引物合成基础问题
引物合成的原理
引物合成的原理
引物合成是一项重要的实验技术，用于在分子生物学研究中进行DNA扩增、测序等实验。
其原理主要基于DNA的双链结构和配对原则。
在引物合成中，首先需要确定所需扩增的目标DNA序列，并根据该序列设计两个短的单链DNA片段，即引物。
这两个引物的5'端需要与目标DNA序列互补配对。
引物合成通常通过核苷酸化学合成方法进行。
该方法基于磷酸二酯链的扩增反应，通过使用已经含有保护基的核苷酸单元，逐个将核苷酸单元与反应基位点进行连接。
每次反应结束后，需要进行碱性水解以去除保护基，再次进行连接反应。
这样，在多次循环反应后，可以得到完整的引物。
在合成引物时，还需要注意控制反应条件，例如反应缓冲液的pH值、反应时间和温度等。
合成后的引物可以通过比色法或者聚丙酰胺凝胶电泳进行质量检测。
引物合成的原理基于DNA的双链结构和碱基配对规则，通过化学合成方法制备出目标DNA序列的互补链。
这些合成的引物可以作为DNA扩增、测序等实验中的起始点，有效地进行目标序列的扩增和分析。
引物常识
引物的应用常识引物的原理引物是短的寡核苷酸片段，充当DNA复制的起点。
因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3’-羟基作为DNA合成的起始点。
这个3’-羟基由相配的引物提供。
在体内，由于DNA聚合酶的忠实性，不能从头合成DNA，因此只能由RNA聚合酶（称为引物酶）生成，采用RNA引物来延伸，在延伸过程中，RNA引物降解并由DNA取代。
在体外PCR反应中所用到的DNA引物，是根据不同的要求及模板序列设计，然后用化学法人工合成的，与模板形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸；对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。
1. 不同实验要求的引物选择在开始设计引物之前，必须弄清以下几点：（1）明确PCR的目的（例如克隆、SNP检测、定量检测等）（2）确定样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA）（3）确定PCR的类型（普通的、定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)，在查找序列的时候还需要考虑可能存在的问题（如假基因等）2.引物设计的重要因素有一些不同的软件工具可用于引物设计和引物分析。
引物设计的软件如Oligo 6.22 ，Premier 5.0，Primer Express 3。
引物分析常用Primer 5，Oligo 6.22，Primer-Blast。
目前生工生物给客户提供的引物设计服务引物用的是在线软件Primer 3 plus，•引物长度和专一性常见的引物长度为18-30个碱基。
短的引物（≤15碱基）能非常高效地结合, 但是它们的专一性不够。
较长的引物能提高专一性，然而退火效率低，从而导致PCR产量低下。
同时应避免编码单一序列和重复序列的引物。
•平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域引物的GC含量应介于40%～60%之间。
应避免聚-（dC）-或聚（dG）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。
聚-（dA）-和聚（dT）-也应避免，因为这样会形成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。
引物的合成原理
1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种,主要都是由ABI/PE公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
申能博彩公司采用的合成仪主要机型为ABI3900高通量合成仪，合成长链主要采用Beckman1000M和PE8909DNA 合成仪，引物修饰和高OD数合成采用ABI394等。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基；第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC,PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。
沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。
2.引物纯化方式有哪些，如何选择？◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。
引物合成常见问题分析
引物合成常见问题分析1．需要合成多少OD的oligo？一般来说，20BP 2 OD引物可以做400-500次50ul标准PCR反应，以及 2000—2500 次的测序反应。
因此，2 OD 的DNA 量足以进行一般的实验工作。
如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了，无论是 PAGE 纯化，还是 HPLC 纯化，增大每次的纯化量会大大降低制品的纯度。
所以，为了保证制品质量，我们一般把每次的纯化量控制在 2 OD 左右。
如何测定引物的OD值：DNA的量与260nm处的吸光度值(OD值)成正比，因此使用紫外分光光度计定量是最科学的，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。
进行OD值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。
例如：您拿到一管引物DNA干粉，用1ml水溶解成母液。
取该母液50μL稀释成1ml，在1ml标准比色杯中测定其吸光度为0.25，说明该50μL中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。
2. 如何检测Oligo DNA的纯度？实验室检测时比较方便的作法是进行PAGE凝胶电泳。
一般用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳即可，小于12bp的短链使用20% 的凝胶，大于60bp 的引物使用12% 的凝胶。
取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃2mins)。
600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下观察，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。
如果条件许可，也可以用银染方式染色。
3. 使用3%的Agarose凝胶电泳合成的 Oligo DNA 制品，为什么有很多条带？由于Oligo DNA 是单链 DNA ，容易形成复杂的立体结构，因此进行 Agarose 电泳时，容易出现多条泳带（更不能用 Agarose 电泳来进行定量了）。
Oligo DNA 的电泳一定要使用变性 PAGE 电泳，Agarose电泳对于小单链的DNA引物的区分度不够。
引物篇(引物合成及各种问题总结)
引物篇1.引物是如何合成的?目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产,无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的,相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其5'-羟基的保护基团DMT,获得游离的5'-羟基;第二步,合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3'端被活化,5'-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。
第三步,带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步,在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理,连接在CPG上的引物被切下来,通过OPC, PAGE等手段纯化引物,成品引物用C18浓缩,脱盐,沉淀。
沉淀后的引物用水悬浮,测定OD260定量,根据定单要求分装。
2.引物纯化方式有哪些,如何选择?◆C18柱脱盐:有人称其为简易反相柱,它对DNA有特异性的吸附,可以被有机溶解洗脱,但不会被水洗脱,所以能有效地去除盐分。
引物合成原理
引物合成原理引物合成是分子生物学实验中常见的一项技术，它在PCR、测序、基因克隆等领域都有着广泛的应用。
引物是PCR反应中的重要组成部分，它们的合成质量直接影响着PCR反应的效果。
因此，了解引物合成的原理对于科研工作者来说至关重要。
引物合成的原理主要包括以下几个方面，引物序列设计、引物合成方法和引物质量控制。
首先，引物序列设计是引物合成的第一步。
在进行引物序列设计时，需要考虑引物的长度、GC含量、Tm值等因素。
引物的长度一般在18-25个碱基对之间，GC含量需要控制在40-60%之间，这样有利于提高引物与模板DNA的亲和力。
另外，引物的Tm值也是一个重要的设计指标，它可以影响引物的特异性和PCR反应的效果。
因此，在引物序列设计时，需要综合考虑这些因素，选择合适的引物序列。
其次，引物的合成方法也是引物合成的关键环节。
目前常用的引物合成方法有化学合成和酶合成两种。
化学合成是指利用化学合成方法在实验室中合成引物，这种方法成本较低，但需要纯化和质量控制较为复杂。
而酶合成是利用DNA合成酶在体外合成引物，这种方法操作简单，但成本较高。
在选择引物合成方法时，需要根据实际需求和实验条件进行综合考虑。
最后，引物质量控制是引物合成的最后一步。
引物的质量直接关系到PCR反应的效果，因此质量控制至关重要。
在引物合成后，需要进行质量分析，包括测定引物的纯度、浓度和完整性。
常用的质量分析方法有紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳法等。
通过这些方法可以对引物的质量进行全面的评估，确保引物的质量符合实验要求。
总的来说，引物合成是分子生物学实验中不可或缺的一项技术。
了解引物合成的原理对于科研工作者来说至关重要，它涉及到引物序列设计、引物合成方法和引物质量控制等多个方面。
只有在这些环节都做好的情况下，才能保证PCR反应的效果和实验结果的准确性。
希望通过本文的介绍，能够帮助大家更好地理解引物合成的原理，提高实验的效率和准确性。
引物合成的基本原理
引物合成的基本原理引物合成是一种重要的实验技术，用于检测和分析DNA、RNA或蛋白质序列。
引物合成的基本原理是通过化学方法合成一段与目标序列互补的短链核苷酸，以便在实验中用作引物。
以下是引物合成的详细基本原理的解释。
首先，引物合成需要知道目标序列的碱基顺序。
这可以通过DNA或RNA序列数据的在线数据库或实验室内部的测序技术得到。
获得目标序列后，可以确定所需引物的长度和序列。
引物的长度通常为15-30个碱基，最好是20-25个碱基。
较短的引物可能会导致特异性较差的扩增，而较长的引物可能会降低扩增效率。
因此，选择合适长度的引物是非常重要的。
同时，引物的序列也要尽量选择没有或较少重复区域的部分，以避免非特异性扩增。
引物合成一般使用化学方法，如磷酸二酯法或磷酸三酯法。
这些方法允许在无机硅胶或C18纯化柱上合成短链核苷酸。
具体步骤包括：1.碱基保护基团的去除：在引物合成开始之前，需要去除碱基的保护基团。
这可以通过二乙酰苯基（使用二乙酰氯）或9-氨甲基吲哚（使用氨甲基化试剂）进行。
2.磷酸二酯法合成：将合成核苷酸的3'-端与2-氧乙基基团反应，使其与下一个核苷酸的5'-端形成磷酸二酯键。
这个过程在固相合成柱上完成。
3.磷酸三酯法合成：将合成核苷酸的3'-端与N-4-二丁氨基甲酸保护基团反应，同时在5'-端加入磷酸二维碘苯基团作为保护基团。
然后，通过反应剂如二乙酰二硝酸酯或乙二酸二苄酯，将5'-端碱基上的保护基团去除，使其能够与下一个核苷酸形成磷酸三酯键。
这个过程在固相合成柱上完成。
4.引物的纯化与检验：合成的引物需要经过纯化步骤去除其他杂质所产生的杂交引物。
通常使用无机硅胶柱或高效液相色谱(HPLC)柱进行纯化。
纯化后，引物的纯度可以通过质谱分析或摄谱法进行检验。
5.应用：合成的引物可以用于PCR（聚合酶链反应）扩增DNA片段的特定区域，或用于探测目标DNA片段的存在与否。
引物合成常见问题分析
引物合成常见问题分析引物1合成中常见问题的分析。
应该合成多少脱氧寡核苷酸？一般来说，20BP 2 OD引物可进行400-500个50ul标准聚合酶链反应和2000-2500个测序反应因此，2 OD的脱氧核糖核酸的量足以进行一般的实验工作。
如果进行基因剪接或退火后再连接，1 OD就足够了，无论是PAGE纯化还是HPLC纯化，每次增加纯化量都会大大降低产品的纯度因此，为了保证产品的质量，我们通常将净化量控制在每次2 OD左右。
如何确定引物的光密度值:DNA的量与260纳米处的吸光度值(光密度值)成正比，因此用紫外分光光度计定量是最科学的，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0。
当测定OD值时，分光光度计上显示的值是每毫升溶液的OD值。
例如，你得到一管引物DNA干粉，用1毫升水将其溶解在母液中。
将50微升母液稀释至1微升，并在1微升标准试管中测量吸光度至0.25，表明50微升含有0.25脱氧核糖核酸，也就是说，最初的1微升母液含有5脱氧核糖核酸2。
如何检测寡脱氧核糖核酸的纯度？实验室检测更方便的方法是聚丙烯酰胺凝胶电泳一般情况下，16%聚丙烯酰胺凝胶加7M尿素用于电泳，20%凝胶用于小于12bp的短链，12%凝胶用于大于60bp的引物取0.2-0.5分钟的引物，用尿素饱和溶液溶解或向引物溶液中加入尿素干粉至饱和，在装载前加热变性(95℃，2分钟)在600伏电压下进行电泳，在一定时间后(约2-3小时)将凝胶剥离。
荧光薄层板在紫外灯下观察。
主带下未发现杂质带，表明纯度良好。
如果条件允许，也可以用银染法染色。
3。
为什么用3%琼脂糖凝胶电泳合成的寡核苷酸产物中有许多条带？由于寡脱氧核糖核酸是单链脱氧核糖核酸，很容易形成复杂的三维结构，所以在进行琼脂糖电泳时，很容易出现多个泳带(更不用说琼脂糖电泳定量)寡核苷酸的电泳必须使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，琼脂糖电泳不能充分区分小的单链DNA引物。
此外，在紫外灯下观察到荧光薄层板，主带下没有杂质带，表明纯度良好。
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Q1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
(1) 去保护：加入Deblocking脱去碱基上5- OH的保护基团DMT，获得游离的5- OH；(2) 耦合：同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基5-OH仍然被DMT保护，3端被活化与溶液中游离的5-OH 发生耦合反应；(3) 封闭：耦合反应中极少数5- OH没有参加反应，用封闭试剂终止其后继续发生反应；(4) 氧化：加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。
Q2.引物合成如何处理？切割与脱保护基：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。
常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。
断裂下来的寡核苷酸带有自由的3’羟基。
纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。
常用的纯化方法有：C18、OPC、PAGE和HPLC。
定量：根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。
储存：分装抽干。
Q3.合成的引物5’端是否有磷酸化？合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。
如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5’端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5’或3’端进行磷酸化，需要另外收费。
Q4.需要什么级别的引物？根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。
应用引物长度要求纯度级别要求一般PCR扩增< 60base HEPD>60 base PAGE诊断PCR扩增< 40base HEPD, PAGEDNA测序20base左右HEPD亚克隆，点突变等根据实验要求定HEPD, PAGE，HPLC基因构建（全基因合成）根据实验要求定HEPDPAGE反义核酸根据实验要求定HEPDPAGE修饰引物根据实验要求定PAGE, HPLCQ5.需要合成多少OD数？根据实验目的确定。
一般PCR扩增，2 OD引物，可以做500-1000次50ul标准PCR反应。
如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。
Q6.如何计算引物的浓度？引物保存在高浓度的状况下比较稳定。
一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成100pmol/ul，称为保存浓度，而引物的工作浓度一般配制成10-50pmol/ul。
加水的体积（微升）可直接参照合成报告单上推荐的体积，也可按下列方式计算：V (微升)= OD数x 33 x 10000 /引物的分子量引物的分子量可以从合成报告单上获得。
注意：1 OD260= 33 ug/ml。
溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。
如果不一致，请和我们联系。
我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。
Q7.如何计算引物的Tm值？引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成及所使用缓冲夜的离子强度有关。
长度为25base以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (GC%) – 600/size＊＊公式中，Size =引物长度。
Q8.引物（含修饰）的分子量是如何确定的？非修饰的引物的分子量（MW）在随引物提供的报告单上可以找到。
如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数x碱基的平均分子量，或按下列公式计算MW= (NA* WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod)＋(Nx * Wx)+( NI* WI) +16* Ns–62. NA, NG, NC, NT, NI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA, WG ,WC, WT, WI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod分别为修饰基团的数目和分子量。
对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混合的分子量为（313.21+329.21）/2 = 321.21。
Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。
常规碱基分子量Base Molecular WeightA 313.21C 289.18G 329.21T 304.19I 314.2U 290.17常规修饰基团分子量5’-Biotin 405.45 3’-TAMARA 623.605’-(6 FAM) 537.46 3’-Dabsyl 498.495’-HEX 744.13 3’-(6 FAM) 569.465’-TET 675.24 3’-Amino Modifier C3 153.075’-Cy5 533.63 3’-Amino Modifier C7 209.185’-Cy3 507.59 3’-Thiol Modifier C3 154.12Q9.如何溶解引物？干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好瞬时离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。
根据计算出的体积加入去离子无菌水或TE(pH8.0)缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。
溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。
Q10.如何保存引物？引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成无色或白色絮状干粉。
干粉：运输时常温运输，-20℃可以保存一年。
储存液：配好后分装成几管，避免反复冻融，-20℃可以保存半年。
工作液：常规使用，4℃保存，也可-20℃保存，但应避免反复冻融。
修饰荧光引物：需要避光保存，尽快使用为宜。
Q11.引物定量不准是怎么回事儿？我们偶尔收到用户投诉定量不准的报告，出现这种情况的可能性有：（1）定量错误、分装错误、引物抽干或收样过程中意外丢失。
这种可能性有，但是很少，因为作为专业的引物合成公司，我们的生产人员都是经过严格的专业培训，这种错误是要求谨慎避免甚至杜绝的。
一般情况下，引物都有留样备份，接到用户投诉后，我们都会找出留样重新定量，一般都没有问题，如确实存在问题，则可安排重新准备一份。
（2）系统误差，我们认为10%左右为允许误差。
使用过程中，引物工作浓度范围很宽，定量上的少许偏差不影响实验。
（3）用户收到引物干粉时，打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。
（4）用户没有能够正确理解引物OD数的含义，没有能够正确使用分光光度计，特别是使用微量测定；用户没有将OD读数，正确地转换成母液中OD数。
这种情况比较常见。
例如，验证标2OD引物量是否准确，简单的做法是：加入1ml水，彻底溶解混匀后，取100ul,加入900ul 水，用光径为1cm的石英比色杯，波长260nm,此时光吸收的读数为0.2。
Q12.最长可以合成多长的引物？我们合成过100base的引物，但是产率很低。
除非需要，建议合成片段长度不要超过80base。
引物越长，出现问题的概率就越大，按照目前的引物合成效率，大于80base的粗产品，全长引物的百分比不高，后续处理还有丢失很多，最后的产量很低。
Q13.为什么修饰引物的产量要比一般引物低，价格要高?主要因为是修饰单体稳定性较差，偶连时间长，效率低，最后得到的产量自然低于一般的引物。
修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化，纯化过程损失大。
修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍，所以产品的价格也高。
Q14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？连接反应需要引物的5’磷酸基团。
如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。
磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。
SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。
Q15.如果测序发现引物突变，是否有补偿？该如何处理？如果出现测序发现引物位置碱基错误的情况，我们可以免费重合一次，没有其他任何补偿或赔偿，不承担其他连带责任，这是国际行规。
原因我们在前面已提到，化学合成效率不可能达到100%。
如果遇到这种情况，首先和我们联系，我们会检查合成序列是否和原始订单一致，如果确认引物合成序列没有输错，我们建议重新挑取克隆测序，您可能会找到正确克隆的。
根据我们经验，40个碱基以下的引物，测1-2个克隆就可以了；40个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。
一般情况下，每个克隆突变的位点都不一样，正确的总是有的，就是如何找到它。
您也可以要求我们将引物免费重合一次，不过重合的引物和第一次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。
基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。
根据全基因合成的数据，我们的引物能做到2000个碱基的片段，取三个克隆，其中至少有一个是正确的。
Q17.为什么引物的OD260/OD280小于1.5？需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。
OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T的含量比较高所致。
下表是一个20base同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。
A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base CompositionsBase Composition A260/2805-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 2.505-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3 1.855-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 1.155-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 1.145-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3 1.66Q18.同样的OD用PAGE检测，EB染色为什么深浅不一？通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，因为EB可以嵌合到双链DNA中。
而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会有差异，比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB染色效果就非常差。
所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。
Q19.如何检测引物的纯度？实验室方便的做法是用PAGE方法。
使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。
取0.2-0.5OD 的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。
加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。
600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。