DNA合成常见问题解答
分子实验中核算DNA提取常见问题及分析
分子实验中核算DNA提取常见问题及分析一、基因组DNA提取常见问题分析1．样品材料老化或反复冻融导致DNA含量下降：应选择新鲜的材料样品，如新鲜血液、新鲜菌液、刚离体的动物组织或细嫩的植物组织等，不能即时处理的样品应立即放入液氮或-70C低温保存，以免DNA 降解。
2．样品破壁或裂解不完全，DNA未充分释放：动、植物材料应在液氮中充分研磨匀浆，G +细菌、酵母等破壁较困难的样品应用溶菌酶、Lyticase酶或机械方式协助破壁。
3．样品量过多导致细胞裂解不充分：加样量过多使裂解液和样品混合不均匀，细胞裂解不充分。
不同来源样品的加样量不同。
4．DNA吸附不充分：如在上吸附柱前未加无水乙醇，或用低浓度乙醇代替无水乙醇，则导致DNA 不能充分沉淀，与硅胶膜吸附不彻底，因此应在样品裂解后加适量无水乙醇，再上吸附柱使DNA与硅胶膜充分吸附。
5．DNA洗脱不适当：洗脱缓冲液pH值过低会阻碍DNA从硅胶膜上洗脱下来，应确保洗脱液pH 值在7.0-8.5之间。
洗脱体积过少，若小于30ul,不易完全浸透硅胶膜，使DNA不能全部洗脱下来，因此洗脱缓冲液应大于30ul。
同时如洗脱体积过大，超过200ul,则所得的DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少。
洗脱时可将洗脱缓冲液在65-70℃水浴预热，加入洗脱液后在室温静置2-5分钟，可提高洗脱效率,加大DNA产量。
二、提取的基因组DNA有降解，如何解决?1．选取的材料不新鲜或反复冻融，采集材料后未及时处理或未低温保存：陈旧血液，老化菌液等不新鲜的材料中，细胞凋亡导致DNA降解，或低温保存的样品反复冻融导致细胞破裂，内源核酸酶降解DNA，因此应选择新鲜的材料样品，不能及时处理则低温保存，运输过程中亦应使用干冰。
2．未能有效抑制内源核酸酶作用：某些DNase含量较丰富的动、植物组织样品应在液氮中研磨或匀浆，研磨过程中应随时补充液氮，并在样品未完全解冻前即加入含有抑制核酸酶作用的鳌合剂的裂解液。
DNA合成常见问题解答
DNA合成常见问题解答Q：如何保存引物或探针产品？A：干粉的引物非常稳定，可以在-20℃下保存至少1年左右,4℃可以保存6个月左右；溶解好的引物在-20℃下可以保存半年左右,4℃可以保存1个月左右。
荧光标记的探针请避光保存。
Q：引物在常温下运输，会降解吗？A：不会降解，干燥的引物在常温至少可以稳定存放二周以上。
而一般的运输时间通常都在1-3天左右，所以您收到的引物不会降解。
Q：如何计算Oligo DNA溶液的浓度？A：基本参数及计算公式：MW(分子量)=(A碱基数x313.21)+(G碱基数x329.21)+(C碱基数x289.18)+(T碱基数x304.2)+(Mix碱基数x324.5)+(I碱基数x314.19)+(U碱基数x290.17)-61.96Mix为兼并碱基；I为2'脱氧尿嘧啶；U为2'脱氧尿嘧啶兼并碱基代码：R=(A/g)、M=(A/C)、W=(A/T)、S=(C/g)、Y=(C/T)、K=(g/T)、H=(A/T/C)、B=(g/T/C)、D=(g/A/T)、V=(A/C/g)、N=(A/C/g/T)平均分子量：Oligo DNA中的每个脱氧核苷酸碱基的平均分子量近似为324.5，则一条Oligo DNA的平均分子量=碱基数x324.5.1 OD的Oligo DNA约为33ug举例：您得到一管标为2 OD 20merOligo DNA，无兼并碱基、I和U，序列为：CTGGAGAGAGGTTTGTCTGG分子量=(3x313.21)+(9x329.21)+(2x289.18)+(6x304.2)+(0x324.5)+(0x314.19)+(0x290.17)-61.96=6244.10质量数=2x33=66μg摩尔数=66/6244.10=0.011μmol=11nmole若加双蒸水200μl溶解，则浓度为11nmole/200μl=0.055μMQ：如何测定引物的OD值？A：用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量，DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色皿中测定其吸光度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。
基因常见问题解答
基因常见问题解答1．碱基序列对全基因合成的影响1. 长片段重复。
大量的长片段重复很可能会延长基因合成的时间，甚至导致基因完全无法合成。
2. 高GC%。
基因内部的局部高GC%会严重影响PCR扩增和测序。
3. 二级结构。
碱基序列的反转、重叠等会严重影响PCR扩增，在测序时也可能会因此而测不通或信号突然中断等。
4. 测序引物与基因内部的特殊序列结合导致无法正常测序，必须重新设计测序引物。
对策：对密码子进行优化，尽量减少基因序列中的重复序列,高GC%区和二级结构区。
2.PCR出现非特异性扩增带1. 引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
2. Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多。
3. 酶量过多出现非特异性扩增。
对策：1. 重新设计引物。
2. 减低酶量或调换另一来源的酶。
3. 降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。
4. 适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
3.PCR出现片状拖带或涂抹带1. 酶量过多或酶的质量差。
2. dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多。
对策：1. 减少酶量，或调换另一来源的酶。
2. 减少dNTP的浓度。
适当降低Mg2+浓度，减少循环次数。
4. DNA没有被限制性内切酶切开或者切割不完全1. 缺少识别序列。
2. 反应条件不合适。
3. 限制性内切酶对DNA甲基化敏感。
4. 内切酶稀释不正确或加入方法不正确。
5. 甘油浓度过高。
6. 限制性内切酶已部分或全部失活。
对策：1. 检查底物DNA中是否存在可被限制酶识别的DNA序列。
2. 使用随酶提供的反应缓冲液；增大酶量。
3. 检查DNA是否已被甲基化以及所用的限制性内切酶是否对甲基化敏感。
4. 限制性内切酶经稀释缓冲液稀释后应在当天用完；限制性内切酶通常在最后加入。
5. 更换新酶进行实验。
6. 酶的体积不能超过反应总体积的1/10。
5.电泳后电泳条带扩散，电泳条带移动距离异常1. 底物DNA不纯。
第16章 DNA复制和修复答案
第十六章DNA的生物合成一、名词解释1.冈崎片段：DNA复制中，滞后链的合成是先合成许多小片段，再连接成一条链，这些小片段起初是由冈崎发现的，所以称为冈崎片段。
2.半保留复制：DNA的复制时，每一子代DNA分子由一条亲代链和一条新合成的链组成，这种复制方式称为半保留复制。
3.半不连续复制：DNA复制中，一条链是连续合成的，为前导链，另一条链先合成岗崎片断，再连接成新链，合成是不连续的，为滞后链，这种复制方式称为半不连续复制。
4．光复活：受紫外线照射而引起损伤的细胞用可见光照射，大部分损伤细胞可以恢复，这种修复过程叫做光复活。
二、填充题1．DNA复制的方向是从__5’__端到___3’__端展开。
2.__ DNA聚合酶Ⅰ___和DNA连接酶_的缺乏可导致大肠杆菌体内冈崎片段的堆积。
3．体内DNA复制主要使用_RNA___作为引物，而在体外进行PCR扩增时使用_人工合成的DNA____作为引物。
4．使用_胰蛋白___酶可将大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ水解成大小两个片段，其中大片段被称为__Klenow___酶，它保留__3’→5’核酸外切酶__和_DNA聚合__酶的活性，小片段则保留了_5’→_3’核酸外切_____酶的活性。
5．大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ是一种多功能酶，其具有DNA聚合酶、 _3’→5’核酸外切酶和 5’→_3’核酸外切酶的活性。
6．维持DNA复制的高度忠实性的机制主要有_DNA聚合酶的高度选择性__、__DNA聚合酶的自我校对___和__错配修复___。
7．DNA连接酶催化的连接反应需要能量，大肠杆菌由NAD+ 供能，T4噬菌体由ATP供能，动物细胞由 ATP 供能。
8.以RNA为模板合成DNA称为反转录，由反转录酶催化。
9. DNA复制时前导链的合成是连续的，其合成方向与复制叉移动方向相同；随后链的合成是不连续的，其合成方向与复制叉移动方向相反。
10．细菌的环状DNA通常在一个复制位点开始复制，而真核生物染色体中的线形DNA可以在多位点起始复制。
716-DNA重组常见问题
DNA重组常见问题TaKaRa的内切酶和NEB的内切酶哪个更好一些？参考见解： TaKaRa的内切酶、NEB的内切酶两个公司的酶的品质都非常好。
NEB公司的酶的活性很高，切出两条小带可能是因为出现星活性，可以试试把酶量减半。
NEB的酶很多都是克隆的，所以纯度比较高。
应用磁性微球提取人全血基因组DNA，将提取出的DNA直接用于限制性酶切反应，应用Taq1酶，但发现酶切后产生的是smier片断，即切碎的状态。
不知原因是什么？在做这类实验时，一般是将PCR产物进行酶切，这与实验结果有联系吗？是不是直接提取出的DNA必须要做PCR扩增，才能应用酶切？参考见解：1. 为建立基因组文库时一般才用限制性内切酶酶切人基因组DNA.目的是为获得含有人全部DNA的随机片段的总和.然后再用载体和宿主细胞构建克隆.关于文库建立园内资料很多.lyz703lyz战友感兴趣的话可以自己搜索下.2. 电泳图,酶切后是一片弥散的带,是因为基因组中存在大量Taq1酶的酶切位点,由于操作属于随机酶切,所以得到的DNA也是随机的,而不是大量均一的.那么电泳后的出现这样的结果也很容易解释.3. 一般在PCR后采用酶切是由于酶切模板数目巨大且均一,在了解了被切DNA上有关限制性内切酶位点的信息后,我们就可以根据自己的目的来选择合适的内切酶进行酶切.做抑制差减杂交,需要回收细菌基因组酶切(Alu1酶)后的全部片段,要求回收后至少是6微升,浓度要有0.3微克\微升,按照抑制差减杂交说明书,采用酚仿抽提和无水乙醇沉淀法,只要酶切2微克基因组就能满足条件,可已经把酶切量扩大到10多微克了,回收还是达不到浓度(大约只有0.06微克\微升),又不敢切胶回收,怕EB对后续反应造成影响。
请教该怎么办？参考见解：回收酶切产物浓度低的原因可能是：苯酚/氯仿抽提时损失太多。
说明书上说苯酚/氯仿/异戊醇和氯仿各抽提两次，这样经过四次抽提DNA损失得非常多，解决办法是将50?l酶切产物加等体积的灭菌去离子水，然后再抽提，损失会减少很多；另外乙醇沉淀时可以延长，低温沉淀会提高得率；还有用80％乙醇洗涤沉淀弃上清时，要轻轻用移液枪吸出，防止将沉淀随上清倒出。
DNA提取和常见问题分析及对策
D NA提取和常见问题分析及对策主讲人：**DNA简单介绍DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。
为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提。
D N A提取原则保证DNA结构的完整性纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染D N A提取的几种方法一、染色体DNA的提取CTAB法SDS法其它D N A提取的几种方法二、非染色体DNA的提取质粒DNA的提取•碱裂解法•煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取•差速离心结合SDS裂解法CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。
该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。
注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
CTAB法流程图植物材料裂解液异丙醇沉淀液氮研磨抽提离心洗涤DNA溶液细胞裂解上层溶液干燥溶解CTAB中各个组分的作用CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。
CTAB提取缓冲液的改进配方PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
引物合成常见问题
引物合成常见问题Q1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
⑴去保护：加入Deblocking脱去碱基上5'- OH的保护基团DMT，获得游离的5'- OH ；⑵耦合：同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基5'-0H仍然被DMT保护，3'端被活化与溶液中游离的5'-0H发生耦合反应；⑶封闭：耦合反应中极少数5'- OH没有参加反应，用封闭试剂终止其后继续发生反应；（4）氧化：加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。
Q2.引物合成如何处理？切割与脱保护基：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。
常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。
断裂下来的寡核苷酸带有自由的3'羟基。
纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。
常用的纯化方法有：C1& OPC PAGE^ HPLC定量：根据寡核苷酸在260n m处的紫外吸收来定量。
储存：分装抽干。
Q3.合成的引物5'端是否有磷酸化？合成的引物5'为羟基，没有磷酸基团。
如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5'端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5'或3'端进行磷酸化，需要另外收费。
Q4.需要什么级别的引物？Q5.需要合成多少0D数？根据实验目的确定。
一般PCR扩增，2 0D引物，可以做500-1000次50ul标准PCR反应。
如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。
Q6.如何计算引物的浓度？引物保存在高浓度的状况下比较稳定。
一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成100pmol/ul，称为保存浓度，而引物的工作浓度一般配制成10-50pmol/ul。
加水的体积（微升）可直接参照合成报告单上推荐的体积，也可按下列方式计算：V （微升）=OD数x 33 x 10000 / 引物的分子量引物的分子量可以从合成报告单上获得。
DNA重组实验常见问题分析
DNA重组实验常见问题分析•DNA重组实验常见问题分析载体用NotI单酶切，目的片段也用NotI单酶切，并对载体进行去磷酸化，但一直也没连上？参考见解：1、用NEB的高效连接酶连看看，用400U或2000U的试试2、 16度过夜连接，或更长3、单酶切用PCR来鉴定方向方便些4、去磷酸化后，将去磷酸化酶失活很重要，否则可能根本连不上。
5、失活的方法很多了，可以加热（有的热敏感酶可以），可以直接过胶回收柱子，但比较放心的方法就是跑胶回收。
PCR扩增到特异性产物后，回收PCR产物，PCR产物用BamHI 和EcoRI（NEB公司的酶）在随EcoRI的BUFFER中双酶切8小时，同时，p UC18 同样酶切，连接片段和载体DNA酶切均用QIAGEN quick spin column回收片段，按NEB 连接酶说明过夜连接，连接产物电转化。
但是，看转化结果，连接产物转化的平板大部分是蓝斑？什么原因？参考见解:1、柱子回收一般没有问题，但会不会存在操作问题，所以回收产物可以跑胶或用紫外分光系统检测一下有没有DNA。
2、PCR产物直接酶切，在设计引物的时候有没有在酶切位点两边加保护碱基？这里pcr产物酶切出问题的可能性很大。
3、酶有没有问题？可以用这两个酶切一些已知的质粒看看能不能得到所要的片断。
4、大部分是蓝斑说明可能是载体酶切不完全，也可能是没有在载体酶切后跑胶回收载体，这样不能完全除去酶切掉的小片断（Qiagen的柱子对小片断的回收比较好），后来连接反应中小片断可能又连上了。
5、大部分是蓝斑，那就是还有白色的。
挑了白色的摇了提质粒看看啊，说不定就有阳性的。
6、建议在载体酶切后用碱性磷酸酶进行去磷酸化，这样可以彻底防止载体的自身环化。
酶切目的基因及质粒载体后加Loading buffer终止反应,然后要直接进行连接反应,可以吗?要是不行,还有一种方法就是加热灭活限制酶(用的是Hind3/EcoR1双酶切),多高温度适合啊?参考见解：1、一般直接用2倍体积的无水乙醇沉淀目的片段，干燥后直接用水溶解连接即可。
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DNA合成常见问题解答
1.DNA合成粗产物中含有什么杂质
DNA合成仪合成的粗产物经过浓氨水氨解以后，其中除了含有所需的目的DNA片段(n)以外，还含有合成反应过程中产生的目的片段短的失败片段(n-1,n-2,…)以及脱保护基团产生的铵盐。
需要通过纯化去除短片段、通过脱盐去除盐分。
2.如何进行合成产物的纯化
目前公认和大多采用的DNA粗产物后处理方式有4种：
A) C18柱脱盐，这是一种活性炭柱子，有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。
但是它不能有效去除比目的片段短的小片段。
实际上，它是一种脱盐的作用。
这种方法处理的产物中虽然含有比目的片段少5' 端一个或两个或多个碱基的产物，却一般不会对普通PCR反应产生影响。
但是对于需要用于测序、用于克隆的引物不能使用这个级别，以免后患无穷。
B) OPC柱纯化，OPC柱中装有对Dmt具有亲和力的树脂，合成DNA片段时保留5'
端最后一个碱基上的Dmt，所有合成产物吸附在OPC柱上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有Dmt 的片段吸附能力强，不易被洗脱，不带有Dmt的片段吸附能力弱，
被洗脱。
然后用三氟乙酸TFA或三氯乙酸TCA脱去Dmt基团，再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA这种方法的优点是快速，简易。
但是其专一性吸附Dmt能力有限，
不免仍然有短片段带入的可能，而且负载量小。
特别是对长于25 碱基以上的片段纯化效果不好。
C) HPLC纯化，这是国外厂家常常使用的办法。
它是依据不同大小的片段带有的净
电荷多少来分离产物的。
合成粗产物中不同长度的DNA片段决定了它带有不同的
净电荷，较长的片段带有高电荷比带电荷低的短片段在离子交换柱中流动得慢。
先将粗产物检测主峰位置，再增加加样量，回收主峰位置的部分。
它的优点是自动化程度高、省人
力；缺点是纯化量小、不能纯化长片段（对于长于40 碱基的片段，无法纯化）。
D）PAGE屯化，几乎所有专业书籍上介绍的最佳纯化方法。
它是依据DNA片段在变
性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时的迁移率不同来分离大小片段的。
由于各分子所带电荷和大小不同，综合影响其在凝胶中的迁移速度，大片段迁移得慢，经过一定时
间的电泳，大小片段会分幵，然后停止电泳，剥离凝胶，置于荧光TLC板上在紫
外灯下切割目的条带，浸泡碎胶，并从泡胶的盐溶液中回收目的DNA优点是纯化效果很好、尤其是纯化长链效果更好、而且是可以直观看见DNA片段合成情况的
质控环节。
通常认为的缺点是实验室水平的PAGE屯化实验步骤多费人工、电泳及
后处理过程样品损失量大、电泳装置局限或电泳时间如果不够会影响纯化效果。
但这些缺点完全可以克服。
我们通过扩大规模流水作业使实验过程便于掌握和节省人力；在粗样品中加入尿素饱和液增加样品比重减少电泳上样的损失；改用C18 柱回收产物，使得回收效率大大提高；通过特制电泳装置，增加凝胶厚度和长度
来增加负载量和分离效果等等。
所以我们一直使用PAGE屯化方式保证合成产物的纯度。
为了保障您的后续实验，请您选用PAGE屯化的产品，特别是现在DNA合成不同纯
化方式的价格相差不多的情况下。
3.如何测定引物的0D值
用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的光密度来定量。
请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的光密度最好稀释到之间。
DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml 并在1ml 标准比色杯中测定其光密度，即为所测体积的0D值，进而可以计算出母液的0□值举例：您拿到一管干粉的DNA用1ml水溶解成母液，取该母液50微升稀释成1ml
并在1ml标准比色杯中测定的光密度为，说明该50微升中含有的DNA也即说明
原来1ml母液中含有5OD的DNA
4．如何检测引物的纯度
实验室方便的作法是用PAGE方法。
使用加有7M尿素的16%勺聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。
取的
引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95oC,2mins) 。
加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。
600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。
(有时由于变性不充分，主带之上可能会有条带，乃是引物二级结构条带。
)
5．怎样按照使用浓度溶解引物
记住几个参数：
10D引物干粉约为33微克；
碱基的平均分子量为；
引物的分子量=碱基数x 碱基的平均分子量；
引物的摩尔数=质量数/ 引物分子量
举例：如果您拿到一管标明为2OD的20碱基的引物，
分子量=20 x =6490 质量数=2 x 33 =66 口g
摩尔数=66 / 6490 = 口mol二 10 nmol
若您需要溶解为10卩M(=10pmol/卩I)的溶液，只需加1mlddH2O充分溶解即可。
同时请您注意：真空干燥的DNA呈干膜状或粉末状在离心管底部，幵启瓶盖时小心不要丢失；请加入足量的
水充分振荡溶解。
6．如何保存引物
我们提供的干粉DNA从有机溶剂中干燥出来，无菌，无核酸酶。
可以室温或-20oC 密闭长期保存；溶解以后的DNA最好保存在-20oC,溶解引物的水的PH要求大于7,并且无菌。
带
有荧光标记的引物请注意避光保存。
7．已经溶解的引物,为什么原先使用正常,而过一段时间再使用就不好了
如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。
我们发现不少实验室用的双蒸水PH<6请您也查查。
使用时没有充分解冻振荡混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。
8．为什么公司可以提供较多产物
与所有化学制备反应一样，最终产物的多少取决于起始反应物的量以及合成效率。
我们使用的仪器和生产规程使我们可以调整合成的起始量，而且合成的高效率使我们可以得到较多粗产物。
我们的改良的PAGE屯化与C18柱回收结合的方法使得我们得到的最终产物能够满足您的要求。
9.为什么说用EB染色合成DNA片段来定量是不正确的
通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA),是因为EB可以嵌合到双链DNA中。
而合成的单链DNA由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会不同，比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB根本无法染色。
所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。
同样道理，用EB染色来照片不适合所有引物。
10.PCR扩增没有成功，怀疑是引物不好，怎么办
PCF T增不成功的因素很多，需要您耐心地分析，最好在实验时设置对照来判定原因。
如果您怀疑引物的问题，请您首先测定您溶解的引物的OD值，看实验时加入的引
物量是否正确。
如果量是正常的，请您告诉博亚公司您的引物编号，我们会复查
留存样品。
如不明原因，我们免费为您重新合成一次。
如果仍然不能扩增，请您查找其它原因。
也可以将引物和模板寄给我们帮助您进行PCR。
11．引物不纯会造成什么后果
引物不纯可能会导致：1)非特异性扩增；2)无法用预先设计在引物5' 端酶切位点的酶切开，特别是没有保护碱基的引物；3) 用于测序出现双峰或乱峰。
12.普通合成的DNA片段5'末端是磷酸基团吗
普通合成的DNA片段5'末端与3'末端都是羟基，可直接用于PCR如果需要您可以用多核苷酸激
酶进行5' 端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5' 或3' 端进行磷酸化，需要另外收费( 参见价
目表)。
13.PCR产物经过克隆以后测序发现引物区与合成序列不相符合，怎么办
我们认为这多数是PCR过程和克隆过程中引入的错误。
遇到这种情况，请您：
1) 可以要求我们重新免费合成引物。
2) 重新挑取克隆测序，会有找到正确克隆的可能；
3) 要求我们免费为您做点突变予以改正。
14.公司可以合成多长的序列
由于用户和基因拼接的要求，我们很好地合成过不少100 碱基左右长度的长片段。
因为我们可以提高起始合成数量、加大合成用的试剂量、用PAGE屯化。
如果您的
实验需要，我们愿意接受110 碱基以下的订单。
15.我订购了两条可以退火的引物，您可以帮助退火吗
可以。
您也可以自己退火。
用退火缓冲液(10mMTris, pH - , 50mMNaCl, 1mMEDTA) 溶解引物, 将要退火的引物等摩尔数混合，总体积不要超过500微升，加热到95oC 2mins,然后缓慢
冷却至室温(低于30oC)即可。
退火的产物可以放在4oC待用。
16.公司帮助设计引物吗我们可以帮助您设计引物，需要您按照要求提供具体资料。
但是由于您
提供资料的准确信以及我们水平的限制，我们不能保证每一个设计的引物一定工作。
我们
不承担设计引物失败的责任。
您如果信任我们，我们愿意帮助设计。
17.各种标记的荧光染料的名称、吸收波长和发射波长、可见光中颜色是怎样的。