（蔗糖酶） (166)第七章土壤微生物区系分析土壤是微生物生活的大本营，也是人类开发利用微生物资源的重要基地。
土壤微生物区系（soil microflora）是指特定土壤生态系统中生活的微生物的数量和组成状况，是反映土壤微生物生态特征的重要指标。
由于在不同的地理地带、不同的土壤类型、不同的季节和不同的土壤条件以及农业措施等影响下，微生物的数量组成是不同的，因此，对了解不同土壤生态系统中微生物区系的动态变化及挖掘所需的土壤微生物资源，与对了解土壤基本理化性质一样，仍具有重要的现实意义。
第一节一般土壤微生物的分离与计数从自然界或混有杂菌的培养体系中将所需要的微生物在培养基上形成单个菌落，称为菌种分离。
分离土壤微生物的方法很多，但是所有的方法都有一定的局限性，因此也各有利弊．常用的有稀释平板法、MPN(most Probable number)稀释法和土粒法。
一、稀释平板法稀释平板法是测定土壤中活的微生物数量最常用的一种方法。
该方法操作简便，而且可以同时从土壤中分离获取较多种类的微生物，井进行计数。
（一）基本原理本方法是基于这样的假设，即当已知质量的土壤在适量的溶液中搅拌的时候，微生物与土粒分开，这些分开的微生物细胞在营养琼脂平板上生长成为分散的菌落，根据菌落数换算得单位重量土壤中微生物的数量。
土壤中微生物的数量很多，因此必须取少量样品制成土壤悬液，然后稀释，使发育在培养皿中的菌落可以很好地分散开来，以便于计数和移植。
（二）操作步骤1)用1／100感量的天秤称取10g土样加入盛有100mL无菌水的500mL 三角瓶中。
同时称取待测土样10~llg(记下准确质量)，经105'(2烘干8h，置于干燥器中，待冷却后称重，按下式计算土壤含水量的百分数。
土壤含水量(％)=（湿土重—干土重）/湿土重*1002)将盛有10g土样和100mL无菌水的三角瓶放在振荡机上振荡10min，使土样均匀地分散在稀释液中成为土壤悬液。
3)土壤分散后，吸取1mL土壤悬液到9mL稀释液中(或吸5mL到45mL稀释液中)，依次按10倍法稀释，通常稀释到10-6。
所用的吸管在每次吸取悬液时，在稀释中反复吸人吹出悬液3~5次，以减少因管壁吸附而造成的误差，并使悬液进一步分散。
4)根据各类微生物在土壤中的数量多少选择经过适当稀释的悬液接种。
一般真菌采用的稀释度为10-3一10-1，放线菌为10-5～10-3，细菌为10-6 10-4，每一稀释度必须重复3~5次，重复越多，越准确。
’5)土壤悬液接种刮刀法先于灭菌培养皿中倾注18mL左右选择性培养基，凝固后，用1mL无菌吸管于瑚9表面加0.05mL(相当于1／20ml)或用无菌移液枪吸50μL一定稀释度的土壤悬液，然后立即用玻璃刮刀将悬液均匀地涂抹于琼脂表面。
混菌法吸取1mL悬液于直径为9cm的灭菌培养皿中，然后倾注已熔化并冷至45℃的选择性培养基约15mL与培养皿中的土悬液充分混匀，待凝固后倒置保温培养。
6)接种了土壤悬液的培养皿，待培养基凝固后倒置于28～30'C恒温箱中培养一定时间(细菌2~3天，真菌3～5天，放线茵5~7天)后取出，细菌和放线苗选取出现菌落数在20~200的培养皿，真菌选菌落数在10～100的培养皿，被扩散性细菌或真菌菌落占据琼脂表面15％的培养皿应该剔除，因为它们抑制了其他菌落的正常发育，从而造成试验误差。
7)结果计算用刮刀法接种的计算方法：用混菌法接种的计算方法：通常以cfu (colony forming unit)／g千土表示。
(三)注意事项1)用同一支吸管接种同一样本不同稀释度的悬液于培养皿时，应从高稀释度开始，然后依次接种较低稀释度的悬液。
2)分离细菌时，为了避免由于某些细菌菌落扩散造成误差，倒皿时培养基温度不宜太高或待倒人的培养基凝固后，将培养皿微启，倒置于60~ 70℃烘箱中15~20min，待琼脂表面冷凝水烘干或隔夜平板经检查确认无菌后，用同法涂抹土壤悬液。
3)分离芽孢杆菌时，应事先将样品中无芽孢细菌杀死。
所以要预先选取适当稀释度的土壤悬液于75~80'C水浴中煮15rain，然后再按上述方法涂抹于琼脂表面。
4)稀释平板法可因下列原因造成误差，因而对土壤中实际存在的微生物数量可能估计过低：①土壤悬液中有的菌成群聚集在一起或附在土粒上未被分散，因此在乎板上形成的菌落数比实际菌数低；②稀释液可能杀死某些微生物，③有的孢子在这种条件下不Q9发芽，因而不能发育成肉眼可见的菌落；④有的细胞在操作过程中被吸附在管壁上；⑤培养基和培养条件有较高的选择性，以致相当一部分微生物不能正常发育形成苗落，5)稀释平板法并不是对所有的微生物类群都同样适用，一般来说这个方法最适用于苗体大小和重量都差不多的类群，如细菌和酵母。
放线苗和真菌因菌体的不同部分的大小和质量相差较大，如菌丝、孢子和其他孢子器等质量大小均有较大差异。
严格来说，用此法所得菌落多数从孢子发育而来，而且与菌丝发育而成的菌落不能区分。
6)用此法时干扰结果的因素较多，因此各个实验室对操作程序的每一细节都应有自己的规定，以便于结果之间的相互比较。
二、MPN稀释法对具特殊生理功能的细菌，常采用稀释法计数，又称最大或然数法。
如硝化菌、反硝化菌、厌氧固氮菌、硫化苗、反硫化菌、纤维素分解菌等。
(一)基本原理本方法是基于选择适当稀释倍数的土壤悬液，接种在特定的液体培养基中培养，再检查培养液中是否有该生理类群微生物的生长。
根据不同稀释度接种管的生长情况，用统计学方法求出每克土壤中某生理类群的微生物数量。
(二)操作步骤1)土壤悬液制备方法同稀释平板法1)一3)。
2)根据微生物各类群在土壤中的大概数量选择5个相连的稀释度，将不同的稀释度悬液分别接种至不同培养基的试管中。
每管接悬液1mL，每一稀释度重复5管(3—5管均可，重复越多，结果越准确)，即一个样品每种培养基25管。
3）于28℃培养7~14天，根据各生理群的生长或反映，分别记载结果。
4）根据各稀释系列试管中有无待测微生物生长或其生理反映的正负得出数量指标，并根据重复数量不同而在相应的稀释法测数统计表中查出细菌近似值。
应用稀释计数法计数时，菌液稀释度要合适，要求在稀释系列中最低稀释度的所有重复都应有菌生长，而必须最后一个最高稀释度所有重复都没有微生物生长。
确定数量指标系取稀释系列中所有重复都有生长(或呈正反应)的最高稀释度为数量指标的第一位数字。
例如，稀释度10-110-210-210-4，10-5生长情况+ + + + + + + + + + + + + + - + + - - - - - - - -重复数 5 5 4 2 0数量指标为542，由表查得近似值为25。
如果在所有重复试管内都有微生物生长的稀释度之后仍有三个数字，则将最后二个数字加到前一个数字上。
例如，稀释度10-110-210-310-410-5生长情况+ + + + + + + + + - + + - - - + + - - - - - - - -重复数 5则数量指标为542+2=5445)结果计算每克干土中菌数＝设样品含水量为20％，则干土为80％每克干土中菌数＝25*102*100/80三、土粒法对于在土壤中数量较少的某些微生物，有人采用将土粒直接按种在选择性培养基上的方法来分离计数。
如好氧性自生固氮菌、纤维素分解苗及其他种类的微生物等。
(一)基本原理本法是把供试土壤颗粒，排列在适于某一生理类群微生物生长的选择性固体培养基上，这一类微生物的南落围绕着颗粒发育起来。
由这些颗粒在试样中所占的百分数可以得到这类菌在土壤中的含量及其近似值。
(二)操作步骤1)取少量土样加无菌水调成糊状。
2)用粗细适当的圆头玻璃棒沾糊状土样，点在已凝固的选择性琼脂平板上。
3)于28℃培养一定时间后，观察生长情况，结果以百分数表示。